docSekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej
download 
Reklamacja Transkrypt
Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej
Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) szturmem wkroczyło w dziedzinę nauk biomedycznych. Obecnie jakiekolwiek badania podstawowe, dotyczące genetyki i biologii molekularnej trudno opublikować, jeśli nie wykorzystano w nich analiz NGS. Powoli pojawiają się także możliwości wykorzystania tej technologii w rutynowej diagnostyce klinicznej. Gdzie znalazła już ona, albo ma szansę znaleźć w najbliższym czasie, zastosowanie? Jakie są ograniczenia jej stosowania praktyce klinicznej? Ograniczenia i szanse NGS w diagnostyce klinicznej Stosowanymi obecnie narzędziami w rutynowej laboratoryjnej genetyce medycznej są cytogenetyka (klasyczna i FISH) oraz cały wachlarz metod biologii molekularnej, bazujący na amplifikacji pojedynczych fragmentów DNA*. Cały ten warsztat badawczy pozwala albo na mało szczegółową analizę rearanżacji chromosomowych albo szczegółową analizę pojedynczych mutacji/rearanżacji genowych w skali średnio kilkuset par zasad. Większość chorób genetycznych może być spowodowana przez szereg mutacji punktowych, czynnikiem sprawczym niektórych są aberracje chromosomowe na tyle małe, że nie udaje się wykryć ich techniką klasyczną. W onkologii mutacje chorobotwórcze lub predysponujące do zachorowania są rozproszone w wielu różnych obszarach genomu. W mikrobiologii metody molekularne rzadko stosowane są w celach przesiewowych zwykle są jedynie narzędziem pomocniczym z uwagi na możliwość wykrycia niewielu patogenów w pojedynczej reakcji. To tylko niektóre wady testów cytogenetycznych i molekularnych, które nie pozwalają na tak szerokie ich zastosowanie, jakbyśmy sobie tego życzyli. Przezwyciężyć wiele z tych kwestii technicznych może technologia głębokiego sekwencjonowania, która w zależności od zastosowania może zamienić się w wysokorozdzielcze narzędzie analizy cytogenetycznej, technikę molekularną wykrywającą kilkaset lub kilka tysięcy mutacji naraz, czuły test przesiewowy na obecność konkretnych typów drobnoustrojów, czy też potężny panel badań, wykrywający jednocześnie wiele spośród onkogenów złego rokowania [1,2]. Problem z technologią głębokiego sekwencjonowania polega z jednej strony na konieczności zastosowania zupełnie nowego i kosztownego zaplecza aparaturowego (sekwenatory i ich urządzenia peryferyjne, niezwykle wydajny sprzęt komputerowy, software i ogromna pamięć dyskowa) a z drugiej strony wymaga zatrudnienia zupełnie nowego typu fachowców, wyszkolonych bioinformatyków, zajmujących się niełatwą analizą terabajtów danych. Zastosowanie NGS do diagnostyki in vitro musi także spełniać określone normy jakości, gwarantujące określone wartości graniczne parametrów analitycznych [1,2]. Według danych amerykańskich, pod koniec roku 2013 jedynie ok. 50 laboratoriów w całych Stanach Zjednoczonych posiadało możliwość wykonywania testów (certyfikowanych przez FDA) techniką NGS. Obecnie może to już być kilkaset placówek [3]. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Przyszłość jest teraz Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Illumina na przykład wypuściła gotowe testy przeznaczone na platformę MiSeq Dx, przeznaczone do diagnostyki mutacji warunkujących mukowiscydozę i wrodzone choroby serca. Chińska firma BGI specjalizuje się w produkcji testów przeznaczonych dla diagnostyki związanej z prokreacją – posiada w ofercie testy screeningowe na najczęstsze choroby genetyczne dla przyszłych rodziców czy też testy przesiewowe dla noworodków i niemowląt. Ich flagowym produktem jest zaś test Nifty do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, który można wykonać także w Polsce. Podobny test, Harmony, oferuje firma Ariosa Diagnostics. Kolejną ważną gałęzią diagnostyki, dla której dostępne są certyfikowane testy NGS, jest oczywiście onkologia. Propozycje Thermo Scientific pozwalają na przykład analizować mutacje w guzach litych, oraz ekspresję kilku newralgicznych onkogenów. Singapurska firma Vela wypuściła testy Sentosa SQ, które umożliwiają detekcję mutacji w komórkach czerniaka złośliwego, raka tarczycy, jelita grubego, raka płuca i białaczek. Inny test dla hematoonkologii, dedykowany dla diagnostyki chłoniaków, posiada w ofercie firma Invivoscribe. Służy on do wykrywania