docAutoreferat - BIOL-CHEM UWB
download 
Reklamacja Transkrypt
Autoreferat - BIOL-CHEM UWB
Załącznik 2 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH AUTOREFERAT |2 IMIONA I NAZWISKO: Katarzyna Anna Jadwiszczak DATA I MIEJSCE URODZENIA: 17.02.1970 r. w Białymstoku ADRES: Instytut Biologii UwB, ul. Świerkowa 20B, 15-950 Białystok; tel. +48 85 745 72 90; fax +48 85 745 73 01; e-mail: [email protected] PRZEBIEG KSZTAŁCENIA, POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE: 2002: doktor; Instytut Biologii Uniwersytetu w Białymstoku; praca doktorska pt. „Struktura chromosomowa strefy hybrydyzacji ras Drnholec i Białowieża ryjówki aksamitnej, Sorex araneus Linnaeus, 1758” (promotor: prof. dr hab. Stanisław Fedyk) 1994: magister; Instytut Biologii, Filia Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku, praca magisterska pt. „Przebieg i szerokość strefy kontaktu między rasami chromosomowymi ryjówki aksamitnej (Sorex araneus L.) w okolicach Olsztynka” (promotor: prof. dr hab. Marek Gębczyński) 1989-1994: Filia Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku, Wydział MatematycznoPrzyrodniczy, Instytut Biologii 1985-1989: VI Liceum Ogólnokształcące im. Króla Zygmunta Augusta w Białymstoku ZATRUDNIENIE W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH 1. Od października 2003: Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytut Biologii, Uniwersytet w Białymstoku; adiunkt 2. Lipiec 1994 – wrzesień 2003: asystent w Zakładzie Zoologii Kręgowców i Genetyki, potem w wydzielonym Zakładzie Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytutu Biologii Uniwersytetu w Białymstoku (wcześniej Filii Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku) 3. Luty 1994 – czerwiec 1994: student-stażysta w Zakładzie Zoologii Kręgowców i Genetyki, Instytut Biologii, Filia UW w Białymstoku; staż jednocześnie z V rokiem studiów AUTOREFERAT |3 AUTOREFERAT Urodziłam się w Białymstoku w 1970 r. W latach 1985-1989 uczęszczałam do VI Liceum Ogólnokształcącego w Białymstoku, do klasy ogólnej z rozszerzonym kursem języka rosyjskiego. W 1989 r. zdałam egzaminy na kierunek biologia nauczycielska w Instytucie Biologii (IB), ówczesnej Filii Uniwersytetu Warszawskiego (FUW) w Białymstoku, gdyż pragnęłam w przyszłości zostać nauczycielką. Częściowo te plany się spełniły, bo jako studentka V roku pracowałam w Szkole Podstawowej nr 24 w Białymstoku. Z pracy w szkole zrezygnowałam na rzecz stażu w Zakładzie Zoologii Kręgowców i Genetyki IB FUW, gdzie prowadziłam badania w ramach pracy magisterskiej. Pracę magisterską pt. „Przebieg i szerokość strefy kontaktu między rasami chromosomowymi ryjówki aksamitnej (Sorex araneus L.) w okolicach Olsztynka” obroniłam w czerwcu 1994. Promotorem mojej pracy był prof. dr hab. Marek Gębczyński. Tematyka pracy magisterskiej była naturalną konsekwencją mojej działalności w Kole Naukowym Biologów (KNB), do którego zapisałam się na I roku studiów. Studenci z KNB uczestniczyli i pomagali w badaniach pracownikom naukowym IB, a jednym z głównych realizowanych w tym okresie tematów była zmienność chromosomowa ryjówki aksamitnej. Realizacją tego tematu zajmował się prof. dr hab. Stanisław Fedyk. Po studiach zostałam asystentką w macierzystym zakładzie. W 2002 r. obroniłam doktorat pt. „Struktura chromosomowa strefy hybrydyzacji ras Drnholec i Białowieża ryjówki aksamitnej, Sorex araneus Linnaeus, 1758” w Instytucie Biologii Uniwersytetu w Białymstoku. Promotorem mojej rozprawy doktorskiej był prof. dr hab. Stanisław Fedyk. Obecnie pracuję na stanowisku adiunkta. Jestem autorką lub współautorką 31 prac naukowych: 28 prac opublikowanych w czasopismach z tzw. listy filadelfijskiej, dwóch anglojęzycznych publikacji spoza tej listy, anglojęzycznego rozdziału w monografii, a także jednego artykułu popularyzatorskiego [Załącznik nr 3]. Łącznie moje prace były cytowane 204 razy (bez autocytacji 167 razy). Indeks Hirscha został policzony dla moich dwóch nazwisk, poprzedniego – Szałaj i obecnego – Jadwiszczak, i wyniósł 8 (Web of Science; 17.03.2014 r.). Sumaryczny wskaźnik IF dla moich artykułów wyniósł 33,142. Zdecydowana większość publikacji powstała w ramach uzyskanych grantów krajowych. Uczestniczyłam łącznie w sześciu grantach, w trzech z nich byłam kierownikiem. Część publikacji, w których jestem pierwszym autorem lub współautorem, to efekt współpracy ze specjalistami zagranicznymi: dr Agnés Horn z University of Lausanne w Szwajcarii oraz dr. Olegiem V. Sozinovem z Państwowego Uniwersytetu im. Janki Kupały w Grodnie na Białorusi. Współpraca z dr. Sozinovem zaowocowała opublikowaniem trzech AUTOREFERAT |4 artykułów (Plant Systematics and Evolution, Tree Genetics and Genomes, Plant Ecology & Diversity) oraz znalezieniem nowego dla Białorusi gatunku storczyka Ophrys insectifera (http://sb.by/files/MT/09/N28/06.pdf). Współpracowałam także z dr. Mladenem Vujoševićem z Institute for Biological Research „Siniša Stanković” w University of Belgrade w Serbii, gdzie w 1997 r. badaliśmy zmienność chromosomową różnych gatunków Soricomorpha z terenu Serbii. Wyniki dotychczasowych badań prezentowałam w formie wystąpień ustnych (byłam pierwszym autorem ośmiu referatów) i posterowych na konferencjach i warsztatach międzynarodowych i krajowych [Załącznik 3]. Mój udział w zjeździe International Sorex araneus Cytogenetics Committee (ISACC) w St.-Petersburgu w 2005 r. był możliwy dzięki otrzymaniu stypendium Towarzystwa Naukowego Warszawskiego i Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej. W trakcie swojej pracy prowadziłam wykłady, laboratoria i konwersatoria na jednolitych studiach magisterskich, na studiach I i II stopnia biologii ogólnej, molekularnej i środowiskowej, na kierunku ochrona środowiska oraz dla słuchaczy studium podyplomowego z biologii. Byłam opiekunem naukowym siedmiu prac magisterskich i trzech licencjackich. Zajmowałam się także kształceniem doktorantki Politechniki Białostockiej w technikach molekularnych w ramach jej stażu finansowanego z Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki [Załącznik 3]. Pełniłam również obowiązki związane z organizacją nauki. W ramach działalności organizacyjnej recenzowałam manuskrypty dla Acta Theriologica i Revista Brasileira de Entomologia, rozdziały do anglojęzycznej monografii wydanej przez Białostocki Oddział Polskiego Towarzystwa Botanicznego oraz grant dla Czech Science Foundation. Byłam dwukrotnie członkiem Rady Instytutu Biologii, raz członkiem Rady Wydziału i raz członkiem Kolegium Elektorów Uniwersytetu w Białymstoku. Przez trzy lata pełniłam funkcję sekretarza Komisji Rekrutacyjnej w Instytucie Biologii UwB. Od 2009 r. jestem koordynatorem programu Erasmus w Instytucie Biologii. Prowadzenie przeze mnie badań na Białorusi zaowocowało nawiązaniem kontaktów z dyrekcją Państwowej Instytucji Środowiskowej „Berezinskij Biosfernyj Zapovednik” i podpisaniem umowy o wzajemnej współpracy między PIŚ a UwB. Od 2009 r. jestem członkiem Polskiego Towarzystwa Botanicznego (PTB). W latach 20102013 pełniłam funkcję sekretarza Komisji Rewizyjnej Białostockiego Oddziału PTB, w obecnej kadencji jestem przewodniczącą tej komisji. Ponadto, od 2013 r. jestem sekretarzem Sekcji Dendrologicznej PTB, która wznowiła działalność na 56 Zjeździe PTB w Olsztynie. Moje początkowe zainteresowania naukowe związane były ze zmiennością chromosomową ryjówki aksamitnej Sorex araneus. W kariotypie ryjówki występuje 40 ramion chromosomowych, które Międzynarodowy Komitet Badań Chromosomów Sorex araneus AUTOREFERAT |5 (ISACC) oznaczył małymi literami alfabetu łacińskiego od a do u (Searle i in. 1991, Mém. Soc. Vaud. Sc. Nat. 