Wykrywanie benzoesanu denatonium w

UNIWERSYTET GDAŃSKI
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Ćwiczenie nr 2
Oznaczanie benzoesanu denatonium w skażonym alkoholu
etylowym metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej
ANALIZA CHEMICZNA W KRYMINALISTYCE
FIZYKOCHEMICZNE METODY BADAŃ W KRYMINALISTYCE
Gdańsk, 2008
1
I. CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest analiza zawartości benzoesanu denatonium w próbkach
skażonego alkoholu etylowego. Analiza jakościowa zostanie wykonana poprzez porównanie
czasu retencji analitu z czasem retencji wzorca otrzymanych w tych samych warunkach
chromatograficznych. Analiza ilościowa zostanie wykonana metodą krzywej kalibracyjnej
(krzywej wzorcowej).
II. WYKONANIE ĆWICZENIA
1. Warunki analizy chromatograficznej HPLC (ćwiczenie wykonywane w sali 33)
Chromatograf
cieczowy
WATERS
600-MS
jest
połączony
z
detektorem
spektrofotometrycznym UV-Vis firmy LKB seria 2151 Variable Wavelenght Monitor oraz
dozownikiem typu zaworu z pętlą o objętości 20 µl. Do analizy zostanie wykorzystana
kolumna analityczna Gemini 5µ o wymiarach 150×4,6 mm (firmy Phenomenex).
Wypełnienie stanowi żel krzemionkowy z chemicznie związanymi grupami alkilowymi z
podstawnikami fenylowymi, czyli tzw. faza odwrócona C6-Phenyl. Średnica ziaren - 5 µm.
Fazą ruchomą jest mieszanina: 0,1% wodny roztwór H3PO4/acetonitryl w stosunku 30:70
(v/v); rozdział izokratyczny. Prędkość przepływu fazy ruchomej: 0,6 ml/min. Należy używać
rurki teflonowej A oznaczonej „solvent A”. Ustawienie pokrętła „Absorbance range” na
detektorze: 0.32. Czas analizy 25 minut.
Przed rozpoczęciem analiz należy przemyć kolumnę fazą ruchomą w ciągu minimum
30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej (przepływ 0,6 ml/min). Po zakończeniu
analiz należy koniecznie przemyć kolumnę wodą (wcześniej odgazowaną) w ciągu minimum
30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej i pozostawić napełnione wodą rurki
teflonowe zakończone filtrami zanurzone w wodzie. Uwaga: nie wolno doprowadzić do
zapowietrzenia pomp poprzez zaciągnięcie powietrza przez rurki, używanie nieodgazowanych
rozpuszczalników lub pozostawienie rurek, które nie są zanurzone w odpowiedniej ilości
cieczy.
2
2. Odczynniki i sprzęt laboratoryjny (ćwiczenie wykonywane w sali 33)
•
Roztwór 0,1% H3PO4 w 1 litrze wody wykonany poprzez rozpuszczenie 1 ml 85%
H3PO4 w 1 litrze wody.
•
Faza ruchoma o składzie: 0,1% wodny roztwór H3PO4/acetonitryl w stosunku 30:70
(v/v). Fazę ruchomą należy przed użyciem odgazować przez 15 min w łaźni
ultradźwiękowej (250 ml).
•
Acetonitryl do mycia strzykawek (25 ml).
•
Roztwór podstawowy benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniu równym 2 mg/ml.
•
Roztwory wzorcowe benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniach równych: 0, 5,
10, 20 i 40 mg/l.
•
Strzykawka do HPLC o objętości 25 µl.
•
Cylinder miarowy 50 ml.
3. Warunki analizy chromatograficznej HPLC (ćwiczenie wykonywane w sali 46)
Chromatograf cieczowy PERKIN ELMER 200 lc jest połączony z detektorem
spektrofotometrycznym UV-Vis seria 200 oraz dozownikiem typu zaworu z pętlą o objętości
100 µl. Do analizy zostanie wykorzystana kolumna analityczna o wymiarach 150×4,6 mm
(firmy SUPELCO). Wypełnienie stanowi żel krzemionkowy z chemicznie związanymi
grupami oktadecylowymi, czyli tzw. faza odwrócona RP-18. Średnica ziaren - 5 µm. Fazą
ruchomą jest mieszanina: 0,1% wodny roztwór H3PO4/acetonitryl w stosunku 70:30 (v/v);
rozdział izokratyczny. Prędkość przepływu fazy ruchomej: 0,5 ml/min. Należy używać rurki
teflonowej D oznaczonej „solvent D”. Czas analizy 15 minut.