klonalności rearanżacji TCR i IGH. BGI w swojej ofercie posiada natomiast test przesiewowy do detekcji wariantów 21 genów predysponujących do zachorowania na raka jajników i sutka (w tym BRCA1 i 2). I co dalej? Podane przykłady nie wyczerpują długiej listy dostępnych obecnie zestawów diagnostycznych, a ich lista z dnia na dzień rośnie. NGS zyskuje uznanie szczególnie w badaniach mikrobiologicznych (genotypowanie wirusów, m.in. HIV, analizach epidemiologicznych i diagnostyce drobnoustrojów z płynów ustrojowych pacjenta) oraz w badaniach rearanżacji chromosomowych, które były dotychczas domeną cytogenetyków. Na etapie walidacji są testy skriningowe dla wielu jednogenowych chorób rzadkich, związanych zarówno z genomem jądrowym, jak i mitochondrialnym. Na chwilę obecną poważnym ograniczeniem technologii jest stopień skomplikowania analizy bioinformatycznej i wymóg otrzymania odpowiedniej gwarantowanej ilości odczytów dla analizowanych amplikonów, co powoduje, że firmy produkujące zestawy diagnostyczne nie wykorzystują całkowicie potencjału tego narzędzia (np. ograniczając się do panelu kilkudziesięciu wariantów genowych, zamiast umożliwić wykrywanie kilkuset lub kilku tysięcy mutacji) [4]. Prawdopodobnie nie ma takiego badania genetycznego, w którym nie znajdzie zastosowania głębokie sekwencjonowanie. Pytanie brzmi nie „czy”, ale „kiedy” technologia ta upowszechni się w każdej dziedzinie genetyki medycznej. * Bardzo rzadko korzysta się z metod porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) ze względu na wysoki koszt oraz MLPA, za sprawą jej niszowości. Pozwalają one na przezwyciężenie niektórych trudności, o których mowa w tekście Piśmiennictwo: 1. Pant S. et al. Navigating the Rapids: The Development of Regulated NextGeneration Sequencing-Based Clinical Trial Assays and Companion Diagnostics. Front Oncol, 2014; 4: 78. 2. Meldrum C.et al. Next-Generation Sequencing for Cancer Diagnostics: a Practical Perspective Clin Biochem Rev. 2011; 32, 4: 177–195. 3. Hughes MD. Molecular Diagnostics Market Trends and Outlook. IVD MarketReach, 2013. 4. Rizzo JM., Buck MJ. Key Principles and Clinical Applications of “NextGeneration” DNA Sequencing. Cancer Prevention Research, 2012. Nowy biomarker raka piersi Naukowcy z Augusta University donoszą, że analiza mutacji w obrębie genu GT198 ma duży potencjał diagnostyczny w nowotworach piersi oraz może pomóc w ustanowieniu nowego celu terapeutycznego. Przeprowadzono badania na grupie 254 kobiet ze zdiagnozowanym rakiem sutka. Mutacje w obrębie genu GT198 zaobserwowano w przypadku wczesnych stadiów raka piersi oraz jajnika. Naukowcy udowodnili, że gen o zdolnościach naprawczych DNA może z powodu mutacji przyspieszać rozwój raka. Mutacje GT198 odnotowano zarówno we krwi jak i w tkankach guza. Naukowcy wierzą, że mutacja genu indukuje wzrost guza nowotworowego. Mutacje linii zarodkowych w obrębie GT198 są obecne u chorych na raka piersi i jajnika. Mutacje somatyczne GT198 odnotowano już wcześniej w komórkach zrębu guza jajnika. W najnowszym badaniu udowodniono, że komórki zrębu guza piersi również posiadają mutacje somatyczne w obrębie GT198. Użyto produktu genu GT198 jako biomarkera raka piersi. GT198 znany jako TBPIP (ang. TBP-1 interacting protein) jest także koaktywatorem receptorów steroidowych. Jego aktywność jest regulowana przez estrogen. Mutacje w obrębie GT198 mogą wywoływać niekontrolowany wzrost guza nowotworowego bez wsparcia ze strony estrogenu. W tkance gruczołu piersiowego dotkniętej nowotworem naukowcy stwierdzali pojawianie się wielu problemów. Nie byli oni jednak w stanie w pełni wytłumaczyć zmian obserwowanych w obrębie adipocytów, fibroblastów, perycytów (komórki słabo zróżnicowane związane z siecią małych naczyń krwionośnych, mogą być wbudowywane w sieć naczyń w celu ich wzmacniania) czy komórek mioepitelialnych. Najnowsze badania dają podstawy tłumaczące odstępstwa od fizjologii, pokazując że mutacje GT198 bezpośrednio wpływają na komórki macierzyste znajdujące się w naczyniach krwionośnych, które tworzą poszczególne struktury gruczołu sutkowego. Zmutowane białko GT198 powodowało w hodowlach komórkowych aktywację czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor, VEGF), co może wpływać na angiogenezę i adipogenezę. To składa w całość obserwowane dotąd zmiany nowotworowe w sutku. Dzięki badaniom wyłania się także nowy cel terapeutyczny w leczeniu raka piersi. Wiemy, że mutacje GT198 wpływają na różne typy komórek zrębu tkanki piersi, ponieważ wszystkie one wywodzą się z komórek progenitorowych. Powstaje związek przyczynowo-skutkowy: zmutowane GT198 doprowadza do pojawienia się nieprawidłowych komórek różnego typu. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Kolejnym krokiem będzie rozwój terapii celowanych nie tylko w nowotworowo zmienione komórki, ale także w komórki progenitorowe, które z powodu mutacji genowych „zboczyły na złą drogę”. Pozwoli to na zniszczenie komórek odżywiających guz, co powinno być bardziej efektywne niż celowanie w same komórki nowotworowe. ** Autorzy w 2013 roku prowadzili badania nad mutacjami GT198 również w raku jajnika. Już wtedy wskazali oni na możliwość indukcji rozwoju nowotworu z powodu mutacji w genie GT198 . Jednymi z pierwszych znanych genetycznych czynników ryzyka raka piersi i jajnika były BRCA1 oraz BRCA2. Okazuje się, że 4% dziedzicznych raków piersi posiada także mutacje germinalne w obrębie GT198. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Yang Z. et al. GT198 Expression Defines Mutant Tumor Stroma in Human Breast Cancer. A J Path, 18 Mar 2016. Peng M. et al. Inactivating Mutations in GT198 in Familial and Early-Onset Breast and Ovarian Cancers.Genes Cancer, 2013; 4, 1-2: 15–25. Smartfony w onkologicznej diagnostyce Smartfona ma prawie każdy. Większość z nas nie wyobraża sobie bez niego życia. Kalendarz, notatnik, kalkulator, radio, aparat fotograficzny, kamera, stoper… i można by tak w nieskończoność wymieniać zastosowania tego małego urządzenia. Smartfony są przydatne w wielu dziedzinach naszego życia. Ostatnio zwrócono uwagę, że mogą zrewolucjonizować życie chorych ludzi. Coraz częściej słyszy się o wykorzystaniu smartfona jako glukometru, ultrasonografu czy przydatnego narzędzia w wykrywaniu depresji oraz chorób oczu. Niedawno badacze z The University of Texas Health Science Center w Houston wykorzystali smartfon w diagnostyce raków skóry. Zbudowali oni bowiem tani i łatwy w obsłudze mikroskop: przy użyciu smartfona, kulistego obiektywu, plastikowego elementu, w którym umieszcza się obiektyw i łączy go ze smartfonem oraz taśmy, zapewniającej stabilność wszystkich elementów. Wykorzystano metodę konstrukcji mikroskopu opracowaną przez Smith et al., a następnie zmodyfikowaną przez Bogoch et al. Naukowcy stwierdzili, że używając tego narzędzia w krajach rozwijających się można poprawić wykrywalność nowotworów złośliwych skóry. Przanalizowano ponad tysiąc slajdów, wśród których wykryto 136 raków podstawnokomórkowych, 94 raki płaskonabłonkowe i 15 czerniaków. Przy użyciu smartfona zdiagnozowano 95,6 % raków podstawnokomórkowych oraz 89 % płaskonabłonkowych i 60 % czerniaków (w porównaniu z mikroskopem świetlnym). Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Nowotwory skóry stanowią duży problem epidemiologiczny, ponieważ w ostatnich latach wzrosła liczba zachorowań. WHO donosi, że każdego roku na całym świecie zapadalność na czerniaka wynosi 132 000 osób, a na inne nowotwory skóry między 2 a 3 miliony ludzi. W niektórych rejonach kuli ziemskiej lekarze nie mają dostępu do odpowiedniego sprzętu, aby badać próbki skóry. Teraz wykorzystując swoje smartfony mogą sfotografować preparat i przekazać go do weryfikacji patologa lub ocenić samemu. Najnowsze badania to pierwszy krok, wierzchołek góry lodowej, który ma pokazać, że smartfon można wykorzystać w takich dziedzinach medycyny jak dermatologia czy patologia. Urządzenie posiada doskonałe właściwości użytkowe w zakresie niedrogiego diagnozowania raków skóry w warunkach, w których tradycyjny mikroskop nie jest dostępny. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby zwiększyć czułość nowatorskiego testu. mgr Natalia Grzegorzak, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Jahan-Tigh RR. et al. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 2016, 140(1): 86-90. Smith ZJ. et al. Cell-phone-based platform for biomedical device development and education applications. PLoS One 2011; 6(3): e17150. Bogoch II. et al. Mobile phone microscopy for the diagnosis of soil-transmitted helminth infections: a proof-of-concept study. Am J Trop Med Hyg 2013; 88(4):626–629. Nietoksyczne lekiem nanokapsułki z Liposomy mogą być używane w przemyśle farmaceutycznym jako nośniki leków. Niestety rozpoznawane są one jako obce antygeny przez układ odpornościowy. Bazując na dotychczasowej wiedzy na ich temat, naukowcy z uniwersytetu w Bazylei i Fryburgu pokazali, że specjalnie spreparowane przez nich liposomy nie wywołują szkodliwych dla zdrowia reakcji. Liposomy to małe, kuliste struktury, zbudowane z dwuwarstwy lipidowej. Dzięki wyjątkowym cechom można ich używać jako mikroskopijnych kapsułek na leki. Są one przede wszystkim biokompatybilne czyli zbudowane z takich samych składników jak błony komórek naszego organizmu. Ich niewielkie rozmiary pozwalają naprzechodzenie przez ściany naczyń krwionośnych w miejscach rozwijania się stanu zapalnego, gdzie przestrzenie międzykomórkowe są większe. Dzięki temu możliwy jest tzw. pasywny targeting czyli bierna akumulacja liposomów w miejscu docelowym np. w regionie występowania guza nowotworowego, infekcji bakteryjnej czy wirusowej. Ponadto mają one długi okres półtrwania wynoszący od kliku godzin – tzw. klasyczne liposomy, do kilku dni – tzw. liposomy długokrążące, co z kolei pozwala na utrzymanie stałego poziomu leku we krwi. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Obecnie stosowane technologie pozyskiwania nośników leków na bazie liposomów wciąż nie są do końca satysfakcjonujące. Nie wiadomo jaki procent liposomów wchłaniają np. komórki nowotworowe. Problemem jest także reakcja organizmu na liposomy. Wychodząc naprzeciw potrzebom naukowcy z Uniwersytetu we Frubyrgu opracowali soczewkową formę liposomu, która pozwala na efektywne dostarczanie leku do zwężonych tętnic wieńcowych. Krew płynie przez zwężenia naczyń z dużą prędkością. W tych warunkach liposomy otwierają się i uwalniają swoją zawartość. Z powodu faktu, iż nasz układ odpornościowy rozpoznaje liposomy jako ciała obce, może to prowadzić do powstania skutków ubocznych takich jak szok anafilaktyczny. W związku z tym naukowcy skoncentrowali się na stworzeniu sztucznych fosfolipidowych pęcherzyków, tzw. Pad-PC-Pad vesicles, jako maleńkich “kapsułek” z lekiem. Osiągnięto sukces – zaprojektowane liposomy nie wywołały aktywacji składowych dopełniacza w surowicy ludzkiej i świńskiej w warunkach in vitro. Idąc dalej, przetestowano liposomy Pad-PC-Pad in vivo, na żywych organizmach. W tym celu wstrzyknięto je świniom i monitorowano różne parametry życiowe takie jak tętno, ciśnienie krwi oraz wykonano EKG. Nawet wysokie dawki nie wywołały niekorzystnych reakcji. Co więcej, biopsja nerek, płuc, serca i wątroby zwierząt potwierdziły brak toksycznych zmian. Badania in vitro oraz in vivo potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji anafilaktycznych, co rzutuje pozytywnie na przyszłość leczenia miażdżycy i innych schorzeń za ich pomocą. Według WHO choroba wieńcowa odpowiada aż za 30% zgonów na świecie. Skala problemu uwidacznia potrzebę wyprodukowania wydajnych leków możliwych do zastosowania w segmencie pozaszpitalnym. Pęcherzyki PadPC-Pad, ze względu na swoją bezinwazyjność i brak aktywowania odpowiedzi immunologicznej organizmu, są idealnym kandydatem na zastosowanie ich jako nośników leków. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Bugna S. et al. Surprising lack of liposome-induced complement activation by artificial 1,3-diamidophospholipids in vitro. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2016; 12. Synteza skutecznego związku przeciwnowotworowego Zespół badawczy z Rice University opracował sposób syntezy związków o wysokim potencjale antynowotworowym jakim są trioksakarcyny. Trioksakarcyny zostały odkryte podczas hodowli szczepu Streptomyces bottropensis na podłożu fermentacyjnym. Wszystkie trioksakarcyny (A-F) są metabolitami Streptomyces sp. Mają one właściwości przeciwbakteryjne, a niektóre z nich wykazują cechy przeciwnowotworowe i przeciwmalaryczne. W chwili obecnej nie ma leków opracowanych na bazie trioksakarcyn. Trioksakarcyna uszkadza DNA poprzez nowy mechanizm. Wiąże się ona z DNA komórek docelowych (np. komórek nowotworowych) i chemicznie modyfikuje materiał genetyczny, zaburzając proces ich replikacji. W badaniu naukowców z Rice University trioksakarcyny DC-45-A2, DC-45-A1, A, D, C7″-epi-C oraz C zostały zsyntetyzowane poprzez reakcje stereoselektywne wliczając w nie reakcje katalizowane przez eterat dietylowy trifluorku boru czy glikozylacje katalizowane złotem. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Naukowcy podkreślają, że trioksakarcyna ma wysoki potencjał przeciwnowotworowy i mimo tego, że jej działanie nie jest tak silne jak niedawno zsyntetyzowanej sisomycyny (antybiotyk z grupy aminoglikozydów, o działaniu przeciwnowotworowym, hamuje gen FoxM1), jest ono dużo silniejsze niż działanie taksolu (cytostatyczny diterpen cisów), obecnie szeroko wykorzystywanego w leczeniu raka (głównie w terapii raka jajnika, sutka, płuca, jądra, nowotworów w obrębie głowy i szyi). Dotychczasowe spostrzeżenia kierują zespół ku poprawieniu struktury trioksakarcyny poprzez syntezę analogu pożądanego związku, co polepszyłoby jego właściwości i zmniejszyło ilość efektów ubocznych. Trwają prace nad utworzeniem koniugatów związków cytotoksycznych ze specyficznymi przeciwciałami celowanymi w komórki nowotworowe. Jest to jedno z ważniejszych wyzwań spersonalizowanej chemioterapii. Udało się dokonać replikacji rzadkich, naturalnie występujących u bakterii związków. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie większych ilości substancji i poddania ich dalszym dogłębnym analizom, między innymi związanym z dokładnym poznaniem ich budowy. Nowo rozwinięta technologia pozwoli na skonstruowanie odmian biologicznych związków celem zoptymalizowania ich profili farmakologicznych. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Nicolaou KC. et al. Total Synthesis of Trioxacarcins DC-45-A1, A, D, C, and C7″epi-C and Full Structural Assignment of Trioxacarcin C. J Am Chem Soc, 2016; 138 , 9: 3118–3124. Maskey RP. et al. Anti-cancer and antibacterial trioxacarcins with high antimalaria activity from a marine Streptomycete and their absolute stereochemistry. J Antibiot, 2004; 57,12:771-779. Rusza pierwsza w Polsce poradnia bioetyczna 19 marca w Krakowie zostanie uruchomiona Poradnia Bioetyczna. Jest ona adresowana do specjalistów i osób prywatnych potrzebujących pomocy w rozwiązaniu trudnych dylematów bioetycznych. Zapytania dotyczące między innymi tematyki badań na pacjentach, bioetyki w diagnostyce, zapłodnienia in vitro, pracy z embrionalnymi komórkami macierzystymi, badań na ludzkich embrionach, uporczywej terapii, eutanazji, etc. – można składać drogą elektroniczną lub poprzez kontakt osobisty. Organizatorami inicjatywy są Międzywydziałowy Instytut Bioetyki Uniwersytetu Papieskiego Jana Pawła II w Krakowie i fundacja Jeden z Nas. W Poradni będzie można też konsultować aspekty bioetyczne dotyczące transplantacji, etyki lekarskiej, a także opieki nad pacjentem w stanach terminalnych. W ramach działania poradni będzie można również uzyskać bezpłatną poradę prawną. Kto udziela porad? Porad w zakresie bioetyki udzielać będzie wykwalifikowany zespół bioetyków, wśród których znajdują się pracownicy służby zdrowia (lekarze, pielęgniarki, farmaceuci), prawnicy, teolodzy i filozofowie. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Jak uzyskać poradę? Poradnia Bioetyczna będzie świadczyła swoje usługi nieodpłatnie. Informacje lub poradę będzie można uzyskać osobiście w siedzibie poradni przy ul. Bernardyńskiej 3 w Krakowie lub elektronicznie, za pomocą formularza dostępnego na stronie www.poradniabioetyczna.pl . W przyszłości poradnia planuje uruchomienie poradnictwa drogą telefoniczną. Sen lekarstwem nie tylko na chandrę Statystycznie człowiek przesypia około 20 lat swojego życia. Śpimy średnio od 6 do 8 godzin w nocy. Noworodki potrzebują aż 18 godzin snu w ciągu doby. Im jesteśmy starsi, tym bardziej zmniejsza się zapotrzebowanie na sen, a tym samym zwiększa się zapadalność na nowotwory i infekcje. Wiąże się to z osłabioną funkcją układu odpornościowego. Najnowsze badania sugerują, że regularny sen w odpowiedniej ilości jest równie niezbędny jak prawidłowa dieta i ćwiczenia fizyczne. Gdy śpimy nasz organizm nie próżnuje. Odbywa się regeneracja tkanek, wzrost, przebiegają procesy, dzięki którym odzyskujemy energię, a mózg i układ odpornościowy mogą sprawnie funkcjonować. Naukowcy przedstawiają coraz więcej dowodów, że brak snu zaburza pracę całego organizmu. Niewyspanie niesie ze sobą wiele konsekwencji dla zdrowia, szczególnie psychicznego. Osoby, chronicznie niewyspane czy cierpiące na bezsenność są bardziej podatne na wystąpienie zaburzeń nastroju, takich jak depresja. Ponadto są przewlekle zmęczone, mają