Wielonienasycone kwasy tłuszczowe potęgują cytotoksyczność

&ARM0RZEGL.AUK †
7IELONIENASYCONEKWASYTŒUSZCZOWEPOTÃGUJ’CYTOTOKSYCZNOu¿
CISPLATYNYWNIEKTÌRYCHLINIACHKOMÌRKOWYCHGLEJAKA
0OLYUNSATURATEDFATTYACIDSPOTENTATECYTOTOXICITYOFCISPLATIN
INSOMELINESOFGLIOMACELLS
!LICJA:AJDEL!DAM7ILCZOK-AŒGORZATA,ATOCHA:OFIA$ZIER˜EWICZ
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
:AKŒAD"IOLOGII+OMÌRKI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych wielonienasycone kwasy tłuszczowe (WNKT)
pełnią funkcję wewnątrzkomórkowych, drugorzędowych
przekaźników sygnału w procesach proliferacji oraz
śmierci komórki. WNKT wykazują selektywne działanie
przeciwnowotworowe i mogą wpływać na wrażliwość komórek nowotworowych na naświetlanie i chemioterapię.
Komórki nowotworowe często wykazują pierwotną lub
nabytą oporność na cisplatynę (CPT), powszechnie stosowany cytostatyk.
Celem pracy było zbadanie zdolności egzogennych kwasów
tłuszczowych: linolowego (LA, 18:2 n-6), α-linolenowego
(ALA, 18:3 n-3), arachidonowego (AA, 20:4 n-6), eikozapentaenowego (EPA, 20:5 n-3) i dokozaheksaenowego
(DHA, 20:6 n-3) do zwiększenia wrażliwości ludzkich
komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 i glejaków
8-MG-BA oraz 42-MG-BA na CPT.
Spośród badanych WNKT w testowanym zakresie stężeń,
tylko EPA (100 μM) oraz DHA (100 μM) zmniejszały przeżywalność komórek glejaków linii 8-MG-BA i 42-MG-BA.
Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 nie wykazały
wrażliwości na WNKT. AA, EPA i w szczególności DHA,
w wyższych stężeniach, zwiększały cytotoksyczność CPT
wobec wszystkich testowanych linii glejaków.
Zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej CPT
w obecności AA, EPA lub DHA wskazuje na korzystne
efekty suplementacji WNKT podczas terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem CPT mogące poprawić
skuteczność leczenia.
In normal and tumour cells, polyunsaturated fatty acids
(PUFAs) act as intracellular second messengers, which
play a role in signalling, proliferation and cell death. PUFAs have selective tumouricidal action and may alter sensitivity of tumour cells to radiation and chemotherapy. Tumour cells are often characterised by primary or acquired
resistance to cisplatin (CPT), a commonly used anticancer
agent.
This led us to investigate of the ability of exogenous linoleic acid (LA, 18:2 n-6), α-linolenic acid (ALA, 18:3
n-3), arachidonic acid (AA, 20:4 n-6), eicosapentaenoic
acid (EPA, 20:5 n-3), and docosahexaenoic acid (DHA,
22:6 n-3) to modulate sensitivity of human glioblastoma
(SNB-19), and human gliomas (8-MG-BA, 42-MG-BA)
to CPT.
Among the PUFAs, tested in the wide concentration range,
only EPA (100 μM) and DHA (100 μM) inhibited viability of 8-MG-BA and 42-MG-BA glioma cells. SNB-19
glioblastoma cells remained resistant to PUFAs. At higher
concentrations, AA, EPA and, in particular DHA, added
to the culture medium, increased CPT cytotoxicity in the
tested glioma cells.
The observed increase of CPT cytotoxicity in the presence
of AA, EPA or DHA indicates plausible beneficiary effect
of PUFAs supplementation during anticancer therapy involving CPT, which may improve treatment.
