Test transformacji limofcytów (LTT)

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2013 • Volume 49 • Number 4 • 425-428
Diagnostyka laboratoryjna w internecie • Diagnostics on the Internet
Test transformacji limofcytów (LTT)
Lymphocyte Transformation Test (LTT)
W wykrywania alergii obok uznanych i sprawdzonych
w praktyce metod stosuje się również metody, których wartość jest dyskusyjna lub wręcz żadna. Lekarz w postępowaniu diagnostycznym powinien posługiwać się zalecanymi
metodami o potwierdzonej wartości diagnostycznej. Powinny one być efektem racjonalnej wiedzy o chorobie, zawierać wskaźniki, których rola w patologii choroby jest uznana
i ściśle określona, posiadać wysoką czułość i swoistość oraz
być obciążone subiektywizmem oceny. Istnieje grupa badań
referencyjnych, uznanych zarówno przez europejskie, jak
i amerykańskie towarzystwa naukowe stosowanych w alergologii, ukierunkowanych na wykrywanie nadwrażliwości
typu alergicznego, takich jak różnego rodzaju testy skórne, badania poziomu immunoglobulin w surowicy, swoiste
próby prowokacyjne, ekspozycyjne czy diety eliminacyjne.
W trudnych diagnostycznie przypadkach w wysoko wyspecjalizowanych ośrodkach wykonuje się dodatkowe badania,
takie jak test degranulacji i uwalniania histaminy, test zahamowania migracji, test transformacji blastycznej limfocytów
czy nowe techniki mapowania IgE w testach mikrooznaczeń.
Dlatego artykuł ten postanowiliśmy poświęcić testowi transformacji limfocytów (LTT).
Test LTT został opisany w 1960 roku przez Peter’a Nowell
(Phytohemagglutinin: An Initiator of Mitosis in Cultures of
Normal Human Leukocytes, artykuł dostępny na stronie
http://cancerres.aacrjournals.org/content/20/4/462.long).
Przesłanką dla jego opracowania była obserwacja, że inkubacja limfocytów z fitohemaglutyniną prowadzi do ich mitogennej aktywacji i proliferacji. Początkowo test cechował
się niską czułością i swoistością diagnostyczną i w wielu
przypadkach jego efektywność była porównywalna z testami skórnymi. Rozwój technik hodowli komórkowej, ulepszenie nośników, poprawa jakości antygenów stosowanych do
stymulacji komórek, oraz ulepszenie metod pomiaru przyczyniły się do poprawienia czułości i swoistości testu LTT.
Urządzenia stosowane dotychczas do pomiaru aktywności
3H-tymidyny – liczniki ciekłej scyntylatory - zastąpiono nowocześniejszymi licznikami promieniowania beta fazy stałej, uzyskując ponadto poprawę czułości i powtarzalności
testu. Dodatkowo, zastosowanie interferonu alfa w hodowli
komórkowej oraz postęp badań biotechnologicznych przyczyniły się do rozwoju technologii Microculture (Volker von
Baehr et al. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0022175901002976#). Obecnie test LTT stanowi czułą metodę, o wysokiej powtarzalności, która znalazła zastosowa-
nie w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej różnych chorób.
Wskazania do jego przeprowadzenia obejmują 4 główne obszary diagnostyki medycznej (rozpoznanie lub wykluczenie)
(http://www.dr-andre.eu/resources/LTTEnglisch.pdf):
1. uwrażliwienie o charakterze komórkowym (alergia typu
IV),
2. wady i zaburzenia czynności układu immunologicznego,
3. zgodność tkankowa / brak zgodności tkankowej (transplantologia),
4. reaktywność limfocytów na czynniki zakaźne (np. Borelia)
Szukając informacji na temat testu transformacji limfocytów
sprawdzono dane zawarte na stronach Wikipedii. Badanie
opisane wg autora testu umieszczono w grupie analiz z zakresu biologii molekularnej (?), jako metodę oceny proliferacji uprzednio aktywowanych limfocytów. W sposób bardzo
ogólny przedstawiono zasadę testu i określono jego użyteczność w dziedzinie diagnostyki alergii, wykrywania bakterii
(np. krętków Borrelii) (?) oraz badania zgodności tkankowej.
