Dako EnVision+ System-HRP (AEC) Do stosowania z

Dako
EnVision+ System-HRP (AEC)
Do stosowania z podstawowymi przeciwciałami mysimi
Kod K4004 115 mL
Kod K4005 110 mL
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Wskazówki te dotyczą EnVision+ System- HRP (AEC) (System EnVision+ peroksydaza chrzanowa firmy Dako).
Zestaw ten przeznaczony jest do stosowania z podstawowymi przeciwciałami myszy dostarczanymi przez uŜytkownika do jakościowego
oznaczania antygenów w mikroskopie świetlnym w prawidłowych i patologicznych tkankach zatopionych w parafinie, zamroŜonych tkankach
lub preparatach komórek. MoŜna uŜywać tkanek preparowanych w róŜnych utrwalaczach, łącznie z etanolem, B-5, płynem Bouina, formaliną
cynkową i obojętnym roztworem buforowanej formaliny.
NaleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego” lub ze „Wskazówkami” systemu detekcyjnego
dotyczącymi postępowania immunohistochemicznego odnośnie: (1) zasady postępowania, (2) wymaganych materiałów, nie dostarczanych,
(3) przechowywania, (4) preparatyki próbki, (5) procedury barwienia, (6) kontroli jakości, (7) wykrywania i usuwania problemów,
(8) interpretacji wyniku barwienia, (9) ograniczeń ogólnych.
Streszczenie i objaśnienie
EnVision+ System-HRP stanowi dwuetapową technikę barwienia immunohistochemicznego. Podstawę systemu stanowi polimer znakowany
peroksydazą chrzanową (HRP), który związany jest z drugimi przeciwciałami. Znakowany polimer nie zawiera awidyny ani biotyny. Wskutek
tego, wyeliminowane lub znacznie zmniejszone jest nieswoiste barwienie wynikające z aktywności awidyna-biotyna w wątrobie, nerkach,
tkankach limfoidalnych i skrawkach zamroŜonych. Wszystkie odczynniki EnVision+ System-HRP z 3-amino-9-etylokarbazolem firmy Dako są
gotowe do uŜycia. System ten jest niezwykle czułą metodą i w wyniku tego optymalne rozcieńczenia przeciwciała podstawowego są do 20
razy wyŜsze od rozcieńczeń stosowanych w tradycyjnej metodzie peroksydaza – anty-peroksydaza i kilkakrotnie wyŜsze niŜ rozcieńczenia
stosowane w tradycyjnych metodach z wiązaniem antygenu lub znakowaną streptawidyną-biotyną. Przyjęte postępowanie oferuje
udoskonalony system generowania sygnałów, słuŜących do wykrywania antygentów obecnych w niskich stęŜeniach lub niskich mian
podstawowych przeciwciał.
Podstawowe przeciwciała wytwarzane przez myszy reagują dobrze ze znakowanym polimerem. Interpretację jakiegokolwiek barwienia
dodatniego lub jego nieobecność powinno się dopełnić badaniem morfologicznym i histologicznym z odpowiednią kontrolą.
Zasady postępowania
Całą aktywność endogennej peroksydazy naleŜy stłumić inkubując próbkę z odpowiednim odczynnikiem firmy Dako blokującym endogenną
peroksydazę. Próbkę następnie inkubuje się z odpowiednio odznaczonym i rozcieńczonym podstawowym przeciwciałęm mysim, po którym
następuje inkubacja ze znakowanym polimerem z zastosowaniem dwóch kolejnych, 30. Minutowych inkubacji.
NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe w przypadku przeciwciał wymagających trawienia enzymatycznego lub docelowego
koniecznym moŜe być wydłuŜenie czasów inkubacji przeciwciała podstawowego i znakowanego polimeru o 5
Barwienie kończy się 5. do 30. minutową inkubacją z 3-amino-9-etylokarbazolem (AEC)+ substratem-chromogenem, co
czerwono zabarwiony strąt w miejscu antygenu. (3-amino-9-etylokarbazol jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym,
„Środki ostroŜności”).
odzyskiwania
do 10 minut.
daje w wyniku
patrz paragraf
Dostarczane odczynniki
Kod K4004: Następujące materiały, starczające na 150 wycinków tkanek, zakładając 100 µL na wycinek, są zawarte w zestawie:
Nr butelki Ilość
Opis
1
1x15 mL
Blok peroksydazy
0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu.
2
1x15 mL
Znakowany polimer
Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami przeciwmysimi w buforze Tris-HCl
zawierającym proteinę stabilizującą i środek przeciwbakteryjny.
3
1x15 mL
3-amino-9-etylokarbazol+ substrat-chromogen
3-amino-9-etylokarbazol zawierający nadtlenek wodoru, stabilizatory, wzmacniacze i środek przeciwbakteryjny.
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C.
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 1/7
Kod K4005: Następujące materiały, wystarczające na 1100 wycinków tkanek, zakładając 100 µL na wycinek, są zawarte w zestawie:
Nr butelki Ilość
1
1x110 mL
Opis
Blok peroksydazy
0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu.
2
1x110 mL
Znakowany polimer
Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami przeciwmysimi w buforze Tris-HCl
zawierającym proteinę stabilizującą i środek przeciwbakteryjny.
3
1x110 mL
3-amino-9-etylokarbazol+ substrat-chromogen
3-amino-9-etylokarbazol zawierający nadtlenek wodoru, stabilizatory, wzmacniacze i środek przeciwbakteryjny.
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C.
Materiały wymagane, lecz nie dostarczone
Bibuła
Tkanka kontrolna, dodatnia i ujemna
Barwienie negatywne; wodne, takie jak hematoksyliną Mayera lub hematoksyliną Mayera modyfikowaną wg Lillie’ego
(kod S3309)
Szkiełka nakrywkowe
Woda destylowana
Etanol, bezwodny i 95%
Mikroskop świetlny (20x–800x)
PoŜywki do montowania takie jak poŜywka do montowania Glycergel™ (Glycergel™ Mounting Medium)
(kod C0563) lub Faramount, wodna poŜywka do montowania, gotowa do uŜycia (kod S3025) lub bezwodna, stała poŜywka do montowania
Ultramont (kod S1964)
Pierwsze przeciwciała lub odczynnik kontroli ujemnej
Szkiełka, wielokrotnie opłaszczone L-lizyną lub szkiełka silanizowane (kod S3003)
Słoje lub łaźnie barwiące
Stoper (odpowiedni dla wyznaczenia 3–40 minutowych okresów)
Tryskawki
Roztworu buforu przemywającego
Ksylen, toluen lub zamienniki ksylenu
Opcjonalne materiały wymagane, lecz nie dostarczone
Wodorotlenek amonu, 0,015 mol/L rozcieńczony do 0,037 mol/L
Pen peroksydaza – anty-peroksydaza (PAP Pen) (kod S2002)
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w
produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu
i miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku
metalu w kanalizacji.1.2
3. 3-amino-9-etylokarbazol+ substrat-chromogen jest wraŜliwy na zanieczyszczenie przez róŜne środki utleniające takie jak metale,
bakterie, kurz i powszechnie stosowane szklane wyroby laboratoryjne. Aby uniknąć zanieczyszczenia i przedwczesnego upływu
waŜności nie naleŜy roztworu 3-amino-9-etylokarbazolu+ wystawiać na działanie potencjalnych źródeł zanieczyszczeń i nigdy nie
pipetować bezpośrednio z butelki. Wymaganą ilość nalać do czystego pojemnika i nabierać z niego pipetą. Nadmiaru roztworu 3amino-9-etylokarbazolu+ nie zwracać do pojemnika pierwotnego.