19). Ramiona te mogą pozostawać niepołączone (chromosomy jednoramienne, akrocentryki) lub na skutek fuzji centrycznych (Robertsona) tworzyć chromosomy dwuramienne (metacentryki). Występowanie w populacji różnych morfów chromosomowych (homozygot metacentrycznych, prostych heterezygot Robertsona, homozygot akrocentrycznych) określa się mianem polimorfizmu. Grupa sąsiadujących geograficznie lub niedawno rozdzielonych populacji, charakteryzująca się takim samym zespołem metacentryków i akrocentryków, stanowi rasę chromosomową (Hausser i in. 1994, Folia Zool. 43). Dotychczas w zasięgu ryjówki opisano ponad 70 ras chromosomowych (Wójcik i in. 2003, Mammalia 68; White i in. 2010, Syst. Biol. 59). Ze względu na zjawiska polimorfizmu oraz zróżnicowania rasowego, ryjówka aksamitna jest jednym z modelowych gatunków do badania ewolucyjnych konsekwencji zmienności kariotypowej. Jako magistrantka, a następnie pracownik Zakładu Zoologii Kręgowców i Genetyki, z którego w 1996 r. wydzielił się Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, byłam członkiem zespołu zajmującego się problematyką udziału zmienności chromosomowej w procesie specjacji, badaniem zależności między komplikacją kariotypu a płodnością i morfologią osobników oraz analizą modyfikacji struktury stref hybrydyzacji międzyrasowej u S. araneus ułatwiających przepływ genów między kontaktującymi się rasami. Analiza procesów przebiegających w strefach hybrydyzacji nie byłaby możliwa bez wcześniejszego opisu ras i ich zasięgów. Prowadząc badania w widłach Wisły i Nogatu, stwierdziliśmy na tym terenie nową rasę chromosomową ryjówki, którą nazwaliśmy Nogat. Rasa ta charakteryzuje się najwyższą frekwencją autosomów spośród ras ryjówki opisanych w Polsce [Załącznik 3, publikacja nr 7]. Jej obecność na tym obszarze jest zgodna z hipotezą, że w populacjach marginalnych S. araneus przeważają chromosomy akrocentryczne. Nie wykazaliśmy zróżnicowania genetycznego między czterema populacjami rasy Nogat w loci allozymatycznych. Z kolei, na podstawie analizy kompleksów mejotycznych powstających u hybrydów ryjówki zweryfikowaliśmy zasięgi występowania ras Stobnica i Drnholec w Polsce [11]. Te dwie rasy mają bardzo podobne kariotypy, różniące się tylko jednym małym metacentrykiem. Analiza preparatów mejotycznych dostarczyła niezbitych dowodów, że zasięg rasy Drnholec jest znacznie większy niż dotąd przypuszczano. Ryjówki tej rasy występują na południu, południowym-zachodzie i centrum naszego kraju i wchodzą w kontakt z rasami Białowieża na wschodzie oraz Popielno, Guzowy Młyn i Laska na północy. Nie udało nam się potwierdzić obecności rasy Stobnica. Jeżeli ta rasa istnieje, to zapewne ma bardzo ograniczony zasięg. Na obszarze Polski zmapowano 11 ras chromosomowych ryjówki aksamitnej należących do dwóch grup kariologicznych: Wschodnio-Europejskiej Grupy Kariologicznej AUTOREFERAT |6 (EEKG) i Zachodnio-Europejskiej Grupy Kariologicznej (WEKG; Wójcik 1993, Acta Theriol. 38), co sprawia, że na terenie naszego kraju występują liczne strefy hybrydyzacji S. araneus, będące „naturalnymi laboratoriami” do badania zjawisk ewolucyjnych. Podstawą tych badań jest opis struktury chromosomowej stref kontaktu międzyrasowego. Celem mojej pracy magisterskiej było określenie przebiegu oraz szerokości strefy kontaktu ras Stobnica (obecnie Drnholec) i Łęgucki Młyn w okolicach Olsztynka. Uzyskane przeze mnie wyniki, poszerzone o dane zebrane tuż po obronie pracy magisterskiej, zostały zawarte w publikacji nr 6 [Załącznik 3]. W pracy tej wykazaliśmy wzrost częstości osobników o kariotypie zrekombinowanym w centrum strefy hybrydyzacji. Nagromadzenie rekombinantów odbywa się kosztem frekwencji hybrydów międzyrasowych. Wysokie frekwencje rekombinantów uznaliśmy za mechanizm podnoszący płodność w populacjach hybrydowych ryjówki, zatem ułatwiający przepływ genów między kontaktującymi się rasami. Kolejną opisaną przez nasz zespół strefą hybrydyzacji jest strefa Drnholec/Białowieża położona w okolicach Dęblina. Na tym obszarze prowadziłam badania w ramach swojego doktoratu. Wstępne wyniki moich analiz znalazły się w publikacji nr 8. Strefa hybrydyzacji Drnholec/Białowieża jest interesująca z dwóch powodów. Po pierwsze, u hybrydów tworzy się 10-elementowy kompleks chromosomów wspólnie segregujących w mejozie I. Jest to jeden z najdłuższych kompleksów możliwych u ryjówki, można zatem oczekiwać znaczącego nacisku selekcji przeciwko takim osobnikom. Po drugie, strefa Drnholec/Białowieża ustabilizowała się na wąskim, wysokim nasypie kolejowym. Gwałtowny spadek częstości diagnostycznych chromosomów na wysokości nasypu dowodzi, że stanowi on barierę dla migracji osobników. W badanej strefie nie stwierdziliśmy żadnego mechanizmu, który ułatwiałby przepływ genów między kontaktującymi się rasami. Im większe różnice kariotypowe występują u ras ryjówki wchodzących w kontakt, tym bardziej skomplikowane kompleksy mejotyczne w kształcie łańcucha lub pierścienia powstają u hybrydów. Nieprawidłowości w koniugacji i segregacji chromosomów w kompleksach mogą prowadzić do śmiertelności komórek rozrodczych lub/i do powstania aneuploidalnych gamet i embrionów, co w konsekwencji skutkuje obniżoną płodnością osobników. Kolejnym celem naszych badań była ocena płodności mieszańców S. araneus pochodzących z różnych stref hybrydyzacji, gdyż obniżona płodność osobników może stanowić barierę dla przepływu genów, a co za tym idzie, zapoczątkować proces specjacji. Analiza spermatogenezy u samców z pierścieniem 4-elementowym, łańcuchem 4- i 5elementowym, pochodzących ze stref hybrydyzacji Drnholec i Łęgucki Młyn oraz Guzowy Młyn i Łęgucki Młyn, wykazała, że komplikacja kariotypu ma istotny wpływ na poziom śmiertelności komórek generatywnych [10]. Wydaje się jednak, że poziom śmiertelności gamet u hybrydowych samców ryjówki w obu badanych strefach nie jest wysoki na tyle, żeby AUTOREFERAT |7 spowodować obniżenie płodności tych osobników. Z dalszych naszych badań wynika, że obniżona płodność samców z 5-elementowym łańcuchem może być efektem non-dysjunkcji mejotycznej, która prowadzi do powstania nieprawidłowych pod względem chromosomów gamet i embrionów [14]. W strefach Drnholec/Łęgucki Młyn oraz Guzowy Młyn/Łęgucki Młyn selekcja działa również przeciwko samicom o hybrydowym kariotypie. Wykazaliśmy, że poziomy śmiertelności przed- i poimplantacyjnej są istotnie statystycznie wyższe w populacjach z wysoką frekwencją (>10%) mieszańców posiadających 5-elementowy łańcuch w porównaniu do pozostałych populacji [12]. Wysunięta została hipoteza, że zaobserwowana znaczna śmiertelność embrionalna nie wynika wyłącznie z komplikacji kariotypu, ale może być częściowo także następstwem niekorzystnych warunków środowiska. Przeanalizowałyśmy także przebieg mejozy i spermatogenezy w strefie hybrydyzacji ras Drnholec i Białowieża ryjówki aksamitnej. Okazało się, że samce z jednym długim (9- lub 10elementowym) lub dwoma krótszymi (7- i 4-elementowymi oraz 6- i 5-elementowymi) łańcuchami mejotycznymi cierpią z powodu znacznego obniżenia płodności, ale nie są sterylne [19]. Przyczyną obniżonej płodności mieszańców jest zarówno znaczny poziom nondysjunkcji chromosomów, jak również nadmierna śmiertelność komórek rozrodczych, powodująca prawdopodobnie zmniejszenie masy jąder. Badania mejozy i spermatogenezy u samców ze strefy Drnholec/Białowieża wykonałam w ramach swojego doktoratu. Innym aspektem badań związanych z fitness różnych kategorii kariologicznych ryjówki były analizy morfometryczne. Szukaliśmy odpowiedzi na pytanie, czy istnieje zależność między komplikacją kariotypu a morfologią