Informacje podane na tej stronie budzą szereg zastrzeżeń,
z pewnością test nie ma żadnego związku z biologią molekularną jak i wzbudza zdziwienie informacja, że poprzez
transformację limfocytów można wykrywać bakterie. Przyjęty skrót myślowy może wprowadzać w błąd. W teście można
stwierdzić reakcję limfocytów z antygenami Borrelli w przypadku występowania komórek, które miały kontakt in vivo
z prątkami. Autor powyższych informacji powołuje się na
artykuł Katarzyny Szatkowskiej (http://hylostet.pl/igm/artic
le/115/) w którym nie znaleziono potwierdzenia tych danych.
Autorka natomiast zwięźle przedstawiła informacje na temat
testu transformacji limfocytów, m.in. dotyczące stosowanego
nazewnictwa anglojęzycznego (Lymphocyte Transformation
Test = Lymphocyte Proliferation Test = Lymphocyte Stimulation Test), a także jego definicję, przedstawiając badanie
jako jedno z najbardziej wiarygodnych i czułych metod pozwalających na zmierzenie odpowiedzi proliferacyjnej zaktywowanych antygenem limfocytów. Ciekawie został przedstawiony opis antygenu jako substancji obcej, którą organizm
„planuje” zniszczyć (toksyny bakteryjne, metale, tworzywa
sztuczne, leki, składniki żywności). Za pomocą tego badania można potwierdzić reakcję alergiczną na niektóre leki
lub wykorzystać go do ustalania zgodności lub braku zgodności tkankowej. Ostatni obszar staje się niezwykle istotny
w transplantologii. W artykule autorka podkreśla możliwość
wykorzystania testu do wykrywania limfocytów pobudzonych
425
Test transformacji limofcytów (LTT)
na skutek kontaktu z bakteriami chorobotwórczymi jak na
przykład krętki Borrelii a także zastosowania do określenia
tolerancji na tworzywa sztuczne zawarte w protetycznych
i stomatologicznych materiałach zastępczych. W artykule
przedstawiono ponadto schemat przebiegu testu oraz sposób interpretacji wyniku jako wskaźnika stymulacji SI (stimulation index), który jest stosunkiem wartości otrzymanej
dla hodowli z antygenem i hodowli bez antygenu. Schemat
wykonania testu znaleźć można także na stronie http://www.
nucleagena.pl/files/nucleagena_stoma_ltt_na_stom_mat_
zastepcze.pdf czy http://www.springerreference.com/docs/
html/chapterdbid/32562.html. Wyniki SI <1 uznaje się za negatywne, wartości pomiędzy 2 a 3 mocno sugerują reakcję
dodatnią (inni określają ją jako słabo dodatnią), wartości >3
przyjmuje się za reakcję dodatnią (http://onlinelibrary.wiley.
com/doi/10.1111/j.1398-9995.2004.00547.x/pdf), http://pac.
iupac.org/publications/pac/pdf/2004/pdf/7606x1269.pdf.
W artykule „Diagnostic difficulties in drug adverse reactions” (http://www.termedia.pl/Diagnostic-difficulties-in-drugadverse-reactions,7,3900,1,1.html)
Dorota
Jenerowicz
przedstawiła możliwości diagnostyki niepożądanych reakcji
na leki (ADR – adverse drug reactions), które są przyczyną
wielu chorób skórnych i narządowych i przyczyną zgonów.
Szczególne trudności diagnostyczne ADR wynikają z szeregu uwarunkowań etiopatogenetycznych, immunologicznych
i technicznych. Polekowe odczyny skórne charakteryzują
się niezwykłą różnorodnością. Do najczęstszych skórnych
manifestacji ADR zalicza się osutkę plamisto-grudkową,
pokrzywkę i obrzęk naczynioruchowy. ADR może również
przyjmować kliniczny obraz kontaktowego zapalenia skóry
i zapalenia naczyń. Najgroźniejsze postacie ADR obejmują:
zespół Stevensa-Johnsona i zespół Lyella, a także DRESS
(drug rash with eosinophilia and systemic symptoms).
