VEGF

Wykład II
Wektory plazmidowe
Terapia genowa
Gene therapy
wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków
Wektor
vector
Cząsteczka kwasu nukleinowego, służąca do przenoszenia obcego
DNA (transgenu)
Wektory
Plazmidowe
„nagi” DNA
Kompleksy
ze związkami
kationowymi
Wirusowe
RNA
Retrowirusy
(w tym lentiwirusy)
Kompleksy
z białkami osłonek
Wirusowych
DNA
Adenowirusy
AAV
Wirus Herpes
Nośnik (vehicle)
Jon lub związek chemiczny, obdarzony ładunkiem dodatnim, umożliwiający
zneutralizowanie ładunku ujemnego kwasu nukleinowego i jego wniknięcie
do komórki
- jony Ca2+
- dekstran
- liposomy kationowe
- polipeptydy
- dendrymery
Inne użyteczne terminy
Tranformacja bakterii
Modyfikacja fenotypu bakterii poprzez wprowadzanie genów za pomocą
plazmidowego DNA
Transfekcja
Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów niewirusowych
Transdukcja
Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów wirusowych
Klonowanie molekularne
Uzyskiwanie wielu identycznych kopii genów, np. przez powielanie plazmidowego DNA w
bakteriach
Terapia genowa
Wzmacniająca
Substytucyjna
wzmocnienie
ekspresji genów
wprowadzenie
brakującego genu
Nowotwory
Choroby układu krążenia
Hamująca
hamowanie ekspresji
genów(np. za pomocą
oligonukleotydów
antysensowych)
Nowotwory
Choroby układu krążenia
Choroby dziedziczne
(wrodzone błędy metaboliczne,
mukowiscydoza,
dystrofia mięśniowa )
Terapeutyczne kwasy nukleinowe
DNA
Geny
(Wektory DNA)
RNA
Sekwencje niekodujące
Oligonukleotydy
Antysensowe
Geny
(wektory RNA)
Pułapki
oligonukleotydwe
Sekwencje
niekodujące
rybozymy
siRNA
Rodzaje terapii genowej
- somatyczna
- komórek linii płciowej
Ekspresja genów w komórkach eukariotycznych wymaga
zastosowania odpowiedniego promotora w wektorze plazmidowym
1. Promotor wirusowy
2. Promotor eukariotyczny
- konstytutywne
- indukowane
3. Złożone
Geny reporterowe
Gen używany do badania skuteczności transfekcji. Gen reporterowy
powinien być łatwy do wykrycia i nie powinien to być gen naturalnie
obecny w transfekowanych komórkach.
Geny reporterowe
CAT (acetylotransferaza
Chloramfenikolu)
Lucyferaza
β-galaktozydaza
Zielone białko fluorescencyjne (GFP)
Wydzielnicza fosfataza alkaliczna (SEAP)
Ludzki hormon wzrostu
β-glukuronidaza
Wykrywanie ekspresji genów reporterowych
-testy autoradiograficzne
- testy kolorymetryczne
- emisja fluorescencji
- emisja chemilumienscencji
-Wykrywanie białka: testy ELISA
Tabela. Geny reporterowe
Gen
Testy in vitro
Zalety
CAT
(acetylotransferaza
chloramfenikolu)
Chromatografia,
Fluorescencja,
immunoassay
Lucyferaza
a) świetlika
Photinus
pyralis
b) żebropława
– Renilla
reniformis
(sea pansy)
β-galaktozydaza
Bioluminescencja
Praco- i
Minimalna aktywność
endogenna w komórkach czasochłonne
Brak testów in
ssaków
vivo; białko ma
okres
półtrwania 50
godzin
Nieizotopowe,
Krótki okres
Wysoka czułośc, niska
półtrwania
niepecyficzna aktywność białka,
Assay in vivo
Kosztowny
sprzęt
Wydzielnicza
fosfataza alkalicza
(SEAP)
Zielone białko
fluorescencyjne
(GFP)
Ludzki hormon
wzrostu (HGH)
B-glukuronidaza
(GUS)
o
Kolorymetryczna
Fluroymetryczna
chemilumienscencyjna
Nieizotopowa,
Liczne testy, stosowana
jako kontrola do
mormalizacji tranefkcji
innych genów
Assay in vivo
Chemiluminescencyjna, Nieizotopowa ,
Kolorymetryczna
Białko wydzielnicze
Bardzo czuła, możliwośc
analizy wielu próbek
Fluorescencja
Pozwala na badanie
ekspresji w żywych
komórkach,
fluorescencja jest cechą
białka – nie są potrzebne
żadne dodatkowe
substraty
Radioimunnoassay
Białko wydzielnicze,
bezpośrednie
wykrywanie białka,
prosty test
Kolorymetryczna
Test in vivo
Fluorescencyjna
Nieizotopowa, stabilne
Chemiluminescencyjna białko, bardzo wysoka
czułość testu
chemiluminescencyjnego
Wady
Wysoka
endogenna
ekresja Bgalaktozydaza
w wielu typach
komórek
Brak testów in
vivo
Czułość może
być zbyt mała,
ale znane sa
mutanty
Test
radioaktywny,
stosunkowo
niska czułość,
kosztowny