Key words: cisplatin, polyunsaturated fatty acids, glioma
cells
Słowa kluczowe: cisplatyna, wielonienasycone kwasy
tłuszczowe, komórki glejaków
Wstęp
Cisplatyna (cis-diaminodichloroplatyna II; CPT) jest
charakteryzującym się dużą skutecznością, powszechnie
stosowanym lekiem w terapii wielu nowotworów, chociaż
jej użycie jest często ograniczone z powodu efektów nie-
pożądanych takich jak nefrotoksyczność, ototoksyczność,
czy neurotoksyczność. Ponadto, istotny problem kliniczny
stosowania CPT w terapii nowotworów stanowi pierwotna
lub nabyta podczas leczenia oporność komórek nowotworowych na działanie tego leku. Obniżona wrażliwość nowotworów na CPT wymaga stosowania zwiększonych dawek
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
leku, którym towarzyszy wzrost toksyczności względem
zdrowych tkanek, co może prowadzić do ciężkich powikłań
wielonarządowych. Wśród przyczyn oporności komórek
nowotworowych na CPT wymieniane są mechanizmy zapobiegające powstawaniu adduktów DNA-CPT przez zmniejszenie kumulacji CPT w komórce wskutek zmniejszonego
wnikania leku do komórki, nasilonych procesów detoksykacyjnych powodujących zwiększone usuwanie leku z komórki oraz mechanizmy polegające na blokowaniu śmierci
komórki przez intensyfikację procesów naprawczych DNA
i wzrost tolerancji komórki na uszkodzony lub zmodyfikowany przez lek materiał genetyczny [1].
Obecnie poszukuje się skutecznych metod, które zapobiegałyby rozwojowi lekooporności lub ją znosiły. Jednym
ze sposobów znoszenia oporności komórek nowotworowych
jest użycie chemiouczulaczy lub modulatorów oporności
wielolekowej. Interesującym zagadnieniem jest wykorzystanie suplementów diety w celu zwiększenia efektywności
terapii przeciwnowotworowej przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności względem tkanek prawidłowych.
Powszechnie znany jest pogląd, że długołańcuchowe,
wielonienasycone kwasy tłuszczowe (WNKT) takie jak
eikozapentaenowy (EPA, 20:5 n-3), czy dokozaheksaenowy
(DHA, 20:6 n-3), nie tylko wykazują selektywne działanie
cytotoksyczne względem komórek nowotworowych, ale
także mogą zwiększać ich wrażliwość zarówno na chemioterapię, jak i radioterapię. Jednakże, zaledwie kilka prac
traktuje o wpływie WNKT na skuteczność leczenia CPT
[2-4]. W zależności od pozycji pierwszego podwójnego wiązania WNKT zostały podzielone na dwie rodziny n-6 oraz
n-3. Prekursorami rodzin kwasów n-6 i n-3 są odpowiednio
kwasy linolowy (LA, 18:2 n-6) i α-linolenowy (ALA, 18:3
n-3). Z powodu braku odpowiednich desaturaz w tkankach
zwierzęcych, nie zachodzi synteza LA i ALA, a ponieważ
muszą być one dostarczone w diecie określane są mianem
niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych. Z LA
w procesie desaturacji katalizowanym przez ∆6-desaturazę
powstaje kwas γ-linolenowy (GLA, 18:3 n-6), który jest wydłużany do kwasu dihomo-γ-linolenowego (DGLA, 20:3,
n-6), a ten jest konwertowany przez ∆5-desaturazę do kwasu
arachidonowego (AA, 20:4 n-6). Te same enzymy uczestniczą w przekształceniu ALA do EPA, z którego powstaje
DHA. Kwasy tłuszczowe z rodzin n-6 i n-3 konkurują o te
same enzymy uczestniczące w syntezie metabolitów LA
i ALA. Dlatego dieta zawierająca znaczne ilości LA powoduje zmniejszenie syntezy EPA i DHA z ALA i nasilenie
powstawania AA. Odwrotnie, dieta bogata w ALA sprzyja
syntezie EPA i DHA, a osłabia tworzenie się AA. Różnice
w strukturze WNKT mają kluczowe znaczenie w determinowaniu ich właściwości biologicznych. Jednakże, do tej
pory pozostają niewyjaśnione zależności pomiędzy strukturą WNKT, a ich przydatnością w prewencji i terapii nowotworów [2, 4-7].
Celem przedstawionej pracy było zbadanie zdolności
egzogennych kwasów tłuszczowych rodziny n-3: ALA, EPA
i DHA oraz rodziny n-6: LA i AA do modulowania wrażliwości na CPT ludzkich komórek glejaków. Wybrane do eksperymentów komórki glejaka wielopostaciowego (SNB-19)
oraz ludzkich glejaków (8-MG-BA, 42-MG-BA) charakteryzuje różna wrażliwość na WNKT.
