Wykrywanie GMO - Marcin Filipecki

Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
Genetycznie modyfikowana żywność i pasze
Streszczenie zajęć
Blisko 50 różnych GMO jest dopuszczonych do stosowania w Unii Europejskiej jako żywność lub
pasza. Podczas zajęć wyizolowane zostanie DNA z produktów żywnościowych i pasz znajdujących się
na rynku polskim w celu analizy metodą PCR w czasie rzeczywistym. Przeprowadzone będzie
oznaczenie obecności białka Cry1Ab w kukurydzy MON810 z wykorzystaniem szybki ego testu
paskowego
W wyniku ćwiczeń:
- uzyskana będzie ogólna wiedza na temat metod analizowania w tym ilościowego oznaczania GMO w
Unii Europejskiej
- zrozumiane zostaną etapy prowadzące do detekcji i analizy ilościowej GMO
- wykonane będzie oznaczenie białka Cry1Ab metodą ELISA
- z żywności i paszy dostępnej na rynku polskim wyizolowane będzie DNA metodą na kolumienkach
ze złożem krzemionkowym
- zrozumiana będzie zasada stosowania pozytywnych i negatywnych kontroli w analizach GMO
Opis i protokoły ćwiczeniowe
Rozwój genetyki, technik biologii molekularnej i biotechnologii roślin umożliwił klonowanie genów i
przenoszenie ich do żywych komórek, z których możliwe jest odtworzenie całego organizmu – rośliny,
mikroorganizmu lub zwierzęcia, znanego jako Genetycznie Zmodyfikowany Organizm (GMO). GMO to
organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób
niezachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji. W
roślinach zidentyfikowano i zmieniono wiele genów. Metody klasycznej hodowli wsparte technikami
inżynierii genetycznej doprowadziły do wyhodowania roślin GM z cechami odporności na owady czy
wirusy, tolerancyjności herbicydów, zmienionym składzie aminokwasowym lub kompozycji kwasów
tłuszczowych, obniżonym poziomie niekorzystnych substancji jak kofeina, itd. Rośliny GM w 2014 roku
uprawiano na świecie na powierzchni ponad 174 milionów hektarów. Najwyższy wzrost powierzchni
upraw roślin GM obserwowany jest w krajach rozwijających się. Najczęściej modyfikowane są rośliny
o dużym znaczeniu gospodarczym. Na świecie uprawia się przede wszystkim soję GM, kukurydzę i
bawełnę.
Odporność na owady typu Bt to cecha umożliwiająca ochronę roślin na polu uprawnym przed
szkodnikami, zmniejszenie ilości zabiegów ochronnych i uniknięcie stosowania ścisłych terminów
oprysków ochronnych. Stała się jedną z najbardziej popularnych modyfikacji roślin. Zmodyfikowane
Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
rośliny z cechą Bt mają nowe geny odpowiedzialne za produkcję białek o cechach insektycydu (białka
Cry).Przykładem modyfikacji tego typu jest modyfikacja kukurydzy MON810. Kukurydza MON810 jest
rośliną transgeniczną dopuszczoną do uprawy w Unii Europejskiej. Odmiana ta jest odporna na
najważniejszego szkodnika kukurydzy- omacnicę prosowiankę (Ostrinia nubilalis L.) dzięki
wprowadzonemu genowi cry1Ab z bakterii Bacillus thuringensis. Białko Cry1Ab wiąże się specyficznie
do receptorów obecnych w przewodzie pokarmowym gatunków z rzędu motyle (Lepidoptera) i
powoduje zaburzenia w przepływie jonów, perforacje błony przewodu pokarmowego, a w
konsekwencji śmierć owada. Białko Cry1Ab znajduje się pod kontrolą zmienionego promotora 35s z
wirusa mozaiki tytoniu CaMV wraz z wzmacniaczem (enhancerem -E35S).
Rys 1. Konstrukt plazmidowy użyty do transformacji kukurydzy MON810( źródło: agbios.com)
Metody wykrywania genetycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO)
Metody wykrywania i ilościowego oznaczania GMO opisane poniżej dotyczą wykrywania
organizmów transgenicznych w materiale roślinnym a także w produktach żywnościowych i paszach
pochodzenia roślinnego. Dwie główne grupy metod detekcji i oznaczania ilościowego GMO, używane
powszechnie, stanowią metody oparte na analizie DNA oraz metody analizujące białka.
PCR
W Europie najczęściej stosowana jest metoda oparta na reakcji PCR (łańcuchowej reakcji
polimerazy). Pozwala ona na powielenie wybranego fragmentu DNA w bilionach kopii. Do reakcji PCR
niezbędne są startery (oligonukleotydy komplementarne do fragmentów DNA w rejonach granicznych
powielanej sekwencji, o długości ok. 20 par zasad), polimeraza DNA, odpowiednie środowisko reakcji,
jony magnezu niezbędne do działania polimerazy oraz deoksynukleotydy (dNTP). Reakcja PCR
składa się z trzech etapów: denaturacja DNA zachodząca w 95ºC, przyłączanie starterów (temp ok.