trudności w skupieniu uwagi i spowolnione reakcje na bodźce. Dotychczas naukowcy nie byli w stanie zidentyfikować mechanizmu molekularnego, który mógłby wyjaśnić, jak zmiany rytmu snu i czuwania promują zaburzenia nastroju. Związek między naszym samopoczuciem, a biologicznym zegarem, który determinuje czas snu i czuwania, wykazali dopiero badacze z Howard Hughes Medical Institute. PER3 jest molekularnym łącznikiem między naszym nastrojem a zegarem biologicznym. Zainteresowanie naukowców wzbudziły wyniki badań członków pewnej rodziny, cierpiących z powodu zaburzeń faz snu (ang. familial advanced sleep phase, FASP). Wystąpiły u nich oznaki choroby afektywnej sezonowej. Te zaburzenia nastroju polegają na tym, że ludzie chorują okresowo na depresję, zwykle w okresie zimowym, gdy dni stają się krótsze. Badacze udowodnili, że u osób z FASP występuje wadliwa wersja genu PER3. Wymieniony gen jest naszym dobowym zegarem. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Aby zbadać rolę genu w zaburzeniach nastroju wykorzystano genetycznie zmodyfikowane myszy. Zwierzęta miały uszkodzone oba allele genu PER3. Obserwowano ich aktywność w kołach do biegania. Kiedy gryzonie miały zapewnione 12 godzin światła dziennie, nie było różnic w aktywności myszy zmodyfikowanych i kontrolnych. Następnie naukowcy symulowali, co się dzieje podczas krótkich dni zimowych, zapewniając gryzoniom zaledwie cztery godziny światła dziennie. W tych warunkach zmodyfikowane genetycznie myszy były aktywne cztery godziny później niż zwierzęta zdrowe, co sugeruje, że wadliwa wersja PER3 przesuwa rytmy dobowe zwierząt. Zespół odkrył również, że myszy te, podobnie jak ludzie z mutacją PER3, miały zaburzenia snu i depresję. Nie od dziś wiadomo, że istnieje związek między snem, a depresją, ale dotychczas nie odkryto co je łączy. Wyniki badań nie wskazują na konkretną terapię zaburzeń nastroju, ale mogą prowadzić naukowców w dobrym kierunku. Lepsze zrozumienie tych procesów umożliwi opracowanie nowych leków stosowanych w terapii zaburzeń nastroju. mgr Natalia Grzegorzak, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Zhang L. et al. A PERIOD3 variant causes circadian phenotype and is associated with a seasonal mood trait. PNAS, 4 Jan 2016. Rewolucyjny system produkowania morfiny przez E.coli Zapotrzebowanie na środki uśmierzające ból nie słabnie. Co więcej, metody ich pozyskiwania na drodze ekstrakcji z opium nie są aktualnie wystarczająco wydajne, a w przyszłości mogą nie sprostać wysokiemu zapotrzebowaniu. Naukowcy nieustannie poszukują skutecznego sposobu pozyskiwania pożądanych opiatów. Wydawać by się mogło, że grupa badawcza z Uniwersytetu Stanforda ze swoim nowo opracowanym systemem drożdży piekarskich w końcu zrewolucjonizuje rynek, ale ostatnie osiągnięcie w tej dziedzinie z użyciem E.coli nie pozostawia sobie równych. Za nowym wynalazkiem stoi grupa japońskich badaczy z Ishikawa Prefectural University i Kyoto University, która zmodyfikowała kilka kluczowych genów w bakterii E.coli, aby zwiększyć produkcję prekursorów morfinowych, takich jak tebaina. „Bakteryjna” technologia jest 300 razy bardziej wydajna niż ta opracowana na bazie drożdży. Zmodyfikowane bakterie E.coli potrafią wyprodukować aż 2,1 mg tebainy z około 20 gramów cukru, co jest bardzo dobrym wynikiem w porównaniu do drożdży, które w tych samych warunkach produkują tylko 0,0064 mg tebainy. Japońscy naukowcy podkreślają też ważny aspekt bezpieczeństwa ich technologii. Budowa chemiczna morfiny jest bardzo złożona, a jej produkcja i pochodnych związków przeciwbólowych jest kosztowna i czasochłonna. Tradycyjną metodą otrzymywania morfiny jest jej ekstrakcja z opium (substancja otrzymywana przez wysuszenie soku mlecznego z niedojrzałych makówek maku lekarskiego). Jednym z wybitnych osiągnięć bioinżynierii ostatnich miesięcy było wykorzystanie drożdży Saccharomyces cerevisae do produkcji prekursorów morfiny. Jednakże, aby wyprodukować potrzebną ilość hydrokodonu (środka uśmierzającego ból o działaniu zbliżonym do morfiny) dla jednej tabletki Vicodinu potrzeba by było 4 400 galonów (16,65 m3) drożdży. Ponadto inną niedoskonałością było to, że produkcja może być prowadzona w niekontrolowany sposób, jeśli tylko zainteresowany uzyska dostęp do odpowiedniego szczepu drożdży. W przypadku E.coli, nie tylko wydajność produkcji jest 300 razy większa, ale też ryzyko nadużycia jest znikome, bowiem do produkcji wymagane są aż cztery szczepy bakterii. Każdy szczep, w odpowiednio zmodyfikowany sposób, jest odpowiedzialny za produkcję w wysokich ilościach związku, który jest substratem do kolejnej reakcji z czterostopniowego procesu produkcji tebainy. Ponadto, praca E.coli wymaga odpowiedniego doświadczenia, wprawy i laboratoryjnego fachu. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Naukowcy mają nadzieję na ulepszenie opracowanej technologii. We wcześniejszych badaniach zoptymalizowali oni E.coli do produkcji retikuliny – innego prekursora morfiny. Naukowcy do pałeczki okrężnicy dodali geny z Arabidopsis thaliana i Coptis japonica i jak przyznają, kluczowymi graczami są tu wysokiej aktywności enzymy, które wydajnie katalizują produkcję tebainy. Dzięki jasnym wytycznym i regulacjom rynku farmaceutycznego produkcja morfinopodobnych środków przeciwbólowych z mikroorganizmów wkrótce może stać się rzeczywistością. Adrianna Grzelak Piśmiennictwo: Nakagawa A. et al. Total biosynthesis of opiates by stepwise fermentation using engineered Escherichia coli. Commun., 2016; 7: 1-8. Anty CD73 – nowa nadzieja w terapii przeciwnowotworowej Po okresie sceptycyzmu immunoterapia w leczeniu nowotworów powraca do łask. Dzięki intensywnym badaniom nad zrozumieniem skomplikowanych oddziaływań układu odpornościowego w walce z nowotworem udało się zidentyfikować kluczowe molekuły decydujące o kierunku tych interakcji. Nadzieją na skuteczniejszą walkę z nowotworem są przeciwciała celowane w ekto-5’-nukleotydazę, znaną pod nazwą CD73. Immunoterapia pierwszej generacji (molekułami IFN-α i IL-2) stosowana była przez wiele dekad w leczeniu zaledwie kilku typów nowotworów. Terapie te nie wykazywały wystarczającej skuteczności, gdyż nie cechowały się specyficznością, czego wynikiem były liczne skutki uboczne u pacjentów im poddanych. Immunoterapia drugiej generacji cechuje się większymi możliwościami bazującymi na dokładniejszym poznaniu środowiska nowotworowego. W środowisku nowotworowym panują surowe warunki, w których aby dana komórka przetrwała musi reprogramować swoją maszynerię metaboliczną. W przypadku komórki rakowej jedną z ważniejszych i wpływowych zmian jest zwiększona ekspresja ekto-5’-nukleotydazy. Jest to enzym kataboliczny, który odgrywa decydującą rolę w progresji nowotworu poprzez nadprodukcję pozakomórkowej adenozyny. Poprzez interakcje ze specyficznymi GPI (zakotwiczonymi receptorami) adenozyna nadaje nowy kształt komórkom w otoczeniu nowotworowym, jednocześnie rozregulowując system odpornościowy i promując unaczynienie nowotworu. W ten sposób nowotwór może łatwo dawać przerzuty. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 W terapii celowanej przeciw CD73 stosuje się małej masy cząsteczkowej inhibitory takie jak APCP (adenozyno-5′-(α,β-methylene)difosforan, analog adenozyno-5′difosforanu), których zaletami są m.in. łatwa doustna aplikacja leku, lepsze oddziaływanie na mikrośrodowisko nowotworu, możliwość różnicowania receptur leku na potrzeby farmakokinetyczne i farmakodynamiczne oraz niskie koszty zakupu leku. Z kolei przeciwciała monoklonalne wykazują wyższą specyficzność i dłuższy okres półtrwania w porównaniu do inhibitorów. Ponadto nieocenioną zaletą użycia przeciwciał jest fakt, że celują one nie tylko w działanie katalityczne CD73, ale także inne czynniki, które pełnią istotną rolę w metastazie. Różnica w stosowaniu odpowiedniego leku bazuje na typie nowotworu – przeciwciała CD73 sprawdzą się lepiej w walce z inwazyjnym nowotworem, podczas gdy terapia inhibitorami będzie bardziej skuteczna w leczeniu nieinwazyjnego typu. Niezależnie od typu leku blokada CD73 stanowi doskonały cel terapeutyczny w walce z nowotworami. W szczególności pozwoli ona na zwiększenie skuteczności nowatorskich terapii bazujących na manipulacji efektorowych limfocytów T poprzez blokadę punktów kontrolnych układu immunologicznego przeciwciałami takimi jak ipilimuman (przeciwciało anty-CTLA 4) i nivoluman, (przeciwciało anty-PD1). Aby poszerzyć zakres działania i skuteczności terapii wiele badań wskazuje na połączenie powyższych dwóch sposobów z tradycyjnymi metodami leczenia nowotworu (radioterapia, chemioterapia i inne). Ponadto, relacja pomiędzy nadekspresją CD73 i typem raka, a także prognoza i reakcja pacjenta na