osobników. Przeprowadziliśmy badania w trzech strefach hybrydyzacji. Niestety, otrzymane wyniki nie były jednoznaczne. W jednej ze stref dorosłe hybrydy miały istotnie mniejszą masę ciała niż osobniki rasy rodzicielskiej, z kolei w innej różnicę tę zaobserwowaliśmy w grupie osobników młodych [9]. W strefie Drnholec/Białowieża hybrydy charakteryzowały się istotnie mniejszymi rozmiarami stopy w porównaniu do jednej z ras rodzicielskich. Analiza przeprowadzona w strefie Guzowy Młyn/Łęgucki Młyn pokazała brak zależności między kariotypem a rozmiarami i kształtem żuchwy w grupie osobników młodych, natomiast w grupie osobników dojrzałych istniała tylko istotna zależność między kariotypem a kształtem żuchwy [16]. Młode ryjówki z populacji usytuowanych w centrum strefy Guzowy Młyn/Łęgucki Młyn były mniejsze niż osobniki z populacji marginalnych. Zasugerowaliśmy, że brak takiej różnicy w grupie osobników dojrzałych wynika z nadmiernej śmiertelności ryjówek zamieszkujących środek strefy, gdzie są niekorzystne warunki siedliskowe. We wszystkich badanych przez nasz zespół strefach hybrydyzacji międzyrasowej S. araneus stwierdziliśmy osobniki o obniżonych parametrach rozrodu. Searle (1993; Hybrid zones and evolutionary process, Oxford Univ. Press) oraz Searle i Wójcik (1998; Evolution of AUTOREFERAT |8 shrews, MRI PAS) postulowali, że jeśli obniżona płodność mieszańców ryjówki wynika z heterozygotyczności kariotypu, może dojść do ewolucji bariery prezygotycznej, i w konsekwencji do specjacji przez wzmocnienie. Według modelu specjacji przez wzmocnienie dobór naturalny preferuje osobniki, które najrzadziej kojarzą się z obcymi partnerami (Barton i Hewitt 1981, Evolution and speciation, Cambridge Univ. Press), co ma zapobiegać przepływowi genów przez strefę, a w konsekwencji doprowadzić do zakończenia procesu specjacji. W celu znalezienia odpowiedzi na pytanie, czy specjacja chromosomowa może zachodzić u ryjówki aksamitnej, określiliśmy poziom przepływu genów w kilku strefach hybrydyzacji. Pierwsze próby rozwiązania tego problemu przeprowadziliśmy w oparciu o zróżnicowanie loci allozymatycznych [13, 17]. W dwóch badanych strefach przepływ genów, mierzony jako liczba migrantów na pokolenie, wydaje się wysoki. Pomimo tego, zróżnicowanie genetyczne pomiędzy rasami, chociaż niskie, okazało się istotne statystycznie, co sugeruje jednak istnienie jakichś barier ograniczających wymianę osobników pomiędzy populacjami. W strefie Guzowy Młyn/Łęgucki Młyn taką barierą jest z pewnością obszar miasta Pasłęk [17]. Czy na badanych obszarach ograniczenia w przepływie genów mogą także wynikać z obniżonej płodności hybrydów, będącej konsekwencją różnic chromosomowych ras wchodzących w kontakt? Nie stwierdziliśmy zależności między zróżnicowaniem chromosomowym a zróżnicowaniem genowym w obu badanych strefach [13, 17]. Jako prawdopodobne wyjaśnienie otrzymanego wyniku podaliśmy stosunkowo małą zmienność loci allozymatycznych. W dalszych badaniach wykorzystaliśmy wysoce zmienne loci mikrosatelitarnego DNA [18]. Jednak analiza markerów mikrosatelitarnych przeprowadzona w strefie Drnholec/Białowieża pokazała brak zróżnicowania genetycznego między hybrydyzującymi rasami. Wynik ten był zaskakujący, gdyż gwałtowne załamanie klinów frekwencji diagnostycznych metacentryków w strefie odbywa się na odcinku zaledwie 40 m [8], co wyraźnie wskazuje na istnienie silnej bariery dla przepływu genów. Ograniczona wymiana genów pomiędzy rasami Drnholec i Białowieża może wynikać ze zredukowanej płodności hybrydowych samców [19]. Znalazło to potwierdzenie w ponad czterokrotnie niższym przepływie genów sprzężonych z chromosomem Y w porównaniu do markerów autosomalnych dziedziczonych po obojgu rodzicach [18]. Stwierdziliśmy, że brak różnic genetycznych między rasami Drnholec i Białowieża jest konsekwencją ich wspólnego pochodzenia, a różnicowanie się ras i szansa na zajście specjacji chromosomowej na tym obszarze są niweczone przez intensywny napływ osobników spoza strefy. Nasunęło się podejrzenie, że brak dowodów na zróżnicowanie genetyczne między rasami ryjówki wchodzącymi w kontakt może być spowodowany ujednoliconym traktowaniem mikrosatelit zlokalizowanych na różnych chromosomach. Kolejnym krokiem w badaniu AUTOREFERAT |9 wpływu komplikacji kariotypu na przepływ genów w strefach hybrydyzacji ryjówki było zatem porównanie zróżnicowania genetycznego w loci mikrosatelitarnego DNA sprzężonymi z chromosomami wchodzącymi w skład kompleksów mejotycznych hybrydów oraz loci niesprzężonymi [26]. Analizy przeprowadzono w pięciu strefach hybrydyzacji, jedną z badanych stref była strefa Drnholec/Białowieża w okolicach Dęblina. Nie znaleziono jednak dowodów świadczących o ograniczeniu przepływu genów przez badane strefy hybrydowe. Jednym z wyjaśnień było przypuszczenie, że mutacje chromosomowe u ryjówki nie wpływają tak znacząco na płodność osobników, jak wykazano to u innych gatunków. Po drugie, ewolucja kariotypowa u tego gatunku mogła zajść niedawno i być procesem szybkim, w związku z czym nie było czasu na nagromadzenie się zmienności genetycznej w obrębie ras. Po trzecie, jako że tempo rekombinacji zależy od położenia locus na chromosomie oraz od struktury chromosomu, tylko markery molekularne o znanej lokalizacji mogłyby być pomocne w określaniu wpływu mutacji chromosomowych na płodność osobników ryjówki. Hipotezę o niedawnym pochodzeniu ras chromosomowych S. araneus potwierdza brak różnic genetycznych w mitochondrialnym genie cyt b, który przeanalizowano u pięciu ras zaklasyfikowanych do dwóch grup kariologicznych WEKG i EEKG [15]. Znaczna zmienność haplotypowa, w połączeniu z wynikami szacowanego czasu koalescencji genu cyt b oraz gwiaździstym kształtem drzewa filogenetycznego, sugeruje niedawną ekspansję demograficzną gatunku. Prawdopodobnie, zróżnicowanie na rasy chromosomowe S. araneus pojawiło się w trakcie tej ekspansji, dlatego też podobieństwo genetyczne poszczególnych ras odzwierciedla polimorfizm ancestralny gatunku. U ryjówki aksamitnej zjawiska polimorfizmu i politypowości związane są z podstawowym zespołem chromosomów, określanym jako zespół A. Innym przykładem polimorfizmu chromosomowego jest polimorfizm chromosomów B. Są to chromosomy dodatkowe, występujące niezależnie od garnituru A, które nie są konieczne do życia osobnika. W celu określenia mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymywanie się chromosomów B u myszy leśnej wielkookiej Apodemus flavicollis przeprowadziłyśmy analizę mejozy u samców [20]. Jako że stwierdziłyśmy kilkuprocentowy ubytek liczby chromosomów B w mejozie u samców (meiotic drag), to eliminacja tych chromosomów z populacji powinna być albo rekompensowana przez preferencyjne ich przekazywanie u samic (meiotic drive), co jest zgodne z modelem pasożytniczym, albo powinny one mieć pozytywny wpływ na nosicieli, co odpowiada modelowi heterotycznemu. Za modelem pasożytniczym przemawia także wzrost liczby chiazm na chromosomach A wraz z rosnącą liczbą chromosomów B w kariotypie. Zasugerowałyśmy, że mieszany model utrzymywania się chromosomów B u A. flavicollis może wynikać ze zmiennego kierunku spowodowanego porami roku lub czynnikami środowiska. działania doboru naturalnego A U T O R E F E R A T | 10 W ciągu wielu lat badań terenowych, głównie w strefach hybrydyzacji międzyrasowej S. araneus, nasz zespół nagromadził ogromną liczbę danych na temat występowania i zagęszczenia drobnych ssaków. Dane te opublikowaliśmy w postaci tabel, zawierających współrzędne geograficzne miejsc odłowu, oraz map ArcGIS [32]. Celem tej pracy była aktualizacja miejsc występowania gryzoni i ryjówkowatych na