Najczulsze
testy wymagają
sprzętu
Zastosowanie
CAT
¾ katalizuje transfer grup acetylowych z acetylo koenzymu A na
chloramfenikol
¾ Enzym prokariotyczny
¾ Bialko jest bardzo stabilne (okres półtrwania 50 godzin)
Wykrywanie:
¾ Test radioaktywny
¾ Rozdział form acetylowanych od nieacetylowanych
za pomocą chromatografii cienkowarstwowej
¾ Możliwa ekstrakcja dla oceny ilościowej
¾ Dostępne także testy nieizotopowe: ELISA
Geny reporterowe - β-galaktozydaza
-hydroliza β-galaktozydów, najczęściej X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galaktozyd
--może być używana (mierzona) w tym samych ekstraktach co lucyferaza i CAT
-testy kolorymetryczne: ONPG (o-nitrofenyl-B-D-galaktopiranozyd
fluorymetryczne: MUG – 4-methylumbelliferyl-b-D-galaktozyd
chemiluminescencyjne – 1,2-dioeksyetan
Możliwy test przyżyciowy – substrat di-B-D-galaktopyranozyd –
rozkładany przez β-galaktozydazę, produkt wykrywany przez
fluorescencję
Lucyferaza
-świetlika Photinus pyralis i żebropława Renilla reniformis
-Reakcja bioluminescencyjna wymaga substratu – lucyferyny – ATP,
-Jonów magnezu i tlenu.
-Emisja światła – szybko wygasa
-Lucyferaza ma krótki okres półtrwania – około 3 godzin
-- wysoka czułośc
Lucyferaza żebropława – jako substratu używa celenterazyny
Zielone białko fluorescencyjne
-z Aequorea victoria: ekworyna emituje niebieskie światło po związaniu
jonów wapnia. Światło to absorbuje białko GFP, emitując równocześnie światło
zielone
Ekspresja GFP w innych organizamach powoduje zieloną fluorescencję po pobudzeniu
światłem niebieskim lub UV
Transfekcja przejściowa i stabilna
Transfekcja plazmidem zawierającym gen selekcyjny, np. gen oporności na
neomycynę. Po transfekcji komórki są hodowane w pożywce zawierającej
neomycynę (lub jej analog, jak G418). Komórki, które nie zostały stransfekowane
plazmidem z genem NeoR, nie produkują enzymu rozkładającego G418 i giną. Przeżywają
tylko komórki stabilnie stransfekowane plazmidem z genem selekcyjnym.
Selekcja komórek stabilnie transfekowanych
1. Geny oporności
a) na antybiotyki aminoglikozydowe – transferaza neomycyny
b) hygromycynę – fosfotransferaza hygromycyny B
c) puromycynę
d) zeocynę (bleomycyna).
Antybiotyki selekcyjne
Antybiotyk
Gen oporności
Mechanizm
Stężenie
działania
Genetycyna (G418)
APH(3’) I , APH(3’)II
Hygromycyna B
Hph
Puromycyna
Zeocyna
Fleomycyna
Blasticydyna S
Pac
Sh ble
Sh ble
Bcs, BCD
Blokuje translację w
komórkach
eukariotycznych,
interefrując z
podjednostką rybosomu
80S
Wpływ na translokację,
zaburzenia
wbudowywania
aminokwasów
Hamuje translację
Wiąże się z DNA
Wiąże się z DNA
Hamuje translację
50 – 1000 µg/ml
50-1000 µg/ml
1-10 µg/ml
0,5-1000 µg/ml
0,1-50 µg/ml
3-50 µg/ml
Sposoby transfekcji plazmidowego DNA
„nagi DNA” (metody fizyczne)
iniekcja
elektroporacja
Biolistyczna
(strzelba genowa)
mikroiniekcja
makroiniekcja
mała objętość
Duża objętość
(metoda hydrodynamiczna)
nośniki chemiczne
Elektroporacja
1. Siła przyłożonego pola elektrycznego
- w większości komórek ssaczych maksymalna wydajność transfekcji
jest uzyskiwana kiedy napięcie wynosi od 250V/cm do 750 V/cm
Przeżywa około 20-50% komórek
2. Czas trwania impulsu elektrycznego
- 20-100 msec
3. Temperatura
0OC lub pokojowa
4. Skład jonowy środowiska
Wydajność jest wielokrotnie wyższa gdy komórki są zawieszane w
buforowanych roztworach soli (np.. HEPES) niż w roztworach substancji
niejonowych takich jak manitol czy sacharoza
Makroiniekcja
Wstrzyknięcie nagiego DNA do mięśnia szkieletowego ekspresja β-galaktozydazy
Transfekcja nagiego DNA
1. Rodzaje komórek
2. Maksimum ekspresji – po 14 dniach w mięśniach
3. Utrzymywanie DNA we włóknach mięśniowych – większość
w postaci kolistej; ekspresja nawet do 2 lat
4. Regeneracja mięśni umożliwia większą ekspresję
5. Promotory – wirusowe lepsze niż tkankowo specyficzne
6. Zależność wydajności transfekcji od wielkości zwierzęcia
Nagi DNA – zastosowania
1.