45-65ºC) i synteza DNA przez polimerazę (temp. ok. 72ºC). Powieleniu ulega fragment sekwencji
leżący pomiędzy miejscami przyłączenia starterów. Podczas wielokrotnego powtarzania tego cyklu
Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
ilość produktu rośnie w tempie wykładniczym. Po 20 cyklach otrzymuje się około milion razy więcej
kopii danego fragmentu niż na początku pierwszego cyklu. Metoda ta wykorzystywana jest do analiz
przesiewowych i jakościowego oznaczania GMO.
Real Time PCR
Analiza ilościowa kwasów nukleinowych metodą PCR w czasie rzeczywistym, czyli Real Time
PCR umożliwia określenie zawartości danej modyfikacji DNA w badanej próbie. Technika ta, dzięki
zastosowaniu specyficznych barwników fluorescencyjnych lub wyznakowanych odpowiednimi
fluorochromami sond molekularnych, umożliwia obserwację zmian w stężeniu produktu PCR w czasie
trwania reakcji. W metodzie stężenie amplifikowanego DNA jest monitorowane w każdym cyklu reakcji
poprzez pomiar intensywności fluorescencji, która jest proporcjonalna do ilości produktu. Barwniki
fluorescencyjne wykorzystywane w tej metodzie działają na dwa sposoby. Pierwsza strategia działania
to wiązanie się barwników bezpośrednio do podwójnej nici DNA (np. SYBR Green). Druga, droższa od
poprzedniej ale bardziej specyficzna, wykorzystuje sondy znakowane barwnikami fluorescencyjnymi
(np. sondy typu TaqMan, Molecular Beacons, Scorpion). Fluorescencja emitowana przez barwnik jest
rejestrowana przez kamerę i przekazywana do komputera. Dzięki temu wynik reakcji Real Time PCR
jest widoczny na monitorze w postaci krzywej amplifikacji, która oddaje zależność natężenia
fluorescencji w stosunku do czasu trwania reakcji PCR. W początkowych cyklach powolne powielanie
produktu rejestrowane jako niski poziom fluorescencji tła (ang. background). W późniejszych etapach
wzrastające stężenie produktów reakcji powoduje przyrost fluorescencji. Cykl w którym fluorescencja
przekracza poziom tła nazywamy cyklem progowym – Ct (ang. treshold cycle). Cykl Ct charakteryzuje
początek wczesnej fazy logarytmicznej PCR. Określenie cykli progowych dla badanych prób pozwala
na porównanie ich pod względem zawartości sekwencji rozpoznawanych przez oligonukleotydy
wykorzystane w reakcji PCR. Im więcej modyfikacji genetycznej w próbie tym we wcześniejszym cyklu
fluorescencja przekroczy poziom tła i pojawi się krzywa amplifikacji produktu.
W reakcji Real Time PCR wykorzystuje się dwa zestawy starterów (i sond), jeden dla szukanej
modyfikacji, drugi dla genu referencyjnego. Dzięki temu możliwe jest ilościowe oznaczenie tej
Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
modyfikacji. Gen referencyjny jest to sekwencja gatunkowo-specyficzna, występująca w pojedynczej
kopii w genomie haploidalnym. Gen ten powinien być reprezentatywny dla różnych linii czy odmian w
ramach gatunku oraz powinien być powielany podczas analizy w taki sam sposób jak modyfikacja
genetyczna. Nie należy go mylić z genem referencyjnym używanym w analizach ekspresji genów.
W metodach oznaczania zawartości GMO w próbie wykorzystuje się certyfikowane materiały
odniesienia, czyli mączki lub izolaty DNA, w których znana jest procentowa zawartość danej
modyfikacji genetycznej. Na podstawie materiałów odniesienia konstruowana jest krzywa wzorcowa.
Wynik Ct uzyskany dla próbki odnosi się do wartości z krzywej standardowej. Ilość GMO w badanej
próbie określa się jako procent danej modyfikacji genetycznej w odniesieniu do danego składnika np.
0,8% DNA kukurydzy MON810 w kukurydzy.
Metody wykrywania GMO wykorzystujące amplifikację PCR, ze względu na specyficzność dzieli się
na:
1. Metody przesiewowe (ang. screening). Pozwalają na wykrycie wielu linii transgenicznych roślin,
bez identyfikacji konkretnego zdarzenia transformacyjnego. Najczęściej analizuje się
obecność promotora 35S lub terminatora nos, które są najczęściej spotykanymi elementami
genetycznymi w roślinach transgenicznych.
2. Metody specyficzne dla genu- oznaczana jest obecność transgenu lub innych elementów
konstruktu np. genów markerowych
3. Metody specyficzne dla konstruktu (ang. construct specific)- amplifikowany jest fragment
sekwencji DNA charakterystyczny dla wektora użytego do transformacji.
4. Metody specyficzne dla zdarzenia transformacyjnego (ang. event specific)- pozwalają na
wykrycie konkretnej modyfikacji np. MON810, GA21, TC1507. W reakcji PCR amplifikowany
jest fragment na styku DNA genomowego i konstruktu użytego do transformacji.
Ćwiczenia praktyczne
Izolacja DNA przy zastosowaniu zestawu NucleoSpin® Food (Macherey Nagel).