chemioterapię, wspierają potencjalną wartość CD73 jako biomarkera w spersonalizowanej terapii nowotworowej. Pomimo wielu obiecujących perspektyw, jak każdy naturalnie występujący związek w organizmie człowieka, białko CD73 pełni także znaczące funkcje w procesach takich jak bariera nabłonkowa, regulacje procesów resorpcji i wydzielania na poziomie jelitowym. Chociaż badania na myszach pozbawionych CD73 lub leczonych lekami anty CD73 nie pokazały znaczących skutków ubocznych, to wdrażając nowy lek w fazę badań klinicznych, należy zachować ostrożność. Terapia anty CD73 może wywołać u pacjenta nadmierną aktywność układu odpornościowego, co z kolei grozi zwrotem przeciw własnemu organizmowi i wywołaniem różnego rodzaju chorób autoimmunologicznych. Zachęcające wyniki badań faz przedklinicznych pozwalają szacować, że terapie przeciw CD73 wkrótce wejdą w fazę badań klinicznych. Obecnie celem naukowców jest wyprodukowanie przeciwciał humanizowanych. Wstępne wyniki pokazują, iż jeden z leków anty CD73 (MEDI9447) może zostać użyty w terapii w połączeniu z anty PD-1 u pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi. Nie ulega wątpliwości, że wykorzystanie CD73 w immunoterapii nowotworowej jest gorącym tematem w środowisku naukowym. Daje to nadzieję, że dzięki nowym możliwościom i opracowaniu nowatorskich terapii coraz więcej walk z rakiem skończy się wygraną pacjenta. Adrianna Grzelak Piśmiennictwo: Antonioli L. et al. Anti-CD73 in Cancer Immunotherapy: Awakening New Opportunities. Trends in Cancer, 2016; 2, 2: 95-106. Przebiegłe komórki nowotworowe Najnowsze badania wskazują, że komórki nowotworowe mogą wpływać na otaczające zdrowe komórki zmuszając je do produkcji zwiększonej ilości białek wspierających wzrost naczyń krwionośnych guza. Nowoczesne nauki znane jako proteomika i transkryptomika pomogły zrozumieć nieprawidłowości w procesach molekularnych komórek, które prowadzą do rozwoju nowotworu. Warto wspomnieć, że transkrypromika zajmuje się określeniem miejsca i czasu aktywności genów poprzez badanie transkryptomu, natomiast proteomika bada strukturę, funkcje i zależności między białkami. Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0 Naukowcy z Institute of Cancer Research w Londynie oraz Cancer Research UK Beatson Institute w Glasgow w oparciu o tą wiedzę odkryli, że sedno problemu może tkwić w tRNA. Sugeruje się, że tRNA inicjator obciążony metioniną (tRNAiMet) odgrywa istotną, aczkolwiek zaskakującą rolę – wpływa na produkcję białka kolagenowego, które promuje angiogenezę w guzie. W zdrowych tkankach fibroblasty wytwarzają kolagen, zwykle typu 1. Okazało się, że fibroblasty znajdujące się w pobliżu guzów nowotworowych wytwarzają kolagen typu 2, znacząco wspierając wzrost naczyń krwionośnych w zmianie. Przeprowadzono różne badania na ludzkich i mysich fibroblastach, a także na prawidłowych i nowotworowych tkankach pobranych od chorych na raka piersi. Odkryto, że fibroblasty aktywowane przez guzy złośliwe miały wyższy niż w tkankach prawidłowych poziom tRNAiMet oraz niektórych białek takich jak kolagen typu 2. Uzyskane rezultaty wskazują że podwyższony poziom tRNAiMet przyczynia sie do progresji nowotworowej poprzez zwiększenie zdolności fibroblastów zrębu do syntezy i wydzielania macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w kolagen typu 2, który z kolei wspiera migrację komórek nabłonkowych i angiogenezę. Naukowcy podkreślają kluczową rolę środowiska otaczającego guz w jego rozwoju, sugerując że nowotworzenie jest czymś więcej niż wzrostem produkcji białek celem zwiększenia ilości komórek tworzących guz. Wśród głównych wniosków wynikających z badania wymienia się związek między tRNA a progresją nowotworu oraz pomiędzy tRNA a sekrecją macierzy międzykomórkowej przez fibroblasty zrębu, selektywną kontrolę sekretomu przez zmiany poziomu tRNAiMet, a także powstanie nowego transgenicznego modelu reasumującego główne aspekty nowotworowego tRNA. Odkrycie może utorować drogę dla nowych możliwości terapeutycznych takich jak leki zaprojektowane do zaburzania zdolności nowotworu do manipulowania otaczającym je środowiskiem. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Clarke CJ. et al. The Initiator Methionine tRNA Drives Secretion of Type II Collagen from Stromal Fibroblasts to Promote Tumor Growth and Angiogenesis. Curr Biol, 3 Mar 2016.
