streszczenie plik pdf

Uniwersytet Warmińsko – Mazurski w Olsztynie
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
lek. wet. Marek Wincenciak
Rozprawa na stopień doktora nauk weterynaryjnych pod tytułem:
„Aktywność egzoglikozydaz lizosomalnych w surowicy krwi świń podczas transportu”
Streszczenie
Egzoglikozydazy lizosomalne: N-acetylo-ß-heksozoaminidaza (HEX), ß-galaktozydaza
(GAL), α-fukozydaza (FUC), α-mannozydaza (MAN), i ß-glukuronidaza (GLU) należą do
enzymów hydrolizujących glikokoniugaty (glikoproteiny, glikolipidy i proteoglikany)
podczas degradacji tkanek. Działają one na zewnętrzną część łańcucha oligosacharydowego
odszczepiając monosacharydy. Obecność egzoglikozydaz wykazano w licznych tkankach,
oraz płynach ustrojowych. Aktywność egzoglikozydaz odzwierciedla intensywność
przebudowy tkanek.
Transport zwierząt wiąże się z udziałem stresorów (hałasu, obcych osobników, bodźców
mechanicznych, nadmiernego zagęszczenia, nowego otoczenia, ruch pojazdu, zwiększonej
wilgotności, temperatury) prowadzących do nadmiernego pobudzenia organizmu zwierzęcia
(wzrostu ciepłoty ciała, przyspieszenia oddechu, akcji serca, przyspieszenia metabolizmu)
określanego, jako stres, co z kolei może wpływać na aktywność egzoglikozydaz
lizosomalnych.
Hemoliza jest jedną z najczęstszych przyczyn odrzucenia przez laboratorium surowicy
krwi lub osocza przeznaczonych do analizy. Stanowi poważny problem diagnostyczny.
Uwolnienie wewnątrzkomórkowych komponentów z krwinek czerwonych oraz innych
elementów morfotycznych krwi do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, fałszywie zawyża
wyniki badań, dyskwalifikuje surowicę krwi i osocze jako materiał badany, głównie do badań
biochemicznych, w tym oznaczania aktywności enzymów w tym egzoglikozydaz
lizosomalnych.
Celem pracy była ocena aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w surowicy krwi świń
rasy Wielka Biała Polska poddanych stresowi wynikającemu z transportu, co pozwoliło na
dokonanie: 1) oceny zmian w aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych, 2) oceny
katabolizmu glikokoniugatów na skutek stresu u świń, 3) kontroli jakości prowadzonych
badań na podstawie obliczeń: AUC, czułości oraz swoistości testu, 4) oceny metody
oznaczenia aktywności N-acetylo-β-D-heksozoaminidazy w zhemolizowanej surowicy.
Badanie przeprowadzono w surowicy krwi 40 świń (23 samic i 17 samców) rasy Wielka
Biała Polska w wieku od 5,5 do 7 miesięcy, ważących od 87 do 100 kg. Świnie pochodziły z
jednego stada. Krew pobierano dwukrotnie przed i po transporcie.
Aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych oznaczano w surowicy pozbawionej hemolizy
metodą kolorymetryczną, zaadaptowaną do oznaczeń na mikropłytkach. Ilość uwolnionego pnitrofenolu z substratu mierzono przy długości fali λ = 405 nm, za pomocą czytnika
mikrpopłytek Elx 800TM i programu komputerowego KC junior. W surowicy krwi z hemolizą
aktywność HEX oznaczano po dodawaniu odpowiedniego buforu oraz substratu i inkubacji w
temperaturze 370C przez 60 minut, a następnie strąceniu uwolnionej z erytrocytów
hemoglobiny nasyconym roztworem kwasu trójchlorooctowego (TCA) i odwirowaniu (5
minut; 900 obr/min). Stężenie aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych wyrażano w
pKat/mL.
Uzyskane wyniki wskazują na obecność w surowicy krwi istotnie niższego, w porównaniu do
świń niezestresowanych, stężenia aktywności FUC (p=0,000000) i GAL (p=0,001040) oraz
wyższego stężenia aktywności GLU (p=0,037832) w surowicy krwi świń po transporcie, w
porównaniu do aktywności w/w enzymów w surowicy krwi świń pobranej przed transportem.
Stwierdzono ponadto brak istotnej zmiany stężenia aktywności HEX i MAN w surowicy krwi
świń pobranej przed i po transporcie.
Badania pokazują, że największą wartość diagnostyczną ma oznaczenie aktywności GAL,
FUC i GLU w surowicy krwi świń poddanych stresowi transportowemu. Wykazano 75%
swoistość i 80% czułość testu w badaniu stężenia aktywności FUC w surowicy krwi świń po
transporcie w porównaniu do aktywności FUC przed transportem. Ponadto 85% swoistość i
63% czułość testu stwierdzono dla stężenia aktywności GAL w surowicy krwi świń po
transporcie w porównaniu do aktywności GAL przed transportem. Najniższą 45% swoistość
oraz 85% czułość wykazywał test dla stężenia aktywności GLU w surowicy krwi świń po
transporcie w porównaniu do stężenia aktywności GLU przed transportem.
Z przeprowadzonych badań wynika, że średnie stężenia aktywności HEX w surowicy krwi
świń bez hemolizy były podobne do wartości średnich stężenia aktywności HEX w
zhemolizowanej surowicy krwi świń z wykorzystaniem TCA przed i po transporcie.
Na podstawie przeprowadzonych badań sformułowane zostały następujące wnioski:
1. Stres związany z transportem zmienia katabolizm glikokoniugatów u świń.
2. Zaproponowana metoda oznaczania HEX (i prawdopodobnie innych enzymów
uwalniających p-nitrofenol) z użyciem TCA w zhemolizowanej surowicy świńskiej nadaje
się do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej.
3. Stężenia aktywności β-galaktozydazy, α-fukozydazy i β-glukuronidazy w surowicy krwi
mogą pozwolić na rozróżnienie świń zestresowanych od świń niezestresowanych.
4. Stężenia aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w surowicy krwi mogą mieć
zastosowanie w przedubojowej diagnostyce weterynaryjnej.