Materiał i metody
Hodowle komórkowe
Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkich linii nowotworowych: glejaka wielopostaciowego
SNB-19, glejaków 8-MG-BA oraz 42-MG-BA pochodzące
z kolekcji German Collection of Microorganisms and Cell
Cultures (DSMZ). Komórki SNB-19 hodowano w mieszaninie DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma)
z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, PAA
The Cell Culture Company), 100 μg /ml streptomycyny, 100
U/ml penicyliny (Sigma). Dla komórek 8-MG-BA oraz 42MG-BA medium hodowlane stanowiła mieszanina MEM
(Modified Eagle’s Medium, Sigma) z dodatkiem 10% FBS
(PAA The Cell Culture Company), 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma). Hodowle komórkowe
prowadzono w warunkach porównywalnych do fizjologicznych, zgodnie z wymogami hodowli in vitro, czyli w stałej
temperaturze (35˚C) i wilgotności powietrza (95%) oraz atmosferze wzbogaconej 5% CO2.
Warunki ekspozycji komórek
Przed wykonaniem eksperymentów sporządzono 100
mM roztwory LA, ALA, AA, EPA i DHA (Sigma) w 99%
etanolu (Merck), które przechowywano w temperaturze
-20ºC w atmosferze azotu. Bezpośrednio przed każdym eksperymentem wyjściowe roztwory WNKT rozcieńczano za
pomocą odpowiedniej dla danej hodowli pożywki, tak, aby
otrzymać roztwory WNKT o stężeniach 25 μM; 50 μM; 100
μM oraz aby ilość dodawanego do każdej hodowli etanolu
była jednakowa. Zawartość etanolu w każdej z pożywek nie
przekraczała 0,1 %. Wcześniejsze eksperymenty pokazały,
że takie stężenie etanolu w pożywce nie wpływa na hodowane komórki.
Komórki hodowano na standardowych płytkach 96 dołkowych (5 x 103 komórek/dołek w 100 μl). Po 24 godzinach
od założenia hodowli, medium hodowlane było zastępowane
przez pożywki zawierające 0,1% etanolu (kontrola), WNKT
(25 μM, 50 μM, 100 μM), CPT (3,7 nM) lub CPT (3,7 nM)
i WNKT (25 μM, 50 μM, 100 μM). Wybór stężenia CPT
został poprzedzony testami cytotoksyczności.
Oznaczanie cytotoksyczności
Cytotoksyczność testowanych związków oceniano na
podstawie wyników testu WST-1 (Roche Diagnostics GmbH)
postępując zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Za pomocą tego testu analizowana była ilość żywych komórek poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej. Tylko żywe komórki wykazują zdolność do rozkładu
soli tetrazoliowej WST-1 (4,[3(4jodofenylo)-2(4-nitrofenylo)2H-5-tetrazolo]-1,3-benzenodisiarczan) do barwnego formazanu, którego stężenie koresponduje z ilością aktywnych metabolicznie komórek. Absorbancję wytworzonego w każdym
dołku formazanu mierzono przy długości fali 420 nm za pomocą czytnika płytek (UVM340, Biogenet). Przeżywalność
komórek wyrażano jako % względem hodowli kontrolnych.