Często reakcje nadwrażliwości na leki mogą przypominać
infekcje wirusowe (zapalenie wątroby, osutki), choroby
autoimmunologiczne (toczeń układowy, trombocytopenia),
zaburzenia hematologiczne (agranulocytoza), choroby płuc,
nerek, a nawet ostre choroby układu nerwowego (zespół
Guillain-Barré). Pomimo dużej złożoności patomechanizmu
ADR i związanych z tym trudności diagnostycznych, znanych jest szereg metod badawczych i testów klinicznych
ułatwiających prawidłowe rozpoznanie i leczenie różnych
odczynów polekowych. Postępowanie w przypadku ADR
obejmuje szczegółowy wywiad, testy in vivo, badania in vitro
oraz próby prowokacyjne. Wykorzystywane są w tym celu
skórne testy punktowe, testy śródskórne oraz naskórkowe
testy płatkowe. Wśród różnych metod diagnostyki odczynów
polekowych wykazano także przydatność testu transformacji limfocytów, gdyż niektóre leki nie tylko mogą stymulować
limfocyty, ale możliwa jest także ich bezpośrednia reakcja
z receptorami limfocytów. LTT okazał się skutecznym elementem diagnostyki przede wszystkim w przypadkach
uogólnionej osutki polekowej (plamisto-grudkowej, pęcherzowej, krostkowej) oraz DRESS, natomiast w literaturze
można znaleźć tylko pojedyncze doniesienia o przydatności
426
LTT w TEN (toxic epidermal necrolysis), zapaleniu naczyń
czy rumieniu trwałym. LTT można przeprowadzić z zastosowaniem wielu grup leków, m.in. antybiotyków (beta-laktamowych, makrolidów, tetracykliny), leków przeciwpadaczkowych, inhibitorów konwertazy, leków przeciwgruźliczych,
diuretyków, witamin, jodowych środków kontrastu, pochodnych morfiny (petydyna, kodeina), czy miejscowych środków znieczulających (lidokaina, mepiwakaina). Niewątpliwie
zaletą tego testu jest również to, że daje pozytywne wyniki
w ADR niezależnie od patomechanizmu i jeśli jest prawidłowo przeprowadzony, cechuje się większą czułością niż inne
badania. Niestety, przeprowadzenie LTT wymaga dużego
doświadczenia w zakresie laboratoryjnych technik komórkowych, ogromnej wiedzy dotyczącej farmakologii i immunologii ADR, a także związane jest z wykorzystaniem drogiego
specjalistycznego sprzętu badawczego. Podobne informacje
znajdziemy w artykule Pichler WJ, Tilch J. „The lymphocyte
transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15230812) w którym
autorzy podkreślają użyteczność testu LTT w ocenie nadwrażliwości na leki. Aczkolwiek wskazują na ograniczenia
testu, m.in. że czułość w przypadku alergii na beta-laktamy
wynosi 60-70% a także że wyniki wymagają doświadczenia
w ich interpretacji. Z kolei Merk H.F. w artykule „Diagnosis
of drug hypersensivity: lymphocyte transformation test and
cytokines” (http://www.sciencedirect.com/science/article/
pii/S0300483X04007280) wskazuje na wzrost czułości diagnostycznej testu LTT w połączeniu z oceną interleukiny-5
do 95% w ocenie nadwrażliwości na leki. Inne cytokiny
jak interferon-gamma czy interleukina-10 nie dają takiego
wzrostu czułości. Autor podkreśla także szczególną rolę
testu transformacji limfocytów w zakresie niemal wszystkich typów reakcji alergicznych – od natychmiastowych do
opóźnionych.
Odrębnym obszarem wykorzystywania LTT jest nadwrażliwość na metale. Przez wiele lat tytan uznawany był za metal
o wysokiej biokompatybilności. Jednak w ostatnich latach
pojawiały się doniesienia o reakcjach nadwrażliwości na tytanowe protezy stawów biodrowych, minipłytki używane do
osteosyntezy czy rozruszniki serca. Podobnie w stomatologii
obserwowano nadwrażliwość na wszczepy śródkostne. Sugeruje się również szkodliwy wpływ tytanu na ogólny stan
zdrowia pacjentów, jak i na zaburzenia procesów gojenia.