obszarze naszego kraju, co powinno być wykorzystane w nowo powstającym „Atlasie ssaków Polski”. Od kilku lat moje zainteresowania naukowe koncentrują się na genetyce konserwatorskiej i filogeografii gatunków zagrożonych wyginięciem: brzozy niskiej Betula humilis, brzozy karłowatej B. nana i chomika europejskiego Cricetus cricetus. Genetyka konserwatorska jest gałęzią nauki wykorzystującą markery molekularne do ochrony i restytucji zasobów genetycznych populacji. Są to niezwykle pilne zadania, gdyż fragmentacja siedlisk naturalnych wynikająca z coraz silniejszej antropopresji, doprowadziła w XX w. do pięciokrotnego zmniejszenia liczby populacji B. humilis w Polsce (Załuski i in. 2001, Polska czerwona księga roślin, IB PAN), a obecny areał występowania C. cricetus na obszarze naszego kraju zmniejszył się o 75% w ciągu ostatnich trzydziestu lat (Ziomek i Banaszek 2007, Folia Zool. 56). Z kolei, filogeografia to dyscyplina zajmująca się poznaniem zasad i procesów odpowiedzialnych za geograficzne rozmieszczenie linii rodowych (Avise 2000, Phylogeography: the history and formation of species, Harvard Univ. Press). Realizacja tematów badawczych związanych z analizą zasobów genetycznych populacji, opisem historii glacjalnej i postglacjalnej brzóz i chomika była możliwa dzięki, uzyskanym przeze mnie oraz dr hab. Agatę Banaszek, grantom Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowego Centrum Nauki. Sekwencjonowanie regionu kontrolnego (ctr) mitochondrialnego DNA (mtDNA) wykazało bardzo małą zmienność genetyczną polskich populacji chomika europejskiego [21]. Większość populacji była monomorficzna pod względem jednego z siedmiu haplotypów, a pojedyncze haplotypy występowały na dużych obszarach geograficznych. Geograficzny wzorzec rozmieszczenia haplotypów sugeruje, że przyczyną niskiego poziomu zmienności markera molekularnego w populacjach C. cricetus jest raczej redukcja liczebności osobników (tzw. efekt wąskiego gardła) mająca miejsce w refugiach glacjalnych i w czasie rekolonizacji polodowcowej niż gwałtowny spadek liczebności chomików wynikający z obecnej fragmentacji ich zasięgu. Analizy trzech markerów molekularnych mtDNA: regionu kontrolnego (ctr), cytochromu b (cyt b) i podjednostki 16S rDNA (16S) wykazała, że polskie populacje chomika należą do dwóch linii filogeograficznych [22]. Linia E1 była nieznaną dotąd linią filogeograficzną tego gatunku, natomiast linia P3 reprezentuje haplotypy charakterystyczne dla opisanej z obszaru Karpat grupy Pannonia (Neumann i in. 2005, Mol. Ecol. 14). Przedstawiciele linii Pannonia pojawili się na terenie południowej Polski A U T O R E F E R A T | 11 najprawdopodobniej ok. 53 tys. lat temu. Zasiedlenie przez chomiki należące do linii E1 południowo-wschodniej Polski miało miejsce dopiero po ustąpieniu zlodowacenia. Grupy filogeograficzne E1 i P3 chomika, współwystępujące na Wyżynie Małopolskiej, nie wchodzą w kontakt [27]. Przemawia za tym brak populacji mieszańcowych na odcinku 20 km, dzielącym skrajne populacje obu grup. Brak przepływu genów między liniami filogeograficznymi wynika najprawdopodobniej z niekorzystnych warunków terenu. Ocena zmienności loci mikrosatelitarnego jądrowego DNA w polskich populacjach C. cricetus wykazała niską średnią liczbę alleli przypadającą na locus i stosunkowo wysoką średnią heterozygotyczność [23]. Taka dysproporcja pomiędzy dwoma parametrami opisującymi zmienność genetyczną jest charakterystyczna dla populacji, w których niedawno rozpoczął się proces utraty zmienności. Duże zróżnicowanie genetyczne między populacjami należącymi do linii P3 i umiarkowane zróżnicowanie w obrębie grupy E1 sugerują, że przepływ genów między populacjami chomika jest ograniczony, co potwierdziła identyfikacja migrantów. Ponieważ populacje C. cricetus stanowią bardzo bliskie skupienia genetyczne, sugeruje to funkcjonowanie gatunku w systemie metapopulacji. W dogodnych warunkach siedliskowych chomiki tworzą liczne, lokalne populacje, natomiast gwałtowne zmiany siedliska powodują wymarcie tych populacji. Zatem postępująca fragmentacja siedlisk rolniczych stanowi zagrożenie dla istnienia tego gatunku. Porównawcze badania morfometryczne w grupach filogeograficznych E1 i P3 chomika europejskiego wykazały, że osobniki linii P3 są istotnie statystycznie mniejsze i mają dłuższe stopy i ogony [29]. Przyczyną tego zróżnicowania są prawdopodobnie zmiany nagromadzone i utrwalone w czasie izolacji w refugiach i rekolonizacji postglacjalnej. Brak w analizowanym materiale barwnych morfów sugeruje, że redukcja zasięgu występowania i ograniczenie liczebności gatunku na terenie Polski prowadzą do spadku zmienności genetycznej. Na podstawie wyraźnego zróżnicowania genetycznego i ekologicznego wysunięty został postulat, aby polskie linie filogeograficzne C. cricetus uznać za jednostki o znaczeniu ewolucyjnym (ESU – evolutionary significant unit) i jednostki zarządzania (MU – management unit). Doskonałymi modelami do badania wpływu fragmentacji środowiska na poziom zmienności genetycznej populacji są brzozy krzewiaste – brzoza niska i karłowata. W Polsce, te dwa gatunki wykazują różną liczebność i różny stopień izolacji przestrzennej. Główne skupiska B. humilis występują na Pomorzu, Pojezierzu Mazurskim, Podlasiu i Lubelszczyźnie (Załuski i in. 2001, Polska czerwona księga roślin, IB PAN). Liczebność tych skupisk jest zróżnicowana. Niektóre liczą sobie setki osobników, np. populacje w Biebrzańskim Parku Narodowym. Z kolei, na stanowisku nad Jeziorem Maliszewskim znalazłam 52 ramety stanowiące trzy osobniki genetyczne (genety; dane niepubl.). Brzoza A U T O R E F E R A T | 12 karłowata występuje w Polsce tylko na trzech stanowiskach: w rezerwatach „Torfowiska Doliny Izery” i „Torfowisko pod Zieleńcem” w Sudetach oraz w rezerwacie „Linje” na Pojezierzu Chełmińskim. Najmniejsza odległość między populacjami wynosi ok. 90 km (Kruszelnicki i Fabiszewski 2001, Polska czerwona księga roślin, IB PAN). Wyniki analiz genetycznych przeprowadzone w populacjach obu gatunków brzóz zostały opracowane w formie oryginalnych artykułów [1–3, 5, 24, 25, 28], jednej publikacji przeglądowej [4] oraz jednego rozdziału przeglądowego w anglojęzycznej monografii [31]. Morfologię i biologię poszczególnych europejskich gatunków Betula omówiłam w pracy popularyzatorskiej [30]. Prace 1–5 weszły w skład tzw. osiągnięcia naukowego zgłoszonego do postępowania habilitacyjnego i zostały szczegółowo omówione poniżej. Do oceny zasobów zmienności genetycznej zagrożonych gatunków brzóz stosowaliśmy różne rodzaje markerów genetycznych: chromosomy, mikrosatelity jądrowe, jądrowy gen dehydrogenazy alkoholowej ADH i niekodujące odcinki chloroplastowego DNA (cpDNA). Badania kariotypowe przeprowadziliśmy w sześciu populacjach brzozy niskiej [25]. W każdej populacji wystąpiły osobniki diploidalne z 2n=28 chromosomów oraz aneuploidy posiadające 2n≠28. Niezbalansowany zespół chromosomów zazwyczaj niekorzystnie wpływa na dostosowanie osobnika, zatem w celu wyjaśnienia przyczyn utrzymywania się aneuploidalnych kariotypów wysunęliśmy cztery hipotezy: (1) aneuploidy mogą być następstwem hybrydyzacji brzozy niskiej z blisko spokrewnionymi gatunkami, (2) stres wywołany fragmentacją środowiska może powodować zmianę nacisku selekcji przeciwko osobnikom o nieprawidłowym kariotypie, (3) osobniki o 2n≠28 mają niestabilny zespół chromosomów, co generuje kolejne przypadki aneuploidii, (4) wysoki odsetek aneuploidalnych osobników utrzymuje się w populacjach brzozy ze względu na dominację wegetatywnego systemu rozrodu. Weryfikacja tych hipotez wymaga jednak dalszych badań. Głównymi przyczynami