Analiza statystyczna
Wyniki badań otrzymane z 3-5 niezależnych serii eksperymentów poddano weryfikacji statystycznej stosując
&ARM0RZEGL.AUK
Tab. I. Cytotoksyczność kwasu linolowego (LA), a-linolenowego (ALA), arachidonowego (AA), eikozapentaenowego
(EPA) i dokozaheksaenowego (DHA) w komórkach glejaka wielopostaciowego (SNB-19) i ludzkich glejaków (8-MG-BA,
42-MG-BA) wyrażona jako procent przeżywalności komórek eksponowanych na WNKT względem komórek kontrolnych
WNKT
LA
ALA
AA
EPA
DHA
Stężenie WNKT [MM]
25
50
100
25
50
100
25
50
100
25
50
100
25
50
100
SNB-19
100.1 ± 4.14
105.8 ± 0.77
102.6 ± 0.52
105.3 ± 2.25
100.1 ± 4.09
100.7 ± 5.12
106.5 ± 4.85
107.9 ± 0.15
108.2 ± 1.02
106.5 ± 1.13
104.8 ± 3.82
102.8 ± 1.73
101.4 ± 2.98
103.3 ± 0.79
99.68 ± 4.73
Przeżywalność komórek [% kontroli]
8-MG-BA
42-MG-BA
89.27 ± 3.89
98.94 ± 2.34
88.67 ± 4.16
92.70 ± 1.77
101.52 ± 39.74
90.14 ± 1.65
95.09 ± 5.81
100.85 ± 6.50
95.33 ± 1.35
99.65 ± 5.60
90.00 ± 1.90
95.05 ± 2.94
103.88 ± 2.53
106.38 ± 1.76
105.33 ± 2.27
102.91 ± 4.12
110.30 ± 1.94
106.49 ± 2.02
100.30 ± 4.68
106.81 ± 5.31
116.18 ± 16.31
90.92 ± 5.65
79.39 ± 4.66 a,c
56.52 ± 4.42 b,c
102.91 ± 6.62
94.36 ±4.85
89.48 ± 4.55
90.80 ± 23.80
22.73 ± 1.40 b,c
22.55 ± 2.88 b,c
a - istotna statystycznie różnica w porównaniu z kontrolą; P<0.03
b - istotna statystycznie różnica w porównaniu z kontrolą; P<0.0003
c - istotna statystycznie różnica w porównaniu do komórek traktowanych EPA i DHA; P<0.0003
średnią arytmetyczną, odchylenie standardowe (SD) oraz
jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA i test Tukey’a.
Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie
istotności p<0,03.
Wyniki badań
Wpływ WNKT na przeżywalność komórek
Na podstawie spektrofotometrycznego pomiaru ilości
barwnego produktu redukcji soli WST-1 obliczono przeżywalność komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19, glejaków 8-MG-BA oraz 42-MG-BA po ekspozycji na WNKT
w różnych stężeniach. W tabeli I zebrano wyniki przeżywalności komórek, którą wyrażono jako procent kontroli. Ekspozycja komórek 8-MG-BA oraz 42-MG-BA na LA, ALA
i AA w testowanych stężeniach nie spowodowała zmian
w ich przeżywalności. Obecność w medium hodowlanym
DHA lub EPA w stężeniu 100 μM wywoływała w odniesieniu do hodowli kontrolnych istotny spadek przeżywalności
komórek obydwu linii glejaków. EPA w stężeniu 100 μM
zmniejszał przeżywalność komórek 8-MG-BA o ok. 20%,
a komórek 42-MG-BA o ok. 43%. DHA wykazywał zdecydowanie większą toksyczność, w obydwu liniach glejaków przeżywalność wynosiła ok. 23%. Komórki glejaka
wielopostaciowego SNB-19 okazały się oporne na działanie
wszystkich WNKT w testowanym zakresie stężeń.
Wpływ WNKT na cytotoksyczność CPT
Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 oraz glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA charakteryzuje różna wrażliwość na CPT (Tab. II). Obecność tego leku w medium
hodowlanym w stężeniu 3,7 nM spowodowała zmniejszenie przeżywalności komórek 8-MG-BA i 42-MG-BA o ok.
47%. Najmniej wrażliwe okazały się komórki SNB-19, których przeżywalność zmniejszyła się o ok. 20%. Nie stwier-
dzono wpływu LA i ALA na cytotoksyczność CPT w żadnej
testowanej linii komórek. Obecność AA w stężeniu 100 μM
spowodowała wzrost toksyczności CPT tylko w przypadku
komórek SNB-19. Gdy medium hodowlane zawierało DHA
lub EPA w stężeniu 100 μM obserwowano wzrost toksyczności CPT względem wszystkich testowanych linii komórek, jednakże największy wzrost wrażliwości na ten lek
zaobserwowano w przypadku komórek SNB-19, ich przeżywalność w obecności DHA, jak i EPA zmniejszyła się do
ok. 10 % względem kontroli. Spośród testowanych WNKT,
DHA w stężeniu 100 μM, w największym stopniu uwrażliwiał wszystkie rodzaje komórek na CPT.