Przed rozpoczęciem analiz należy przemyć kolumnę fazą ruchomą w ciągu minimum
30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej (przepływ 0,5 ml/min). Po zakończeniu
analiz należy koniecznie przemyć kolumnę wodą (wcześniej odgazowaną) w ciągu minimum
30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej i pozostawić napełnione wodą rurki
teflonowe zakończone filtrami zanurzone w wodzie. Uwaga: nie wolno doprowadzić do
zapowietrzenia pomp poprzez zaciągnięcie powietrza przez rurki, używanie nieodgazowanych
rozpuszczalników lub pozostawienie rurek, które nie są zanurzone w odpowiedniej ilości
cieczy.
3
4. Odczynniki i sprzęt laboratoryjny (ćwiczenie wykonywane w sali 46)
•
Roztwór 0,1% H3PO4 w 1 litrze wody wykonany poprzez rozpuszczenie 1 ml 85%
H3PO4 w 1 litrze wody.
•
Faza ruchoma o składzie: 0,1% wodny roztwór H3PO4/acetonitryl w stosunku 70:30
(v/v). Fazę ruchomą należy przed użyciem odgazować przez 15 min w łaźni
ultradźwiękowej (250 ml).
•
Roztwór podstawowy benzoesanu denatonium o stężeniu równym 2 mg/ml.
•
Roztwory wzorcowe benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniach równych: 0, 5,
10, 20 i 40 mg/l.
•
Acetonitryl do mycia strzykawek (25 ml).
•
Strzykawka do HPLC o objętości 100 µl.
•
Cylinder miarowy 50 ml.
5. Wykonanie oznaczenia
a. Przed każdą analizą należy przemyć strzykawkę oraz pętlę dozownika kilkakrotnie
rozpuszczalnikiem a następnie jednokrotnie badaną próbką. Uwaga: dozując próbkę za
pomocą strzykawki nie wolno wprowadzić do dozownika bąbli powietrza.
b. Wykonać analizy HPLC roztworów wzorcowych benzoesanu denatonium o stężeniach
równych: 0, 5, 10, 20 i 40 mg/l w kolejności od najniższego stężenia do najwyższego.
Z otrzymanego chromatogramu odczytać czas retencji substancji wzorcowej oraz pole
powierzchni piku chromatograficznego. Analizę danego roztworu wykonać
trzykrotnie. Wyniki analiz przedstawić w Tabeli 1. Obliczyć średni czas retencji
wzorca benzoesanu denatonium oraz jego przedział ufności.
c. Narysować wykres zależności pola powierzchni piku chromatograficznego (A) od
stężenia benzoesanu denatonium (c): A = f(c). Obliczyć równanie prostej opisującej
krzywą wzorcową metodą najmniejszych kwadratów.
d. Wykonać analizy HPLC próbek skażonego alkoholu etylowego. Porównując czasy
retencji pików na otrzymanym chromatogramie próbki alkoholu etylowego z czasem
4
retencji wzorca benzoesanu denatonium należy zidentyfikować pik chromatograficzny
analitu. Z otrzymanego chromatogramu odczytać czas retencji analitu oraz pole
powierzchni piku chromatograficznego. Analizę danego roztworu wykonać
trzykrotnie. Wyniki analiz przedstawić w Tabeli 2.
e. Korzystając z wcześniej wyznaczonej krzywej wzorcowej obliczyć zawartość
benzoesanu denatonium w badanych próbkach alkoholu etylowego i zamieścić wyniki
w Tabeli 3. Wyniki porównać z wytycznymi zawartymi w Rozporządzeniu Ministra
Finansów z dnia 10 października 2007 r. W sprawozdaniu należy dokładnie opisać
sposób wykonania analizy zwracając uwagę na analizę jakościową oraz analizę
ilościową, ponadto należy zamieścić wszystkie wykonane obliczenia oraz wyniki.
Analizy chromatograficzne roztworów wzorcowych oraz próbek badanych należy
udokumentować poprzez zamieszczenie w tekście sprawozdania odpowiednio
opracowanych chromatogramów.
Tabela 1. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC roztworów wzorcowych benzoesanu
denatonium
Roztwór
Stężenie
c [mg/l]
1
5
2
10
3
20
4
40
Czas retencji
[min]
Pole powierzchni
piku A
Średnie pole
powierzchni piku
5
Tabela 2. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC próbek skażonego alkoholu etylowego
Próbka
Czas retencji
[min]
Pole powierzchni
piku A
Średnie pole
powierzchni piku
1
2
3
4
Tabela 3. Wyniki oznaczenia zawartości benzoesanu denatonium w próbkach skażonego
alkoholu etylowego
Nr próbki
Stężenie benzoesanu denatonium [mg/l]
1
2
3
4
Zakres wymagań:
1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa.
2. Detektor spektrofotometryczny UV/Vis, prawo Lamberta-Beera, absorpcja promieniowania
UV przez związki organiczne.
Literatura:
1. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa, 1996.
2. Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, WNT, W-wa, 1995, 2005.
6