zanikania populacji B. humilis są: osuszanie torfowisk, zbyt intensywne ich użytkowanie oraz konkurencja gatunków leśnych i zaroślowych (Załuski i in. 2001, Polska czerwona księga roślin, IB PAN). Wstępne analizy pokazały, że pomimo coraz silniejszej fragmentacji południowo-zachodniego krańca zasięgu gatunku, zmienność loci mikrosatelitarnego DNA w populacjach B. humilis z północno- i południowo-wschodniej Polski utrzymuje się na stosunkowo wysokim poziomie [24]. Prawdopodobnie wynika to ze zbyt krótkiego czasu, który minął od momentu rozpoczęcia procesu zanikania lokalnych populacji i związanego z nim wzrostu izolacji geograficznej pomiędzy poszczególnymi stanowiskami. Brzozy mogą osiągać wiek 20 lat, w związku z tym spadek zmienności genetycznej w populacjach jest dużo wolniejszy niż u gatunków jednorocznych. Innym wyjaśnieniem na utrzymywanie się wysokiego poziomu zróżnicowania genetycznego jest przewaga rozmnażania generatywnego nad wegetatywnym. W badanych przez nas A U T O R E F E R A T | 13 populacjach każda rameta miała inny genotyp, a ponad 90% całkowitej zmienności genetycznej przypadało na poziom wewnątrzpopulacyjny. Oba te fakty przemawiają za dominacją rozrodu generatywnego u brzozy niskiej. Z badań Jabłońskiej (2012; Phytocoenologia 42) oraz naszych własnych obserwacji terenowych wynika, że brzoza niska tworzy tak samo liczebne populacje na stanowiskach podmokłych w północno-wschodniej Polsce i Białorusi, jak i na osuszonych w południowowschodniej części naszego kraju i centralnej Białorusi [28]. Pod względem markerów mikrosatelitarnych oba regiony reprezentują niemal taki sam wysoki poziom zmienności [1], natomiast w Polsce Północno-Wschodniej odnotowaliśmy zdecydowanie większe zróżnicowanie haplotypów cpDNA, co wynika z kontaktu różnych linii filogenetycznych na tym obszarze [2, 5]. Kolejnym celem naszych badań było sprawdzenie, czy historia populacyjna gatunku jest jedynym czynnikiem determinującym poziom zmienności w populacjach B. humilis. Przeanalizowaliśmy zależności pomiędzy wybranymi parametrami fizyko-chemicznymi środowiska i parametrami opisującymi zmienność jądrowego genu ADH oraz mikrosatelitarnego DNA [28]. Stwierdziliśmy istotną negatywną zależność pomiędzy stężeniem jonów Ca2+ a heterozygotycznością loci mikrosatelitarnych oraz brak różnic genetycznych pomiędzy populacjami zasiedlającymi podmokłe i osuszone torfowiska. Jako że ekspresja genu ADH związana jest ze stresem oksydacyjnym, brak różnic w tym locus między brzozami rosnącymi na terenach podmokłych i zmeliorowanych sugeruje, że brzoza niska dobrze toleruje nadmiar wody w środowisku. Analiza drzewa filogenetycznego, skonstruowanego na podstawie zróżnicowania haplotypów ADH, potwierdza historię populacyjną B. humilis opisaną w oparciu o markery cpDNA [2]. Wyniki moich prac, opisujących zasoby zmienności genetycznej polskich populacji brzozy niskiej, wzbogacone o przegląd wniosków płynących z badań filogeograficznych i paleobotanicznych, zebrałam i podsumowałam w rozdziale monografii [31]. Obecnie zajmuję się opracowywaniem wyników dotyczących rozmnażania generatywnego brzozy niskiej i karłowatej (grant NCN nr 2011/01/B/NZ8/01756). W populacjach marginalnych (polskich) i centralnych (białoruskich i fińskich) obu gatunków zebrałam dane na temat kwitnienia i owocowania krzewów. Parametry rozrodu poszczególnych osobników będą odniesione do ich genotypów w loci AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Pozwoli to odpowiedzieć na pytania, czy intensywność rozrodu zależy od genotypu osobnika i lokalizacji populacji oraz jaki typ rozrodu przeważa w populacjach zagrożonych gatunków brzóz – generatywny czy wegetatywny. W przyszłości pragnę zająć się analizą wpływu hybrydyzacji międzygatunkowej na zmienność genetyczną i morfologię europejskich przedstawicieli rodzaju Betula. Brzozy należą do taksonów o najwyższej częstości hybrydyzacji międzygatunkowej (Barrington 2011, J. Torrey Bot. Soc. A U T O R E F E R A T | 14 138). Badania haplotypów cpDNA wykazały, że różnogatunkowe brzozy rosnące sympatrycznie są bardziej do siebie podobne genetycznie niż brzozy należące do tego samego gatunku, ale pochodzące z populacji allopatrycznych (Palmé i in. 2004, Mol. Ecol. 13). Znaczący przepływ genów między populacjami brzóz sprawia, że do dzisiaj nieznana jest dokładna liczba gatunków w tym rodzaju. Przy pomocy sekwencjonowania nowej generacji (next generation sequencing) planuję identyfikację loci diagnostycznych dla poszczególnych europejskich gatunków brzóz, co potem w badaniach populacyjnych B. humilis i B. nana pozwoli określić zakres i skutki przepływu genów między gatunkami zagrożonymi i szeroko rozprzestrzenionymi. O finansowanie projektu na badania związane z hybrydyzacją brzóz wystąpiłam do Narodowego Centrum Nauki (konkurs OPUS 6). WSKAZANIE OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO [wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dziennik Ustaw nr 65, poz. 595 z późniejszymi zmianami, jak w Dz. U. 2005 nr 164, poz. 1365, art. 251; Dz. U. 2011, nr 84, poz. 455)] Osiągnięciem naukowym jest monotematyczny cykl publikacji naukowych przedstawiony pod tytułem: „Struktura genetyczna populacji Betula humilis Schrk. i B. nana L. jako efekt postglacjalnej historii brzóz” PUBLIKACJE WCHODZĄCE W SKŁAD ZGŁASZANEGO OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO: [1] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Jabłońska E., Sozinov O.V. 2011. Could Betula humilis have survived the last glaciation at a current margin of its distribution? Testing the hypothesis of a glacial refugium using nuclear microsatellites. Plant Systematics and Evolution 297: 147-156. [2] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Jabłońska E., Sozinov O.V. 2012. Chloroplast DNA variation of Betula humilis Schrk. in Poland and Belarus. Tree Genetics and Genomes 8: 1017-1030. A U T O R E F E R A T | 15 [3] Jadwiszczak K.A., Drzymulska D., Banaszek A., Jadwiszczak P. 2012. Population history, genetic variation and conservation status of the endangered birch species Betula nana L. in Poland. Silva Fennica 4: 465-477. [4] Jadwiszczak K.A. 2012. What can molecular markers tell us about the glacial and postglacial histories of European birches? Silva Fennica 5: 733-745. [5] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Chrzanowska A., Kłosowski S., Sozinov O.V. 2014. The admixture zone of Betula humilis Schrk. phylogenetic lineages follows the eastern central European suture zone. Plant Ecology & Diversity, DOI: 10.1080/17550874.2014.893593. WPROWADZENIE Jednym z głównych zagrożeń dla światowej bioróżnorodności jest wymieranie gatunków, a co za tym idzie zanikanie pul genowych (tzw. śmierć genetyczna). Oprócz zmian klimatycznych, które od zawsze miały miejsce na Ziemi, za współczesne zanikanie populacji i gatunków odpowiedzialny jest człowiek. Antropopresja prowadzi przede wszystkim do fragmentacji środowisk naturalnych, skutkiem czego jest redukcja liczebności osobników w populacji oraz zwiększenie stopnia izolacji między sąsiednimi populacjami. Teoretycznie, takie zmiany mogą doprowadzić do: (1) spadku zmienności genetycznej populacji, a co za tym idzie całego gatunku, i (2) wzrostu poziomu zróżnicowania genetycznego między poszczególnymi populacjami (Young i in. 1996, Trends Ecol. Evol. 11). Konsekwencje redukcji zmienności genetycznej można rozpatrywać zarówno w skali krótko-, jak i długoterminowej. W skali krótkoterminowej spadek heterozygotyczności populacji prowadzi do obniżenia fitness osobników (Ellstrand i Elam 1993, Annu. Rev. Ecol. Syst. 24). Wynika to z faktu