Dyskusja
WNKT są istotnymi składnikami fosfolipidów błonowych determinującymi strukturę, płynność i przepuszczalność błon. Zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych WNKT oraz produkty ich utleniania pełnią
funkcję wewnątrzkomórkowych, drugorzędowych przekaźników sygnału w procesach różnicowania, proliferacji
oraz śmierci komórki. Komórki nowotworowe charakteryzuje niska zawartość WNKT, obniżony poziom cytochromu
P-450, który uczestniczy w wytwarzaniu reaktywnych form
tlenu (RFT), niskie stężenie NADPH oraz podwyższona aktywność antyoksydacyjna, co powoduje, że w komórkach
tych w porównaniu z komórkami prawidłowymi mniej intensywnie zachodzą procesy wolnorodnikowe, co skutkuje
niższą zawartością biologicznie aktywnych, pierwotnych
i wtórnych produktów peroksydacji lipidów [2, 5]. Wiele rodzajów terapii nowotworów bazuje na indukowaniu stresu
oksydacyjnego w komórkach nowotworowych, dlatego zbyt
niskie poziomy wrażliwych na utlenianie WNKT są przyczyną mniejszej skuteczności tych terapii. Niski poziom
WNKT w komórkach nowotworowych spowodowany jest
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. II. Wpływ kwasu linolowego (LA), a-linolenowego (ALA), arachidonowego (AA) eikozapentaenowego (EPA) i dokozaheksaenowego (DHA) na przeżywalność komórek glejaka wielopostaciowego (SNB-19) i ludzkich glejaków (8-MG-BA,
42-MG-BA) hodowanych w obecności cisplatyny (CPT; 3,7 nM). Zmiany w przeżywalności komórek traktowanych CPT
oraz WNKT i CPT wyrażono w procentach względem komórek kontrolnych
WNKT
CPT
LA + CPT
ALA+ CPT
AA+ CPT
EPA+ CPT
DHA+ CPT
Stężenie WNKT [MM]
0
25
50
100
25
50
100
25
50
100
25
50
100
25
50
100
Przeżywalność komórek [% kontroli]
SNB-19
8-MG-BA
42-MG-BA
80.12 ± 2.27
51.98 ± 2.59
55.05 ± 2.38
79.98 ± 3.45
50.94 ± 2.00
56.25 ± 2.62
78.39 ± 2.9
51.97 ± 2.30
53.77 ± 3.43
81.69 ± 2.96
50.97 ± 2.35
55.16 ± 2.87
79.50 ± 3.64
49.88 ± 2.18 a
56.05 ± 2.93
81.29 ± 1.58
50.70 ± 3.11
58.05 ± 3.50
81.95 ± 2.38
51.25 ± 2.39
57.32 ± 3.09
83.44 ± 2.59
50.24 ± 2.72
56.14 ± 1.26
84.39 ± 3.01
48.89 ± 4.14
57.92 ± 2.69
64.72 ± 3.76 a,b
51.88 ± 2.15
53.57 ± 2.51
80.36 ± 2.40
49.53 ± 3.86
54.84 ± 3.30
75.59 ± 2.14
50.79 ± 1.73
56.34 ± 3.41
10.84 ± 0.95 a
38.03 ± 2.18 a,b
40.43 ± 2.94 a,b
81.66 ± 2.61
48.81 ± 1.72
56.07 ± 3.24
73.69 ± 1.81 a,b
48.60 ± 1.93
53.91 ± 2.13
9.88 ± 0.85 a
13.93 ± 2.00 a,b
16.98 ± 1.02 a,b
a - istotna statystycznie różnica w porównaniu z komórkami eksponowanymi na CPT; P<0.02
b - istotna statystycznie różnica w porównaniu do komórek traktowanych AA + CPT; EPA + CPT i DHA + CPT; P<0.0003
przede wszystkich utratą lub zmniejszoną aktywnością ∆6
i ∆5-desaturaz [8]. Kilka doniesień literaturowych opisuje
możliwość modyfikacji profilu WNKT w błonach komórek
nowotworowych przez zmianę składu pożywek hodowlanych w warunkach in vitro [9] lub przez zmianę diety zwierząt laboratoryjnych z wszczepionymi nowotworami [10].