4. Nie uŜywać odczynników po wygaśnięciu daty waŜności dla zalecanej metody przechowywania. Jeśli odczynniki są przechowywane w
warunkach innych niŜ wskazane w niniejszej ulotce, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki.
5. Nie zastępować odczynników odczynnikami z innych numerów partii lub z zestawów innych producentów.
6. Wystawienie enzymów i substratu-chromogenów na działanie silnego światła moŜe mieć niekorzystny wpływ. Nie przechowywać
komponentów zestawu, ani nie prowadzić barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
7. Zastosowanie czasów inkubacji, temperatur innych niŜ podano w instrukcji moŜe spowodować błędne wyniki, wszelkie takie zmiany
muszą być weryfikowane przez uŜytkownika.
8. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŜy stosować prawidłowe procedury
postępowania.
9. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy załoŜyć odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
10. NiezuŜyte ilości roztworu naleŜy zutylizować zgodnie z odpowiednimi przepisami.
11. Na Ŝądanie dostępne są Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 2/7
Niebezpieczeństwo
AEC+ Substrate-Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-metylo-2-pirolidon, 0.1-1% kwas octowy, 0.1-1% 3-amino-9ethyl carbazole
H320
Wywołuje podraŜnienie oczu.
H350
MoŜe powodować raka.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa.
P281
Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej.
P280
Stosować ochronę oczu lub twarzy.
P264
Dokładnie umyć ręce po uŜyciu.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P305 + P351 +
W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki
P338
kontaktowe, jeŜeli są i moŜna je łatwo usunąć. Nadal płukać.
P337 + P313
Jeśli podraŜnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami.
Przygotowanie odczynników
Wskazane jest przygotowanie następujących odczynników przed wykonaniem barwienia.
Roztworu buforu przemywającego
TBST – 0,05 mol/L zbuforowany Trisem roztwór soli z Tweenem (Tris Buffered Saline with Tween) (kod S3006) jest zalecanym buforem
przemywającym do automatycznego lub ręcznego wykrywania immunohistochemicznego. TBS – 0,05 mol/L zbuforowany Trisem
roztwór soli (Tris Buffered Saline) (kod S1968) i PBS - 0,02 mol/L zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (Phosphate Buffered Saline)
(kod S3024) są takŜe właściwymi roztworami buforów przemywających do barwienia ręcznego. Nie zaleca się stosowania roztworów
buforu przemywającego zawierających azydek sodu. Azydek sodu będzie inaktywować peroksydazę (HRP) doprowadzając do
barwienia ujemnego. NiezuŜyty bufor przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Pozby ć się buforu, jeśli jego wygląd stanie się mętny.
Wodę destylowaną moŜna stosować do płukania blokady peroksydazy, substratu i barwienia negatywnego.
Pierwsze przeciwciało
Gotowe przeciwciała serii NP „Plus” zoptymalizowane są i zalecane do stosowania w wysokoczułych systemach detekcji Dako „Plus”.
W firmie Dako są równieŜ dostępne skoncentrowane przeciwciała. Wymaga się optymalizacji skoncentrowanych przeciwciał przez
końcowego uŜytkownika. Rozcieńczenia naleŜy przygotować stosując rozcieńczalnik przeciwciał (Antibody Diluent) (kod S0809) lub
rozcieńczalnik zawierający 0,05 mol/L bufor Tris-HCI z 1% albuminą surowicy wołowej (BSA). Gotowe przeciwciała serii N nie są
zoptymalizowane do stosowania w wysokoczułych systemach detekcji Dako „Plus”. Dla większości przeciwciał pierwszych
stosowanych w tym zestawie 30-minutowy czas inkubacji jest wystarczający.
Odczynnik kontroli ujemnej
Podczas uŜywania gotowych przeciwciał Dako serii NP „Plus” jako odczynnika kontroli ujemnej zaleca się odczynnik Universal
Negative Control(s)+. Kontrole zoptymalizowane są do stosowania z mysimi, gotowymi przeciwciałami serii NP „Plus” (kod NP015) lub
króliczymi (kod NP001).