utrwalenia się szkodliwych alleli na skutek silnie działającego w małych populacjach dryfu genetycznego oraz inbredu. W skali długoterminowej wraz ze wzrostem poziomu homozygotyczności maleje zdolność reakcji gatunku na zmieniające się warunki środowiskowe, a co za tym idzie grozi mu wymarcie (Falkoner i Mackay 1996, Introduction to quantitative genetics, Longman). Na temat rozkładu zmienności genetycznej w obrębie zasięgów gatunków istnieją dwie hipotezy. Według hipotezy „centrum-peryferia” populacje centralne wykazują wyższy poziom zmienności genetycznej w porównaniu z populacjami peryferycznymi (Eckert i in. 2008, Mol. Ecol. 17). Dobzhansky (1951, Genetics and the origin of species, Columbia Univ. Press) twierdził, że optymalne siedliska dla osobników danego gatunku znajdują się w centrum jego zasięgu, gdzie różnorodność nisz pozwala na koegzystencję wielu genotypów. Z kolei, na skraju zasięgu gatunku panują zazwyczaj niekorzystne warunki siedliskowe, stąd silne działanie doboru naturalnego eliminuje liczne genotypy. Populacje marginalne są A U T O R E F E R A T | 16 często mało liczebne, stąd kolejnym mechanizmem ograniczającym zmienność genetyczną na skraju zasięgu jest dryf genetyczny. Wyniki badań z zakresu filogeografii pokazują, że przyczyną zróżnicowania genetycznego w obrębie zasięgów gatunków nie są lokalne fluktuacje demograficzne, lecz zmiany zasięgów spowodowane naprzemiennie występującymi glacjałami i interglacjałami w okresie czwartorzędu (Hewitt 2004, Philos. T. Roy. Soc. 359; Hampe i Petit 2005, Ecol. Lett. 8). Konsekwencją zmian zasięgów gatunków są wysokie parametry zmienności genetycznej w populacjach zlokalizowanych na terenie dawnych refugiów glacjalnych (tzw. ‘trwała’ tylna krawędź zasięgu) i stopniowy spadek poziomu zmienności wraz z rosnącą odległością od obszaru byłych izolatów (tzw. krawędź prowadząca zasięgu; Hampe i Petit 2005, Ecol. Lett. 8). Analizy filogeograficzne dowodzą, że populacje usytuowane w obszarach kontaktu różnych linii filogenetycznych reprezentują często wyższy poziom zmienności genetycznej niż populacje z trwałego krańca zasięgu (Petit i in. 2003, Science 300). W Polsce, do gatunków zagrożonych wyginięciem należą brzoza niska (Betula humilis Schrank, 1789) i brzoza karłowata (Betula nana Linnaeus, 1753), które na obszarze Europy Zachodniej, Centralnej i częściowo Wschodniej stanowią relikty epoki zlodowacenia. Oba gatunki mają status EN (endangered) wg klasyfikacji Międzynarodowej Unii Ochrony Przyrody (IUCN). Do czasu rozpoczęcia przeze mnie badań, poza analizą markerów RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) przeprowadzoną w jednej polskiej populacji B. nana (Dąbrowska i in. 2006, Dendrobiology 55) i analizą chromosomową wykonaną w jednej niemieckiej populacji B. humilis (Nato 1959, Feddes Repert. 61), nie było żadnych danych na temat zasobów i rozkładu zmienności genetycznej w marginalnych populacjach obu gatunków brzóz. A ocena zmienności genetycznej jest niezwykle istotna przy planowaniu zabiegów konserwatorskich. Celem prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego zgłoszonego do postępowania habilitacyjnego było m.in.: 1. Testowanie hipotezy o istnieniu refugium glacjalnego brzozy niskiej na terenie Polesia Lubelskiego 2. Testowanie hipotezy o rozkładzie zmienności genetycznej wg modelu „centrum– peryferia” w południowo-zachodniej i subcentralnej części zasięgu B. humilis 3. Określenie przyczyn wysokiego poziomu zmienności genetycznej w populacjach B. humilis z północno-wschodniej Polski – hipoteza refugium peryglacjalnego vs. strefa kontaktu linii filogenetycznych 4. Ocena poziomu zmienności genetycznej w populacjach genetycznego między populacjami brzozy karłowatej w Polsce i zróżnicowania A U T O R E F E R A T | 17 5. Porównanie wzorów zróżnicowania markerów molekularnych w zasięgach europejskich gatunków brzóz [1] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Jabłońska E., Sozinov O.V. 2011. Could Betula humilis have survived the last glaciation at a current margin of its distribution? Testing the hypothesis of a glacial refugium using nuclear microsatellites. Plant Systematics and Evolution 297: 147-156. Głównymi celami tej pracy było określenie poziomu zmienności genetycznej w populacjach brzozy niskiej oraz przetestowanie hipotezy o istnieniu refugium glacjalnego B. humilis na Polesiu Lubelskim (Środoń 1979, Brzozy, PWN). Założyliśmy, że gdyby brzoza niska przetrwała ostatnie zlodowacenie w południowo-wschodniej Polsce, wówczas populacje z tego obszaru powinny charakteryzować się większym poziomem zmienności genetycznej niż populacje zlokalizowane na terenach pokrytych lodowcem, jak również populacje z centrum zasięgu. Zbadaliśmy 10 loci mikrosatelitarnego jądrowego DNA u 327 osobników pochodzących z 15 marginalnych (Polska) i trzech subcentralnych populacji (Białoruś). Wśród tych populacji, sześć znajdowało się na terenie objętym lodowcem skandynawskim. Średnia liczba alleli na locus (A) okazała się istotnie statystycznie wyższa na obszarach nieobjętych lodowcem w porównaniu z obszarem pokrytym lądolodem w plejstocenie (ANOVA; F17=6,435, P=0,021). Parametr ten był także istotnie niższy w północnej i południowo-wschodniej Polsce w porównaniu do północno-wschodniej Polski i Białorusi (F17=3,666, P=0,037). Liczba prywatnych alleli (NPA) nie różniła się istotnie ani między badanymi obszarami geograficznymi (F17=0,712, P=0,548) ani między rejonami pokrytymi i niepokrytymi lądolodem skandynawskim (F17=0,011, P=1,000). Najwyższe wartości heterozygotyczności obserwowanej (HO) i spodziewanej (HE) odnotowaliśmy w populacjach subcentralnych na Białorusi. Otrzymane wyniki zaprzeczają hipotezie o przetrwaniu przez B. humilis ostatniego zlodowacenia w południowo-wschodniej Polsce. Ponadto, hierarchiczna analiza wariancji molekularnej (AMOVA) wykazała, że ponad 95% całej zmienności przypada na poziom wewnątrzpopulacyjny i tylko ok. 4% na poziom międzypopulacyjny przy podziale populacji na te pochodzące z obszarów pokrytych i niepokrytych lodowcem, jak również przy podziale populacji na cztery regiony geograficzne. Wyniki te dodatkowo podważają hipotezę o refugium glacjalnym B. humilis na Polesiu Lubelskim. Odrzuciliśmy także hipotezę o rozkładzie zmienności genetycznej wg modelu „centrum-peryferia” w badanej części zasięgu brzozy niskiej. Okazało się bowiem, że populacje marginalne i subcentralne nie wykazują istotnych statystycznie różnic genetycznych (AMOVA; FCT=-0,00095, P=0,483). Najbardziej zaskakującym wynikiem w tej A U T O R E F E R A T | 18 pracy było stwierdzenie wysokich wartości parametrów zmienności genetycznej w populacjach B. humilis z północno-wschodniej Polski. Część tych populacji znajduje się bowiem w zasięgu ostatniego zlodowacenia, a część zajmuje tereny stanowiące w plejstocenie przedpole lodowca. Wysunęliśmy hipotezy, że znaczna zmienność genetyczna brzozy niskiej w północno-wschodniej Polsce może być konsekwencją przetrwania tego gatunku w refugium peryglacjalnym albo mieszania się fal migracji pochodzących z różnych refugiów lodowcowych. Brak izolacji przez dystans (IBD) sugeruje, że B. humilis mogła przetrwać maksimum ostatniego zlodowacenia na wyższych szerokościach geograficznych (test Mantela; r=0,1375, P=0,219). Jednakże hipotezę o refugium peryglacjalnym podważa niska frekwencja prywatnych alleli (0,99–4,44%) w populacjach z Suwalszczyzny i Podlasia. Analizy mikrosatelitarnego DNA pokazały, że zmienność genetyczna brzozy niskiej na południowo-zachodnim krańcu zasięgu, pomimo zanikania jej siedlisk, jest wciąż znacząca. Jednak populacje o małej liczebności