Ponadto badania wskazują, że mimo pasywnego działania
zewnętrznej warstwy tlenków w jamie ustnej, może dochodzić do uwalniania jonów tytanu (na skutek m.in. niskiego
pH czy dużego stężenia jonów fluoru), które kumulując się
w tkankach miękkich mogą powodować przebarwienia dziąsła, obrzęk, gingivitis, stomatitis, wysypkę skórną, rumień,
jak również opóźnione gojenie. Analizując mechanizm nadwrażliwości sugeruje się, że jony tytanu mogą łączyć się
z białkami nośnikowymi i mogą być rozpoznawane oraz
transportowane do węzłów chłonnych przez komórki dendrytyczne, gdzie prezentowane są limfocytom T. Proces ten
może rozpoczynać reakcję nadwrażliwości typu IV. Zmiany
Test transformacji limofcytów (LTT)
pojawiające się w takim mechanizmie mogą występować
zarówno miejscowo upośledzając gojenie się tkanek wokół
implantu jak również w formie uogólnionej – pokrzywka, rumień, świąd a nawet atopowe zapalenie skóry. Zwraca uwagę fakt, że w skórnych testach płatkowych nie obserwuje się
w takich przypadkach wyników dodatnich. Metoda ta wydaje
się być mało skuteczna, ponieważ dwutlenek tytanu nie rozpuszcza się w wodzie, zaś stosowana zawiesina soli tytanu
niedostatecznie wnika w głąb skóry. W przypadku alergii na
jony tytanu zalecaną metodą diagnostyczną przez Műller
i Valentine-Thou są cytoimmunologiczne testy in vitro na odporność komórkową jak i test transformacji limfocytów. Dane
takie zostały przedstawione w artykule Moniki Hemerling-Powidzkiej (http://czas.stomat.net/upload/articles/13/1209.pdf).
Na stronie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17261997
zamieszczono z kolei streszczenie artykułu „Hypersinsivity to tytanium: clinical and laboratory evidence”, K. Muller
i wsp. w którym przedstawiono obserwacje własne dotyczące 56 pacjentów, u których wystąpiły objawy kliniczne po
założeniu tytanowych implantów. Wszyscy badani pacjenci
wykazywali ujemne wyniki w testach płatkowych na tytan.
W teście transformacji limfocytów uzyskano zaś dodatnie
wyniki u 21 pacjentów, a u 16 niejednoznaczne. Usunięcie
implantów spowodowało poprawę stanu ogólnego, a w przeprowadzonych powtórnie testach LTT uzyskano normalizację wyników.
Użyteczności testu w wykrywaniu aktywnej postaci boreliozy
oraz w monitorowaniu leczenia boreliozy poświęcono część
doniesienia na stronie http://diagnostykalaboratoryjna.eu/
journal/DL_1-2009__str_97-99.pdf. Warto też zaznajomić się
z wytycznymi Niemieckiego Towarzystwa Boreliozy „Diagnostyka i leczenie boreliozy z Lyme” (tłumaczenie polskie) na
stronie http://www.google.pl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&so
urce=web&cd=2&cad=rja&sqi=2&ved=0CEwQFjAB&ur
l=http%3A%2F%2Flymepoland.com%2Fpliki%2Fwytycz
ne_v11.pdf&ei=BbyxUrLFDaWb1AWk9IFw&usg=AFQjCN
HiuXLKgLT-Kf8AZrHjJ5NptZ5pAg&sig2=34sqB9KctyuMo
tVQ3zWu4w&bvm=bv.57967247,bs.1,d.d2k. Ponieważ komórkowa odpowiedź immunologiczna przebiega bardziej
dynamicznie, niż wytwarzanie przeciwciał, test transformacji
limfocytów (LTT) może szybciej dostarczyć wskazówki o aktywnej infekcji, przemawiają za tym m.in. takie argumenty:
1. Dodatni wynik serologiczny nie jest dowodem aktywnej
choroby boreliozy z Lyme. Z drugiej strony, negatywny
wynik nie wyklucza choroby, zwłaszcza w jej wczesnej
fazie.