Doskonale, gdy odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciało, które nie wykazuje swoistej reaktywności z ludzkimi tkankami lub
prawidłową/nieodporną surowicą w tej samej matrycy/roztworze co rozcieńczone przeciwciało pierwsze. Odczynnik kontroli ujemnej
powinien naleŜeć do tej samej podklasy i gatunku zwierząt co przeciwciało pierwsze, być rozcieńczony do takiego samego stęŜenia
immunoglobulin lub protein co przeciwciało pierwsze z uŜyciem tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika kontroli
ujemnej powinien odpowiadać czasowi inkubacji pierwszego przeciwciała.
Odnośnie dalszych informacji dotyczących kontroli ujemnej i dodatniej naleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia
immunohistochemicznego”.
Barwienie negatywne
Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest rozpuszczalny w alkoholu i powinno się go uŜywać tylko z wodnym barwieniem
negatywnym, takim jak hematoksylina Mayera lub hematoksylina Mayera modyfikowana wg Lillie’ego (kod S3309). Barwienie
negatywne wykonywać hematoksyliną z dokładnym płukaniem wodą destylowaną, następnie szkiełka z tkankami zanurzyć w w kąpieli
0,037 mol/L amoniaku lub podobnego środka tuszującego. 0,037 mol/L wodę amoniakalną przygotowuje się poprzez zmieszanie 2,5
mL 15 mol/L (stęŜonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody.
Niewykorzystana woda amoniakalna 0,037 mol/L moŜe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20–25 °C) w szczelnie
zamkniętej butelce do 12 miesięcy.
Po alternatywne procedury barwienia negatywnego naleŜy zajrzeć do wytycznych producenta.
PoŜywka do montowania
PoŜywka do montowania Glycergel™ (Glycergel™ Mounting Medium) (kod C0563) lub Faramount – bezwodna poŜywka do
montowania, gotowa do uŜycia (kod S3025) zalecane do montowania bezwodnego. Glycergel trzeba przed uŜyciem podgrzać do
przynajmniej 50 °C. Mo Ŝna równieŜ uŜywać bezwodnej, stałej poŜywki do montowania Ultramount (kod S1964).
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 3/7
Przechowywanie
Odczynniki EnVision+ System-HRP naleŜy przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Nie zamra Ŝać. Nie uŜywać o upływie daty waŜności
wydrukowanej na fiolkach odczynników lub etykiecie zestawu.
Zmiana w wyglądzie odczynnika taka jak wytrącanie się osadu moŜe wskazywać na niestabilność lub pogorszenie się stanu. W takich
przypadkach, odczynnika/odczynników nie naleŜy uŜywać.
Roztwór 3-amino-9-etylokarbazolu+ substratu-chromogenu jest niestabilny w temperaturach powyŜej 8 °C. Roztwór 3-amino-9etylokarbazolu+ substratu-chromogenu stosować i przechowywać w zalecanym zakresie temperatur 2–8 °C. Roztwór mo Ŝna stosować
bezpośrednio po wyjęciu z lodówki. Po uŜyciu jak najszybciej wrócić do przechowywania w temperaturze 2–8 °C.
Brak oczywistych oznak wskazujących na brak stabilności produktów. Dlatego teŜ naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne
jednocześnie z badaniem próbek pacjentów. Jeśli zauwaŜone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicą w
procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, Ŝe przyczyną moŜe być niniejszy produkt, naleŜy niezwłocznie skontaktować się z
działem Pomocy Technicznej firmy Dako.