osobników i izolowane geograficznie zaczynają wykazywać pierwsze oznaki spadku poziomu zmienności genetycznej i początek procesu różnicowania, co widać na przykładzie stanowisk z północnej Polski. [2] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Jabłońska E., Sozinov O.V. 2012. Chloroplast DNA variation of Betula humilis Schrk. in Poland and Belarus. Tree Genetics and Genomes 8: 1017-1030. Cele tej pracy to: (1) ocena rozkładu zmienności markerów chloroplastowego DNA (cpDNA) w populacjach marginalnych (Polska) i subcentralnych (Białoruś) brzozy niskiej, (2) sprawdzenie, czy populacje B. humilis z północno-wschodniej Polski reprezentują wysoki poziom zmienności cpDNA, jak wcześniej opisaliśmy to na podstawie mikrosatelitarnego DNA [Załącznik 3, praca nr 1], (3) określenie stopnia hybrydyzacji B. humilis z blisko spokrewnionymi brzozami drzewiastymi – B. pendula i B. pubescens. Wykorzystując metodę PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism), zbadaliśmy 365 osobników brzozy niskiej pochodzących z 19 populacji, 36 brzóz brodawkowatych i 31 omszonych. W badanym materiale opisaliśmy 21 haplotypów cpDNA (oznakowanych od I do XXI). Spośród 17 haplotypów stwierdzonych w populacjach B. humilis, najwyższe frekwencje osiągnęły haplotypy I i II (57,0 i 28,5%, odpowiednio), jednocześnie były to haplotypy szeroko rozprzestrzenione. Obecność tylko dwóch haplotypów cpDNA na Polesiu Lubelskim, podobnie jak wcześniejsze analizy mikrosatelitarnego DNA [1], podważa hipotezę o refugium glacjalnym B. humilis na tym obszarze. Analiza cpDNA potwierdziła wysoką zmienność genetyczną niektórych populacji B. humilis z północno-wschodniej Polski. Wysoka zmienność genetyczna brzozy niskiej na tym obszarze może być następstwem istnienia refugium peryglacjalnego w czasie plejstocenu A U T O R E F E R A T | 19 albo efektem mieszania się linii filogenetycznych. Brak korelacji między zróżnicowaniem genetycznym i odległością między populacjami (brak izolacji przez dystans) potwierdza wynik analizy mikrosatelitarnego DNA, że brzoza niska mogła przetrwać maksimum ostatniego zlodowacenia na wyższych szerokościach geograficznych. Pozostałe wyniki analizy cpDNA przemawiają na korzyść drugiej hipotezy – kontaktu różnych linii filogenetycznych. Po pierwsze, w tej części zasięgu gatunku wystąpiły pojedyncze prywatne haplotypy, co byłoby nietypowe dla byłego izolatu glacjalnego. Po drugie, wysokiej różnorodności haplotypów na Białorusi, w północnej Polsce i północno-wschodniej Polsce towarzyszyła wyższa wartość vT (zróżnicowanie haplotypów wyliczone w oparciu o ich frekwencje) niż hT (zróżnicowanie haplotypów wyliczone w oparciu o ich frekwencje i podobieństwo), co wynika z faktu, że w badanych przez nas regionach geograficznych wystąpiły haplotypy cpDNA należące do dwóch haplogrup. Na obszarze byłego refugium powinny występować haplotypy reprezentujące tylko jedną linię filogenetyczną. Powyższe wyniki wskazują, że najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem dla opisanej wysokiej zmienności genetycznej w niektórych populacjach brzozy niskiej usytuowanych w północnowschodniej Polsce, jak również na Białorusi, jest mieszanie się fal migracji pochodzących z różnych refugiów glacjalnych. Na korzyść tej hipotezy przemawia także stwierdzenie na badanym obszarze struktury filogeograficznej, której dowodzi istotnie wyższa wartość zróżnicowania genetycznego wyliczonego na podstawie podobieństwa i częstości haplotypów (NST) w porównaniu z wartością zróżnicowania genetycznego wyliczonego tylko na podstawie frekwencji haplotypów (GST). Rozkład haplotypów w badanej części zasięgu B. humilis, lokalizacja obecnych populacji brzozy niskiej oraz wyniki badań paleobotanicznych sugerują, że brzoza niska mogła przetrwać maksimum ostatniego zlodowacenia w Europie Wschodniej, drugie refugium mogło znajdować się na przedgórzu Alp albo/i w Karpatach. Współczynnik introgresji (IG) między B. humilis i blisko spokrewnionymi brzozami drzewiastymi – B. pendula i B. pubescens - wyniósł 0,71, co wskazuje, że odsetek haplotypów wspólnych dla tych gatunków jest znaczny. Geograficzny rozkład wspólnych haplotypów u analizowanych brzóz jest podobny, co wynika najprawdopodobniej z wysokiego poziomu przepływu genów między B. humilis a B. pendula i B. pubescens. Intensywną wymianę genów popiera wynik testu AMOVA, który pokazuje brak różnic genetycznych między brzozą niską a brzozami drzewiastymi (FCT=-0,031, P=0,563). [3] Jadwiszczak K.A., Drzymulska D., Banaszek A., Jadwiszczak P. 2012. Population history, genetic variation and conservation status of the endangered birch species Betula nana L. in Poland. Silva Fennica 4: 465-477. Głównymi celami naszej pracy była ocena zasobów zmienności genetycznej w polskich populacjach brzozy karłowatej oraz określenie ich przynależności filogenetycznej. A U T O R E F E R A T | 20 Do realizacji tych celów wybraliśmy dwa rodzaje markerów molekularnych: 11 loci jądrowego mikrosatelitarnego DNA oraz trzy fragmenty niekodujące cpDNA. Generalnie, parametry zmienności genetycznej, takie jak: średnia liczba alleli w locus (A), obserwowana (HO) i spodziewana heterozygotyczność (HE) w loci mikrosatelitarnego DNA, w populacjach brzozy karłowatej były niższe niż u brzozy niskiej [1]. Najniższe wartości tych parametrów odnotowaliśmy w dwóch populacjach sudeckich. Obniżenie poziomu zmienności genetycznej na analizowanych stanowiskach B. nana może wynikać z kilku czynników. Po pierwsze, są to populacje małe, dlatego też głównym mechanizmem redukującym zasoby zmienności genetycznej jest dryf genetyczny. Silnym dowodem na działanie dryfu są liczne allele prywatne, z których większość wystąpiła z frekwencjami wyższymi niż 0,05. Po drugie, wykazaliśmy, że liczebność osobników we wszystkich polskich populacjach brzozy karłowatej uległa znaczącej redukcji prawdopodobnie w trakcie ekspansji polodowcowej (program M_P_VAL). Ponadto, przeprowadzone przy pomocy programu BOTTLENECK testy wykazały, że populacje „Linje” z Pojezierza Chełmińskiego oraz „Torfowiska Doliny Izery” z Sudetów przeszły niedawno redukcję liczebności. Konsekwencją redukcji liczby osobników było obniżenie poziomu zmienności genetycznej. Trzecim czynnikiem redukującym zmienność genetyczną na polskich stanowiskach B. nana jest dobór naturalny. Postulowaliśmy, że czynnikiem działania doboru mogą być gatunki konkurencyjne, które zarastając siedliska brzozy, pogarszają jej warunki bytowe i prowadzą do braku rozrodu generatywnego, przynajmniej w niektórych sezonach wegetacyjnych. Po czwarte, izolacja geograficzna poszczególnych populacji sprawia, że niemożliwa jest między nimi wymiana genów, co wzmacnia efekty działania dryfu genetycznego i doboru naturalnego. Potwierdza to zarówno miara zróżnicowania genetycznego (FST) dla mikrosatelitarnego DNA, która była istotna statystycznie dla wszystkich par populacji, jak również analiza struktury genetycznej (program STRUCTURE) ukazująca, że każda z polskich populacji brzozy karłowatej stanowi wyraźnie odrębną jednostkę. Analiza cpDNA wykazała, że w polskich populacjach brzozy karłowatej występują tylko dwa haplotypy: haplotyp I w populacjach „Linje” i „Torfowisko pod Zieleńcem”, a na „Torfowiskach Doliny Izery” haplotyp II. Te dwa haplotypy są najczęstsze w populacjach innych europejskich gatunków z rodzaju Betula. Jako że Europa była generalnie rekolonizowana przez brzozy z dwóch refugiów – wschodniego i zachodniego, a fale migracji weszły w kontakt m. in. na obszarze Polski, jednym z możliwych wyjaśnień stwierdzonego przez nas rozkładu haplotypów cpDNA u B. nana jest strefa kontaktu