2. Jeżeli nie ma dodatniego wyniku w hodowli Borrelia lub
metodą PCR, test LTT może dostarczyć wskazówki czy
istnieje aktywna choroba, z kolei dodatni wynik LTT jest
podejrzany, ale nie dowodzi aktywnej infekcji.
3. Wynik testu LTT w kierunku Borrelia jest dodatni już we
wczesnym stadium infekcji (także przy obecnym erythema migrans) i zasadniczo jest ujemny lub przynajmniej
wyraźnie spada 4 do 6 tygodni po zakończeniu skutecznej antybiotykoterapii.
Wskazania do badania LTT w kierunku Borrelia obejmują:
1. potwierdzenie istnienia aktywnej infekcji u pacjentów seropozytywnych z niejednoznacznymi objawami / pacjentów z wynikiem negatywnym lub granicznym przy silnym
klinicznym podejrzeniu boreliozy z Lyme
2. monitorowanie terapii ok. 4–6 po zakończeniu antybiotykoterapii
3. monitorowanie w przypadku klinicznego podejrzenia
wznowy boreliozy z Lyme
4. nową infekcję
Należy zwrócić uwagę, ze przytoczone powyżej wytyczne
różnią się od zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, opracowanych przez Robert Flisiaka i jego zespół pt. „Diagnostyka i leczenie Boreliozy z Lyme”. W polskich zaleceniach test LTT nie został ujęty
jako narzędzie diagnostyczne.
Niektóre laboratoria oferują inne metody w celu wykrycia
specyficznej dla Borrelia aktywacji limfocytów T, takie jak np.
EliSpot-Test-Borrelia®. W tych metodach indukcja syntezy
cytokin jest mierzona na poziomie komórkowym. Chociaż
test EliSpot ma ugruntowaną pozycję w diagnostyce chorób
zakaźnych (TB), jego rola w diagnostyce boreliozy wymaga
potwierdzenia przy pomocy innych technik.
Kolejnym obszarem, w którym test LTT znalazł zastosowanie jest diagnostyka różnicowa alergicznych chorób
zawodowych. Podstawowym celem różnicowania chorób
zawodowych, w tym alergicznych, jest pewne rozpoznanie
choroby i bezsporne lub z przeważającym prawdopodobieństwem ustalenie jej zawodowej etiologii a także wykazanie
bezspornego lub z przeważającym prawdopodobieństwem
związku przyczynowo-skutkowego między obrazem klinicznym choroby a potwierdzonym badaniami uczuleniem na
alergen występujący na stanowisku pracy. Istotną rolę w rozpoznaniu i różnicowaniu mają wyniki badań laboratoryjnych:
oznaczanie całkowitych i alergenowo swoistych IgE, ocena
eozynofilii we krwi obwodowej, test produkcji sulfidoleukotrienów przez bazofile pod wpływem alergenu, test aktywacji
bazofilów w cytometrii przepływowej oraz test transformacji
blastycznej limfocytów. Wynik testu transformacji z siarczanem berylu ma podstawowe znaczenie w różnicowaniu berylozy i sarkoidozy. Obecnie wiadomo, że beryloza płucna
jest przewlekłą chorobą zapalną płuc spowodowaną przez
koincydencję dwóch czynników: inhalacji nierozpuszczalnych w wodzie pyłów berylu oraz wrodzonej predyspozycji.