Przygotowanie próbek
Tkanka zatopiona w parafinie
Przed barwieniem immunohistochemicznym tkanki trzeba utrwalić i opracować. Utrwalanie chroni przed autolizą i gnilnym rozkładem
wyciętych tkanek, zachowuje immunogenność, zwiększa współczynnik załamania składników tkanki i zwiększa odporność elementów
komórkowych na obróbkę tkanki. Obróbka tkanki obejmuje odwodnienie, usunięcie środków odwadniających, nasączanie środkiem
zatapiającym, zatapianie i dzielenie tkanki na skrawki. Najczęściej stosowane środki utrwalające do preparatów immunohistochemicznych
tkanek zostały omówione w paragrafie „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego”. Są to tylko wytyczne. Optymalne metody
postępowanie muszą być określone i sprawdzone przez uŜytkownika. (Określone informacje dotyczące utrwalania i obróbki tkanek znajdują
się w odnośnikach 3 i 4.)
Procedura barwienia
Uwagi dotyczące postępowania
Przed uŜyciem uŜytkownik powinien dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się zawartością zestawu. Dla wygody na
insercie laminowanym tworzywem sztucznym podano skondensowane wskazówki.
Odczynniki i instrukcje podane w niniejszym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych wyników. Dalsze
rozcieńczanie odczynników zestawu lub zmiana czasów lub temperatur inkubacji mogą powodować błędne wyniki.
Przed immunobarwieniem butelkę 1 i butelkę 2 naleŜy doprowadzić do temperatury pokojowej
(20–25 °C).Podobnie, wszystkie inkubacje nale Ŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Dla wygody 3-amino-9-etylokarbazol+
substrat-chromogen moŜna uŜywać natychmiast po wyjęciu z lodówki i nie trzeba go doprowadzać do temperatury pokojowej przed
uŜyciem. Po uŜyciu jak najszybciej wrócić do przechowywania w temperaturze 2–8 °C. Przechowy wanie w temperaturze powyŜej 8 °C
moŜe mieć niekorzystny wpływ na stabilność 3-amino-9-etylokarbazolu+ substratu-chromogenu.
Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkanek mogą wykazywać zwiększone
nieswoiste barwienie. Zakryć szkiełka wystawione na działanie przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŜone inkubacje umieścić tkanki w
wilgotnym środowisku.
Czułość EnVision+ System-HRP moŜna dalej zwiększyć poprzez wydłuŜanie czasów inkubacji etapów 2 i 3 przez 5–10 minut.
Procedura barwienia
ETAP 1 BLOK PEROKSYDAZY
Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka gazy)
ostroŜnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynnika w określonym
miejscu.
NałoŜyć blok peroksydazy z butelki 1 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę)
i umieścić w świeŜej kąpieli buforu.
ETAP 2
PIERWSZE PRZECIWCIAŁO LUB ODCZYNNIK KONTROLI UJEMNEJ
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio.
NałoŜyć optymalnie rozcieńczone pierwsze przeciwciało lub odczynnik kontroli ujemnej w ilości wystarczającej do zakrycia
próbki.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej
kąpieli buforu.
Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała (etap 2) szkiełka moŜna
przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny, w temperaturze pokojowej (20–25 °C) bez wpływu na jako ść
barwienia.
ETAP 3
POLIMER ZNAKOWANY PEROKSYDAZĄ
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio.
NałoŜyć znakowany polimer z butelki 2 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 2.
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 4/7
ETAP 4
SUBSTRAT-CHROMOGEN
Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej.
NałoŜyć gotowy roztwór 3-amino-9-etylokarbazolu+ substratu-chromogenu z butelki 3 w ilości wystarczającej do zakrycia
próbki.
Inkubować przez 5–30 minut.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę).
Zebrać odpady roztworu substrat-chromogen do pojemnika na odpady niebezpieczne celu właściwego ich usunięcia.
ETAP 5
BARWIENIE NEGATYWNE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalne)
Zanurzyć szkiełka w kąpieli wodnej hematoksyliny (kod S3309). Długość czasu inkubacji zaleŜy od stęŜenia stosowanej
hematoksyliny.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną.