Rezultaty licznych badań z użyciem różnych typów komórek nowotworowych wskazują na przeciwnowotworową aktywność WNKT rodzin n-3 oraz n-6 [6, 11, 12]. Nieliczne
badania przeprowadzone na ludzkich komórkach glejaków
udowodniły, że WNKT są zdolne do indukcji apoptozy tych
komórek, jednakże efekty wywoływane przez te kwasy zależą od ich dawki i rodzaju komórek. Dowiedziono, że niskie stężenia WNKT i ich metabolitów mogą stymulować
proliferację komórek nowotworowych [7, 12-14]. Wyniki
naszych badań pokazują, że spośród testowanych kwasów
WNKT, tylko EPA i DHA w stężeniu 100 μM zmniejszały
proliferację komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA, przy
czym efektywność DHA była większa. Podobne rezultaty
opisano w eksperymentach z zastosowaniem komórek glejaka C6, gdzie GLA, AA, EPA i DHA selektywnie zmniejszały przeżywalność komórek nowotworowych oddziałując
w niewielkim stopniu lub wcale na komórki prawidłowe [7,
12]. Autorzy niektórych prac uważają, że przeciwnowotworowe działanie EPA i DHA jest związane z odmiennymi mechanizmami działania. EPA hamuje przede wszystkim proliferację
komórek, natomiast DHA stymuluje ich apoptozę [7, 12, 14].
Niedawno opublikowane prace potwierdziły, że DHA jak i AA,
w odróżnieniu od LA i kwasu oleinowego, są zdolne do indukcji apoptozy w różnych rodzajach komórek raka płuca, a obserwowane efekty zależą od stężenia kwasu i czasu ekspozycji
[6, 11]. Żaden z testowanych w przedstawianej pracy WNKT
w zakresie stosowanych stężeń nie spowodował zmian w przeżywalności komórek glejaka wielopostaciowego (SNB-19).
Mechanizm przeciwnowotworowego działania WNKT
nie został dotychczas w pełni poznany. Jedna z postulowanych hipotez przypisuje korzystne działanie WNKT w prewencji i terapii nowotworów ich zdolnościom do generowania RFT oraz ich podatności na wolnorodnikowe utlenianie,
co skutkuje nagromadzeniem cytotoksycznych produktów
utleniania lipidów i prowadzi do zmian mitochondrialnego
metabolizmu, uwalniania cytochromu c, aktywacji kaspaz
i w konsekwencji indukcji apoptozy [3, 7, 11-14]. Różnice
w biologicznej aktywności pomiędzy WNKT n-6 i n-3 tłumaczy się głównie wpływem tych kwasów na powstawanie
prostanoidów. Wydaje się, że przeciwnowotworowe działanie n-3 WNKT wynika przede wszystkim z redukcji proliferacji komórek nowotworowych na skutek zmniejszenia
poziomu PGE2 [2, 5]. Zarówno WNKT, jak i produkty ich
metabolizmu, mogą zmieniać ekspresję niektórych genów
i białek [10, 15, 16]. Jednym z głównych problemów związanych z progresją nowotworu jest angiogeneza, która jest
związana nie tylko z odżywianiem guza, ale także z migracją komórek nowotworowych. Stwierdzono, że w glejakach
nadekspresja VEGF koreluje ze wzrostem ich złośliwości.
Udowodniono, że GLA, AA, EPA i DHA mogą wykazywać
właściwości antyangiogenne [15, 16].
Egzogenne WNKT modyfikując właściwości błon komórek nowotworowych mogą zwiększać skuteczność terapii przeciwnowotworowej poprzez zwiększenie wnikania
leków do wnętrza tych komórek. Ponadto, błonowe WNKT
są substratami dla reakcji wolnorodnikowych, które często
stanowią jeden z mechanizmów chemioterapii, radioterapii,
czy terapii fotodynamicznej [4]. Cytotoksyczna aktywność
CPT związana jest z tworzeniem inter- i intramolekularnych
wiązań z DNA, co zaburza procesy replikacji, transkrypcji,
translacji prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego
i aktywacji ścieżek sygnałowych kierujących komórki no-
&ARM0RZEGL.AUK
wotworowe na drogę apoptozy [1]. Dodanie EPA i DHA do
hodowli komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz
AA, EPA i DHA do hodowli komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 znacznie zwiększyło przeciwnowotworową aktywność CPT względem tych komórek, przy czym
najsilniejszy efekt obserwowano w komórkach SNB-19.