2.
3.
4.
Terapia dystrofii mięśniowej Duchenna; myszy mdx
Transfer genów białek wydzielniczych, np.. VEGF
Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych
Szczepionki genowe
VEGF - a major angiogenic growth factor
• VEGF stimulates the formation of new blood vessels, acting as a
mitogen for endothelial cells.
• Insuffcient vascularization leads to heart or peripheral muscle
ischemia and is an inherent feature of cardiovascular diseases.
•Gene therapy with VEGF has been considered as a way to
stimulate angiogenesis and ameliorate the effect of ischemia
•It has been also assumed that gene delivery with relatively weak
plasmid vectors will be more safe, producing small amounts of
therapeutically effective VEGF, but will not exert the side effects,
which may be expected with strong vectors
Uzyskanie plazmidowych wektorów ekspresyjnych z genem
czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF)
1.
2.
3.
Uzyskanie plazmidów (nie-ekspresyjnych) z cDNA izoform ludzkiego genu VEGF165 oraz VEGF121
Uzyskanie dużych ilości plazmidu pGEM-VEGF. Wycięcie cDNA za pomocą enzymu BamH1
Przecięcie za pomocą enzymu BamHI plazmidu pSG5 (Stratagene) (plazmid posiada gen oporności na
ampicilinę).
4. Wklonowanie sekwencji cDNA VEGF do plazmidu VEGF.
5. Transformacja bakterii kompetentnych plazmidem („mieszaniną ligacyjną”)
6. Selekcja bakterii na agarze zawierającym amipicilinę
7. Namnożenie w bulionie pojedynczych klonów bakterii wyrosłych na agarze
8. Izolacja plazmidowego DNA
9. Sprawdzenie plazmidowego DNA za pomocą trawienia enzymem retsrykcyjnym BamHI
10. Transfekcja uzyskanych plazmidów pSG5VEGF165 oraz pSG5VEGF121 do komórek mięśni gładkich
szczura przy pomocy liposomów.
11. Zbadanie produkcji VEGF: test ELISA, barwienie immunohistochemiczne
12. Doświadczenia na zwierzętach.
VEGF gene transfer in vitro
• pSG5VEGF165 plasmid (contains human VEGF165 cDNA driven by weak viral SV40
promoter)
• transfection in vitro to rat VSMC results in generation of large amounts of human VEGF
despite low transfection efficiency, typical for these cells; released VEGF is biologicaly
active and enhances proliferation of endothelial cells
human VEGF
ng/ml medium
VEGF production by transfected cells
β-gal
expression
3
2
1
0
Control
βgal
VEGF
48 h
VEGF
72 h
Jozkowicz et al., Clin Chim Acta, 1999: 288:1-19
Dulak et al, Vasc Med, 2000;5:33-40
VEGF
expression
Injection of naked human VEGF DNA into rabbit ischemic
skeletal muscle results in expression of human transgene
and protein release
Human VEGF protein in the
blood of transfected rabbits
10
pSG5VEGF165
rabbit VEGF165
VEGF pg/ml
8
rabbit VEGF121
6
human VEGF165
4
RT-PCR - adductor muscle
2
0
β-gal
pSG5VEGF165
Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
Naked VEGF gene transfer increases the number of microvessels
in the ischemic rabbit skeletal muscles
alkaline phosphatase-positive
microvessels in muscle
transfected with control plasmid
microvessels in muscle
transfected with
VEGF plasmid
Vessels/mm2
300
p<0.01
200
100
0
β−gal
transfected
VEGF
transfected
Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
Jony Ca2+
DEAE-dekstran
Lipidy
i lipsomy
Związki wielkocząsteczkowe
Polipeptydy
Polimery
dendrymery