Szkiełka zanurzyć 10 razy w kąpieli z 0,037 mol/L amoniaku lub podobnego środka tuszującego.
Delikatnie przepłukać szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2–5 minut.
ETAP 6
MONTOWANIE
Próbki moŜna montować i zakrywać szkiełkiem nakrywkowym przy uŜyciu wodnej poŜywki do montowania takiej jak
Glycergel Mounting Medium (kod C0563) lub Faramount (kod S3025) lub bezwodnej poŜywki do montowania Ultramount
(kod S1964).
Uwaga: Produkt reakcji z 3-amino-9-etylokarbazolem rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych i dlatego nie miesza
się z toluenowym lub ksylenowym, stałym środkiem do montowania.
Uwaga: Szkiełka mogą być odczytywane w późniejszym czasie. Jednak moŜe nastąpić pewne odbarwienie, jeŜeli szkiełka
będą wystawione na działanie silnego światła przez okres jednego tygodnia. Aby zminimalizować moŜliwość odbarwiania,
szkiełka naleŜy przechowywać w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
Kontrola jakości
RóŜnice w traktowaniu i procedurach technicznych mogą powodować znaczącą zmienność wyników w laboratorium uŜytkownika,
powodującą konieczność regularnego wykonywania dodatkowych kontroli wewnętrznych oprócz następujących procedur. NaleŜy sprawdzić
wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla Immunochemii wg Amerykańskiego Kolegium Patologii (The
College American Pathologists, CAP) oraz w celu uzyskania dalszych informacji naleŜy sprawdzić pozycje piśmiennictwa od 3 do 5.
Szczegóły dotyczące czułości i reaktywności immunologicznej kaŜdego stosowanego przeciwciała pierwotnego naleŜy sprawdzić arkusz
specyfikacji.
Odnośnie dalszych informacji dotyczących kontroli ujemnej i dodatniej naleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia
immunohistochemicznego”.
Interpretacja wybarwienia
Odnośnie wskazówek dotyczących interpretacji naleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego”.
Ograniczenia
Wybarwienie tkanek zaleŜy od traktowania i przygotowania tkanek przed barwieniem. Nieprawidłowe utrwalenie, zamraŜanie, rozmraŜanie,
przemywanie, suszenie, podgrzewanie, dzielenie na skrawki lub skaŜenie innymi tkankami lub płynami moŜe powodować artefakty,
zatrzymywanie przeciwciał lub fałszywie ujemne wyniki.
UŜycie starych lub niezbuforowanych środków utrwalających lub ekspozycja tkanek na zbyt wysokie temperatury (wyŜsze od 60 °C) podczas
traktowania moŜe doprowadzić do zmniejszenia czułości barwienia.
Aktywność endogennej peroksydazy lub pseudoperoksydazy moŜna stwierdzić w hemoproteinach takich jak hemoglobina, mioglobina,
cytochrom i katalaza, ja równieŜ granulocyty kwasochłonne (eozynofile).8,9 Aktywność moŜna hamować inkubując próbki z blokiem
peroksydazy butelka nr 1 EnVision+ System, HRP przez pięć minut przed zastosowaniem pierwszego przeciwciała. Odczynnikiem tym
moŜna równieŜ traktować rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz tkanek zamroŜonych. Jednak procedura ta nie usuwa brunatnoczerwonawego barwnika hemoprotein. Naprzemiennie moŜna stosować roztwór metanol-nadtlenek wodoru. W tej procedurze niektóre
antygeny mogą ulec denaturacji.
Tkanki pochodzące od osób zakaŜonych wirusem zapalenia wątroby typu B oraz u których występuje antygen powierzchniowy wzw typu B
(HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste wybarwienie z peroksydazą chrzanową.10
Normalne/nieodporne surowice o tym samym zwierzęcym źródle pochodzenia co wtórne surowice odpornościowe stosowane na etapach
blokowania mogą dać fałszywie-ujemne lub fałszywie dodatnie wyniki ze względu na autoprzeciwciała lub naturalne przeciwciała.