Rezultaty naszych badań są zgodne wynikami opisującymi
wrażliwość komórek glejaków wielopostaciowych A-172
i U-87MG eksponowanych na doksorubicynę w obecności
DHA. Udowodniono, że DHA bardziej uwrażliwia komórki glejaka wielopostaciowego na doksorubicynę wtedy, gdy
komórki te są oporne na działanie tego kwasu [17]. Wśród
zastosowanych w pracy linii komórek nowotworowych najmniejszą wrażliwością nie tylko na WNKT, ale także na CPT
charakteryzowały się komórki glejaka wielopostaciowego
SNB-19. Kilka badań in vitro oraz in vivo opisuje wzrost
przeciwnowotworowej aktywności CPT w obecności DHA.
Inkubacja CPT-wrażliwych (GLC-4) i opornych (GLC-4CP) komórek drobnokomórkowego raka płuca z nietoksycznymi stężeniami DHA skutkowała zwiększonym wbudowywaniem się DHA w błony komórek nowotworowych
i 3 krotnym spadkiem oporności na CPT tylko komórek
GLC-4-CP. W przypadku komórek GLC-4 nie obserwowano zmian cytotoksyczności tego leku. Stwierdzono, że DHA
w obydwu liniach zwiększał wewnątrzkomórkowe poziomy
CPT, całkowite jej wiązanie do DNA oraz tworzenie interi intramolekularnych wiązań z DNA [9]. Podobne efekty
obserwowano w przypadku ekspozycji na EPA opornych
i wrażliwych na CPT komórek raka jajnika. EPA uwrażliwiał na działanie CPT tylko komórki oporne na ten lek [18].
Yam i wsp. [19] obserwowali korzystniejszy efekt terapeutyczny CPT u myszy z rakiem płuca karmionych dietą
wzbogaconą 4 % oleju rybnego w porównaniu z grupą myszy karmionych dietą zawierającą 5 % oleju sojowego. Olej
rybny obfituje w EPA i DHA, a olej sojowy stanowi bogate
źródło LA. Korzystną rolę kwasów omega-3 w hamowaniu powstawania komórek nowotworowych i zwiększeniu
skuteczności CPT potwierdzili Elmesary i wsp. [20], którzy stosując model zwierzęcy badali przeciwnowotworowe
właściwości DHA w połączeniu lub nie z CPT. Wyniki tych
eksperymentów pokazały, że DHA redukował wielkość guza
i zwiększał pozytywne efekty chemioterapii CPT. Jednocześnie
DHA ochraniał przed niepożądanymi efektami wywoływanymi przez CPT oraz znosił letalną nefrotoksyczność indukowaną przez ten lek. Brak oddziaływania LA lub ALA na komórki
glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz glejaka wielopostaciowego SNB-19 można tłumaczyć krótszą długością łańcucha
węglowego, niższym stopniem nienasycenia tych kwasów oraz
zmniejszoną aktywnością desaturaz w komórkach nowotworowych, co hamuje przekształcanie tych kwasów w bardziej
aktywne AA, EPA, czy DHA.
Wnioski
1. Spośród testowanych WNKT, tylko EPA i DHA w stężeniu 100 μM zmniejszały proliferację komórek glejaków
8-MG-BA i 42-MG-BA, przy czym większą cytotoksyczność wykazywał DHA. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 były niewrażliwe na wszystkie testowane WNKT w zakresie stosowanych stężeń.
2. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 charakteryzowały się mniejszą wrażliwością na CPT niż komórki
8-MG-BA i 42-MG-BA. Dodanie EPA i DHA do hodowli komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz
AA, EPA i DHA do hodowli komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 zwiększyło przeciwnowotworową
aktywność CPT. Największy wzrost wrażliwości na CPT
zaobserwowano w przypadku komórek SNB-19.
3. Zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej CPT
w obecności AA, EPA lub DHA wskazuje na korzystne
efekty WNKT podczas terapii przeciwnowotworowej
z zastosowaniem CPT mogące poprawić skuteczność
leczenia.
Praca finansowana z tematu badań własnych SUM
nr KNW-2-005/10.
Piśmiennictwo
1. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 72657279.
2. Berquin IM, Edwards IJ, Chen YQ. Multi-targeted
therapy of cancer by omega-3 fatty acids. Cancer Lett
2008; 269: 363-377.
3. Siddiqui RA, Harvey K, Stillwell W. Anticancer properties of oxidation products of docosahexaenoic acid.
Chem Phys Lipids 2008; 153: 47-56.
4. Pardini RS. Nutritional intervention with omega-3 fatty
acids enhances tumor response to anti-neoplastic agents.
Chem Biol Interact 2006; 162: 89-105.
5. Eynard AR. Potential of essential fatty acids as natural
therapeutic products for human tumors. Nutrition 2003;
19: 386-387.
6. Trombetta A i wsp. Arachidonic and docosahexaenoic
acids reduce the growth of A549 human lung-tumor
cells increasing lipid peroxidation and PPARs. Chem
Biol Interact 2007; 165: 239-50.
7. Leaver HA i wsp. Antitumour and pro-apoptotic actions
of highly unsaturated fatty acids in glioma. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2002; 66: 19-29.
8. Slagsvold JE i wsp. Regulation of desaturase expression in HL60 cells. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67:
632-642.
9. Timmer-Bosscha H i wsp. Influence of docosahexaenoic acid on cisplatin resistance in a human small cell
lung carcinoma cell line. J Natl Cancer Inst 1989; 81:
1069-1075.
10. Nasrollahzadeh J i wsp. The influence of feeding linoleic, gamma-linolenic and docosahexaenoic acid rich oils
on rat brain tumor fatty acids composition and fatty acid
binding protein 7 mRNA expression. Lipids Health Dis
2008; 7: 45.
11. Serini S i wsp. Dietary polyunsaturated fatty acids as inducers of apoptosis: implications for cancer. Apoptosis
2009; 14: 135-152.
12. Leonardi F i wsp. Effect of arachidonic, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids on the oxidative
status of C6 glioma cells. Free Radic Res 2005; 8:
865-874.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
13. Leaver HA i wsp. Intracellular oxidation by human glioma cell populations: effect of arachidonic acid. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2004; 70: 449-453.
14. Leonardi F i wsp. Docosahexaenoic acid supplementation induces dose and time dependent oxidative changes
in C6 glioma cells. Free Radic Res 2007; 41: 748-756.
15. Spencer L i wsp. The effect of omega-3 FAs on tumour
angiogenesis and their therapeutic potential. Eur J Cancer 2009; 45: 2077-2086.
16. Miyake JA, Benadiba M, Colquhoun A. Gamma-linolenic
acid inhibits both tumour cell cycle progression and angiogenesis in the orthotopic C6 glioma model through changes
in VEGF, Flt1, ERK1/2, MMP2, cyclin D1, pRb, p53 and
p27 protein expression. Lipids Health Dis 2009; 8: 8.
17. Rudra PK, Krokan HE. Cell specific enhancement of
doxorubicin toxicity in human tumor cells by docosahexaenoic acid. Anticancer Res 2001; 21: 29-38.
18. Plumb JA, Luo W, Kerr DJ. Effect of polyunsaturated
fatty acids on the drug sensitivity of human tumor cell
lines resistant to either cisplatin or doxorubicin. Brit J
Cancer 1993; 67: 728-733.
19. Yam D, Peled A, Shinitzky M. Suppression of tumor
growth and metastasis by dietary fish oil combined
with vitamins E and C and cisplatin. Cancer Chemother
Pharmacol 2001; 47: 34-40.
20. El-Mesery M i wsp. Chemopreventive and renal protective effects for docosahexaenoic acid (DHA): implications of CRP and lipid peroxides. Cell Div 2009; 4: 6.
data otrzymania pracy: 01.07.2010r.
data akceptacji do druku: 14.07.2010r.
Adres do korespondencji:
dr n. farm. Alicja Zajdel
Katedra i Zakład Biofarmacji SUM
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
tel. +48 32 364 10 63
e-mail: [email protected]