Do izolacji DNA próbki powinny być reprezentatywne do próbki laboratoryjnej, możliwie
homogenne, rozdrobnione. Pozostałości struktur tkankowych i komórkowych są solubilizowane
poprzez lizę w specjalnym buforze, który zapewnia integralność i ilościowy odzysk DNA. Proteinaza K
degraduje białka komórkowe, w tym białka wiążące DNA i nukleazy. Dodanie kolejnego roztworu
umożliwia precypitację organicznych i nieorganicznych substancji, m.in.: białek, pozostałości
komórkowych, inhibitorów enzymatycznych. Następnie DNA zawarte w lizacie jest wiązane do
minikolumny w obecności buforu zawierającego sole chaotropowe i etanolu. Zanieczyszczenia
związane do złoża są skutecznie usuwane w trakcie etapów płukania. Elucję oczyszczonego DNA
wykonuje się buforem niskosolnym, np.: zawierającym Tris-HCl. Oczyszczony preparat DNA po
zmierzeniu stężenia, ewentualnym rozcieńczeniu jest gotowy do reakcji PCR.
Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
Przygotować następujące roztwory
Bufor C4 (Macherey-Nagel)
Przenieś zawartość buforu C2 do buforu C3 i dobrze wymieszaj. Otrzymany bufor C4 oznakuj.
o
Jest trwały do 4 miesięcy w temperaturze pokojowej +20-25 C i musi być przetrzymywany w
ciemności. Dla lepszego rozpuszczenia komponentów buforu można je umieścić na 5 minut w
o
45 C.
Bufor C5 (Macherey-Nagel)
Do buteleczki z buforem C5 dodać odpowiednią ilość absolutnego etanolu (zgodnie z
o
zaleceniami producenta), przechowywać w temp. 20-25 C przez 1 rok.
Bufory CF, CQW znajdują się w zestawie
Sposób postępowania
Liza komórkowa
1. Próbkę do badania poddać homogenizacji/rozdrobnieniu. Pobrać 200 mg zhomogenizowanej
3
próbki analitycznej do opisanej probówki o pojemności 2,0 cm Dodać 550 μl (lub 750 μl dla
matryc o większej chłonności) ogrzanego do 65oC buforu CF. Ostrożnie wymieszać (15s).
2. Dodać 10 μl (lub 13,6 μl dla matryc o większej chłonności) proteinazy K (20 μg/ μl). Krótko
zamieszać (2-3s).
3. Inkubować w 65oC przez minimum 30 min. (można również overnight)
4. Wirować 10 min. >10 000 x g w temperaturze pokojowej.
5. Wstawić do ogrzania bufor CE (70oC).
Przygotowanie próbki do związania DNA na kolumnie.
6. Odpipetować 300 μl czystego supernatantu do probówki 1,5 ml.
7. Dodać 300 μl buforu C4 i 300 μl etanolu. Mieszać 30 s.
Wiązanie DNA na kolumnie.
8. Umieścić kolumienkę NucleoSpin Food w nowej probówce 2 ml. Pipetą nanieść na kolumnę
750 μl roztworu.
9. Wirować 1 min. 11 000 x g. Odrzucić przesącz.
Przemywanie kolumny.
o
10. 1 przemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę 400 μl buforu CQW. Wirować 1 min. 11000 x g.
Odrzucić przesącz. W przypadku podejrzenia obecności silnych inhibitorów reakcji PCR w
próbce, powtórzyć przemywanie buforem CQW.
11. 2oprzemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę na kolumnę 700 μl buforu C5. Wirować 1min.
11000 x g. Odrzucić przesącz.
o
12. 3 przemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę na kolumnę ponownie 200 μl buforu C5. Wirować
2 min. 11000 x g. Odrzucić przesącz. Pozostawić kolumienkę otwartą na 5min. w temp.
pokojowej, aby odparowały resztki buforu C5, które mogłyby hamować reakcję PCR.
Elucja DNA z kolumny
13. Umieścić kolumnę w nowej probówce 1,5 ml. Pipetą nanieść na kolumnę 100 μl ogrzanego do
70oC buforu CE.
14. Inkubować 5 min. w temp. pokojowej.
Dr Anna Linkiewicz
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB
LAB-GMO
Maj 2015
15. Wirować 1 min. 11 000 x g. W probówce zbiera się roztwór DNA.
16. Wykonać pomiar stężenia DNA na spektrofotometrze i wynik oznaczenia zapisać w zeszycie
Identyfikacja kukurydzy MON810 przy użyciu testów paskowych ELISA
Materiał badawczy: Mączki i liście z kukurydzy konwencjonalnej i kukurydzy MON810.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Do probówki 2ml zawierającej ok. 200mg mączki kukurydzianej lub liści dodać ok. 300 µl H2O
(8-10 kropli).
2. Zawartość wymieszać patyczkiem przez 1 min i zamknąć probówkę.
3. Umieścić pasek ELISA w probówce (strzałkami do dołu).
4. Odczekać 5-10 minut.
5. Odczytać wynik.
Linia
kontrolna
Linia wyniku
negatywny
pozytywny