Czas od początku narażenia do powstania nadwrażliwości na beryl wynosi ok. 9 tygodni (niektórzy autorzy przyjmują 50 dni), natomiast manifestacja kliniczna przewlekłej
berylozy płucnej może mieć miejsce już po 3 miesiącach,
ale również po 30 latach. Metody umożliwiające wczesną
diagnostykę berylozy opierają się na wykazaniu obecności
zmian patomorfologicznych w płucach i udowodnieniu podłoża uczuleniowego tych zmian za pomocą testu proliferacji
limfocytów krwi obwodowej i płynu pęcherzykowo-oskrzelowego w obecności berylu. Przy użyciu tych kryteriów rozpoznanie można postawić już na etapie zmian subklinicznych
427
Test transformacji limofcytów (LTT)
(Adrian Sieradzki ” Beryloza w środowisku pracy, etiologia
i postępowanie lekarskie” http://www.imp.lodz.pl/upload/
oficyna/artykuly/pdf/full/Sier9-02m-02.pdf; Reinhild Klein
„Diagnostic relevance of the lymphocyte transformation test
for sensitization to beryllium and other metals http://pac.iupac.org/publications/pac/pdf/2004/pdf/7606x1269.pdf)
W publikacji Amit Prasad i współautorów „Lymphocyte transformation test: a new method for diagnosis of neurocysticercosis”
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/
S0732889308000047 badał możliwość wykorzystania testu
transformacji limfocytów w diagnostyce wągrzycy. Wągrzyca
(NCC - neurocysticercosis) jest najczęstszą chorobą pasożytniczą ośrodkowego układu nerwowego. Badania neuroobrazowania są uważane za złoty standard w diagnostyce tej
choroby, ale ich dostępność jest ograniczona w krajach rozwijających się. Celem badania była ocena testu transformacji
limfocytów z płynu uzyskanym z torbieli chorych na wągrzycę. Czułość i swoistość LTT w diagnostyce NCC była 93,8%
i 96,2%, odpowiednio. Badanie pokazuje, że LTT może być
przydatny jako narzędzie do immunodiagnostyki NCC.
Na zakończenie warto zapoznać się z 2 artykułami w których
autorzy w sposób zwięzły omówili różne testy aktywacji komórek w alergii i nadwrażliwości: „Diagnostyka laboratoryjna
chorób alergicznych” Sławomira Białka (http://www.alergia.
org.pl/lek.arch1/archiwum/01_03/diag.html) oraz „Testy aktywacji komórek w alergii i nadwrażliwości” Janiny Grzegorczyk http://www.google.pl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&sour
ce=web&cd=2&cad=rja&ved=0CDUQFjAB&url=http%3A
%2F%2Fwww.mediton.pl%2Flibrary%2Faai_volume-13_is
sue-2_article-759.pdf&ei=uMKyUrqhPIHJ0AWe14CgD
g&usg=AFQjCNEhsIgoHjeKNj-21zx2Fp2caU5Ivw&sig2=o
eL1KR0rTeL6kmCPZMkUPw&bvm=bv.58187178,d.d2k
Zabawne, chociaż tylko pozornie, wydawać się może zdarzenie dotyczące jednej z polskich pacjentek. Nieco przez
pomyłkę lekarz prowadzący zlecił pacjentce z wywiadem
obciążającym nawracającymi poronieniami wykonanie testu LTT w kierunku rtęci. Wynik testu okazał się dodatni. Ze
względu na niejasną użyteczność w zakresie diagnostyki
nawracających poronień, po konsultacji laboratoryjnej, wykonano ocenę stężenia rtęci w moczu pacjentki. Wartości
stwierdzone były dwukrotnie wyższe od „normy”. Tak więc
LTT przyczynił się do rozpoznania zatrucia rtęcią (dane niepublikowane).
Nie przypisując testowi nadmiernie dużego znaczenia
można jednak stwierdzić, że szczególnie w wykrywaniu
nadwrażliwości typu IV posiada dobrze ustaloną pozycję.
Zmiany w sposobie odczytu zdecydowanie poprawiły moc
diagnostyczną badania. Dermatologia, stomatologia ale
i ogólna medycyna powinny wykorzystywać tę metodę w wykrywaniu nadwrażliwości na metale, materiały do wypełnień
korzeniowych, protezy ale także leki, rozpuszczalniki, pokarmy i inne substancje wywołujące nadwrażliwości. Należy
także pamiętać że test powinien być wykonywany w specjalistycznych laboratoriach dysponujących odpowiednim sprzętem specjalistycznym, wiedzą oraz doświadczeniem.
428
Urszula Rychlik
Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej
Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie
[email protected]
Andrzej Marszałek
Synevo Polska Sp. Z o.o., Warszawa
[email protected]
Grażyna Sygitowicz
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej
Warszawski Uniwersytet Medyczny