Odczynniki dostarczane w tym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych wyników. Dalsze rozcieńczanie moŜe
spowodować brak zabarwienia antygenu.
Rozwiązywanie problemów
Opis problemu
1. Brak barwienia szkiełek
2.
Słabe barwienie
wszystkich szkiełek.
(127909-001)
Prawdopodobne przyczyna
1a. Odczynniki nie zostały uŜyte
w prawidłowej kolejności.
1b. Azydek sodu.
2a. Wycinki zatrzymują zbyt
roztworu po kąpieli.
Sugerowane działanie
1a. Sprawdzić stosowanie
odczynników.
1b. UŜyć świeŜego, pozbawionego
buforu azydku.
2a. Delikatnie postukać szkiełkiem,
aby usunąć nadmiar roztworu
przed wytarciem wokół wycinka.
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 5/7
2b.
3.
Nadmierne wybarwienie
podstawowe na
wszystkich szkiełkach.
Szkiełek nie inkubowano
wystarczająco długo z
przeciwciałami lub
substratem.
3a. Próbki zawierają endogenną
peroksydazę o wysokiej
aktywności.
3b. Niecałkowite usunięcie
parafiny.
3c. Szkiełka nie zostały
dokładnie wypłukane.
3d. Reakcja szybsza niŜ reakcja
zwykłego substratu z
powodu np. zbyt wysokiej
temperatury pomieszczenia.
3e. Wycinki wyschły w czasie
procedury barwienia.
3f.
2b. Sprawdzić zalecane czasy
inkubacji.
3a. Zastosować dłuŜszy czas
inkubacji bloku peroksydazy,
butelka 1.
3b. Zastosować kąpiel ze świeŜego
ksylenu i toluenu. Jeśli kilka
szkiełek barwi się jednocześnie
druga kąpiel w ksylenie powinna
zawierać świeŜy ksylen.
3c. UŜyć świeŜe roztwory w kąpielach
buforowych i tryskawek.
3d. Zastosować krótszy czas
inkubacji z roztworem substratuchromogenu.
3e. Zastosować komorę wilgotną.
Wytrzeć tylko trzy do czterech
szkiełek w danej chwili przed
nałoŜeniem odczynnika.
3f. NałoŜyć roztwór blokujący
zawierający niezwiązaną proteinę.
Nieswoiste wiązanie
odczynników z wycinkiem
tkanki.
3g. Roztwór przeciwciał zbyt
3g. Zastosować większe
stęŜony.
rozcieńczenie przeciwciała.
UWAGA: Jeśli problemu nie moŜna przypisać Ŝadnemu z powyŜszych powodów lub, gdy sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje
problemu naleŜy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy.
Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŜna znaleźć w Podręczniku metod barwienia
immunohistochemicznego$ (dostępnym w firmie Dako), Atlasie immunohistologii11 i technik immunoperoksydazowych – praktycznym
podejściu do diagnostyki nowotworów.12
Piśmiennictwo
1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the
decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13.
August
16, 1976
2. Center for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. “Decontamination of laboratory sink drains
to remove azide salts”. April 30, 1976
3. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81
4. Naish SJ (ed). Handbook–immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989
5. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline.
Villanova, PA 1991; Order Kod C24-A:4
7. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194
8. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;
35:213
9. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46
10. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in
immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626
11. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
12. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol
Press 1986
Dodatkowe piśmiennictwo
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195
Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3–8
Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a
staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest,
Hungary 1996; Oct 20–25
Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World
Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Bisgaard K. EnVision Plus–Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary
1996; Oct 20–25
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 6/7
Edition 07/15
(127909-001)
P04044PL_01/K4004_K4005/2015.07 s. 7/7