linii filogenetycznych. Na obecnym etapie badań nie możemy, jednakże, wykluczyć, że pierwotnie w polskich populacjach brzozy karłowatej występowało więcej haplotypów cpDNA, które na skutek działania dryfu genetycznego zostały wyeliminowane. A U T O R E F E R A T | 21 [4] Jadwiszczak K.A. 2012. What can molecular markers tell us about the glacial and postglacial histories of European birches? Silva Fennica 5: 733-745. W tej pracy przeanalizowałam rozkład zmienności genetycznej (fragmenty restrykcyjne cpDNA, mikrosatelity jądrowe i chloroplastowe) w obrębie zasięgów czterech europejskich brzóz: B. pendula, B. pubescens, B. humilis i B. nana, w celu porównania ich historii glacjalnej i postglacjalnej. U wszystkich badanych gatunków zdecydowanie dominują dwa haplotypy cpDNA. W drzewach filogenetycznych, wykreślonych dla poszczególnych gatunków, haplotypy te zajmują centralną pozycję, co wskazuje na ich ancestralne pochodzenie. Różnica trzech mutacji pomiędzy dominującymi haplotypami sugeruje, że powstały one przed maksimum ostatniego zlodowacenia. Z rozkładu najczęstszych haplotypów wynika, że jedno refugium brzóz mogło znajdować się na wschodzie, a drugie na zachodzie kontynentu. Brak zależności między zróżnicowaniem genetycznym a odległością między populacjami (brak izolacji przez dystans) u B. pendula, B. pubescens i B. humilis może wskazywać, że maksimum ostatniego zlodowacenia gatunki te przetrwały na wyższych szerokościach geograficznych. Populacje pozostające na obszarze byłych izolatów glacjalnych charakteryzują się zazwyczaj wysokim poziomem zmienności genetycznej (Hewitt 2000, Nature 405; Hampe i Petit 2005, Ecol. Lett. 8). W oparciu o te stwierdzenie można przypuszczać, że główne fale migracji postglacjalnej B. pendula wzięły swój początek z izolatów znajdujących się na pogórzu Alp i Uralu. Również B. pubescens mogła przetrwać ostatnie zlodowacenie w refugium uralskim, o czym świadczy wysoka zmienność cpDNA w tej części zasięgu gatunku. Nie wiadomo, co jest przyczyną wysokiego poziomu zmienności genetycznej w skandynawskich populacjach B. pendula, B. pubescens i B. nana. Możliwe wyjaśnienia to: izolacja w mikrorefugiach, powstawanie lokalnych mutacji (B. pendula) oraz, w przypadku B. nana i B. pubescens, hybrydyzacja. Po ustąpieniu lodowca wschodnie i zachodnie fale rekolonizacji europejskich gatunków Betula rozprzestrzeniły się po kontynencie tworząc w Skandynawii, Europie Zachodniej i Centralnej szerokie strefy kontaktu. Podobne rozkłady haplotypów w zasięgach wszystkich analizowanych brzóz silnie sugerują znaczący poziom hybrydyzacji międzygatunkowej, co niestety, utrudnia interpretację wyników analiz filogeograficznych. [5] Jadwiszczak K.A., Banaszek A., Chrzanowska A., Kłosowski S., Sozinov O.V. 2014. The admixture zone of Betula humilis Schrk. phylogenetic lineages follows the eastern central European suture zone. Plant Ecology & Diversity, DOI: 10.1080/17550874.2014.893593 Poprzednie badania, przeprowadzone w oparciu o mikrosatelitarny DNA i markery cpDNA, wykazały wysoki poziom zmienności genetycznej w niektórych populacjach B. A U T O R E F E R A T | 22 humilis z północno-wschodniej Polski i centralnej Białorusi. Sugerowaliśmy, że przyczyną tego może być mieszanie się linii filogenetycznych. Jednakże, zbyt mała liczba populacji (3) z obszaru peryglacjalnego nie pozwoliła w sposób przekonujący rozstrzygnąć, czy znaczna zmienność genetyczna brzozy niskiej w północno-wschodniej Polsce wynika z dziedzictwa refugium peryglacjalnego czy jest konsekwencją mieszania się fal migracji pochodzących z odrębnych izolatów lodowcowych. Przy pomocy metody PCR-RFLP przeanalizowaliśmy zróżnicowanie haplotypów cpDNA w ośmiu dodatkowych populacjach brzozy niskiej z północno-wschodniej Polski, zachodniej Białorusi i Łotwy oraz określiliśmy wysokość indeksu rzadkości (DW; rarity index), będącego miarą dywergencji populacji, na 27 analizowanych dotąd stanowiskach B. humilis. Nie stwierdziliśmy innych populacji o wysokim zróżnicowaniu genowym (HE) niż te opisane wcześniej [2]. W żadnej z ośmiu populacji nie odnotowaliśmy haplotypów prywatnych. Policzone w 27 populacjach brzozy wartości indeksu DW były niskie, od 0,034 (populacja LL z Łotwy) do 3,363 (populacja SLU z Białorusi). Na obszarze Polski najwyższe wartości DW wystąpiły w populacjach JM (3,062) i ROS (3,107), które znajdują się na terenie objętym ostatnim zlodowaceniem. Jako że wysokość indeksu rzadkości zależy od liczby prywatnych haplotypów, które ulegają nagromadzeniu na skutek długotrwałej izolacji (np. w refugiach), otrzymane przez nas wyniki pozwalają definitywnie odrzucić hipotezę o refugium peryglacjalnym B. humilis na terenie północno-wschodniej Polski. Zatem, wysoka zmienność genetyczna populacji brzozy niskiej z tego obszaru jest skutkiem wymieszania się linii filogenetycznych. Wniosek ten popiera wykazanie przez nas struktury filogeograficznej (NST jest istotnie wyższe od GST) na obszarze ciągnącym się od północno-wschodniej Polski aż po centralną Białoruś. Strefa mieszania się linii filogenetycznych brzozy niskiej, razem ze strefami kontaktu i hybrydyzacji kilku innych gatunków tworzą tzw. suture zone, przebiegającą przez wschodnią część Europy Centralnej. PODSUMOWANIE Przeprowadzone przeze mnie analizy filogeograficzne w zagrożonych wyginięciem populacjach B. nana i B. humilis sugerują, że obszar naszego kraju został skolonizowany przez fale migracji brzóz krzewiastych pochodzące z różnych refugiów lodowcowych, znajdujących się prawdopodobnie w Europie Wschodniej oraz Centralnej lub Zachodniej. Przypuszczenie takie pokrywa się z opisem przebiegu rekolonizacji postglacjalnej u brzóz drzewiastych. Nie potwierdziły się jednak hipotezy o możliwości przetrwania brzozy niskiej ani na Polesiu Lubelskim, ani w izolacie peryglacjalnym w północno-wschodniej Polsce. A U T O R E F E R A T | 23 Większość marginalnych populacji B. humilis reprezentuje stosunkowo wysoki poziom zmienności genetycznej, porównywalny z poziomem zmienności w subcentralnych populacjach na Białorusi. Taki rozkład zmienności genetycznej nie odpowiada modelowi „centrum-peryferia”. Spośród polskich populacji najbardziej zmienne genetycznie okazały się te usytuowane w północno-wschodniej części kraju. Moje badania wskazują, że może to wynikać z mieszania się linii filogenetycznych. Jednak w niektórych populacjach brzozy niskiej odnotowałam pierwsze oznaki spadku poziomu zmienności genetycznej. Jest to następstwem małej liczebności osobników oraz izolacji geograficznej tych stanowisk. Polskie populacje B. nana są całkowicie izolowane nawzajem od siebie oraz innych populacji tego gatunku. Brak przepływu genów między populacjami brzozy karłowatej wzmacnia efekty działania doboru naturalnego i dryfu genetycznego, czego skutkiem są niskie wartości parametrów zmienności genetycznej. Znaczna liczba prywatnych alleli w loci mikrosatelitarnego DNA oraz wysokie frekwencje niektórych alleli sugerują, że proces różnicowania się genetycznego poszczególnych polskich stanowisk B. nana może być zaawansowany. Rozpoznanie zasobów zmienności genetycznej naturalnych populacji i zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za ich powstanie, utrzymywanie się lub zanikanie jest jednym z kluczowych etapów w planowaniu strategii ochrony światowej bioróżnorodności. Przeprowadzone badania dostarczają wiedzy niezbędnej do podjęcia właściwych zabiegów konserwatorskich nie tylko w polskich populacjach zagrożonych gatunków brzóz, ale mogą stanowić ważną pomoc przy działaniach nacelowanych na ochronę tych roślin w innych częściach ich zanikających zasięgów.
