(X Triticosecale Witt.) z introgresją chromatyny Aegilops spp.

(X Triticosecale Witt.) z introgresją chromatyny Aegilops spp.

Instytut Genetyki Roślin
Polskiej Akademii Nauk
Michał Kwiatek
Analiza genetyczna form pszenżyta ozimego
(X Triticosecale Witt.) z introgresją chromatyny
Aegilops spp.
AUTOREFERAT
Praca doktorska
wykonana pod kierunkiem
dr hab. Haliny Wiśniewskiej, prof. IGR PAN
Poznań, 2013
1.
Streszczenie
Pszenżyto (X Triticosecale Witt.) jako rodzaj całkowicie syntetyczny posiada wąski zakres
zmienności genetycznej z racji braku przejścia procesu ewolucji. Krzyżowania międzygatunkowe
i międzyrodzajowe dają możliwość wytworzenia nowych genotypów pszenżyta ze znacznie
korzystniejszymi cechami w porównaniu do form wyjściowych, tym bardziej, że w ostatnim czasie
nastąpiło drastyczne załamanie odporności pszenżyta na rdzę brunatną powodowaną przez Puccinia
triticiana, mączniaka prawdziwego powodowanego przez Blumeria graminis, fuzariozę powodowaną
przez Fusarium spp. oraz łamliwość źdźbła powodowaną przez Oculimacula yallundae
i O. acuformis.
Dzikie gatunki kozieńców, należące do rodzaju Aegilops, są blisko spokrewnione z pszenicą
należącą do rodzaju Triticum oraz z pszenżytem. Posiadają bardzo dużą zmienność genetyczną,
dlatego też stanowią źródło ważnych agronomicznie cech, które mogą być wykorzystane w procesach
hodowlanych, mających na celu ulepszanie pszenicy i pszenżyta uprawnego.
Materiałem użytym w badaniach były cztery gatunki poliploidalne kozieńców [Aegilops
biuncialis (UUMM, 2n=4x=28), Aegilops ovata (UUMM, 2n=4x=28), Aegilops kotschyi (UUSS,
2n=4x=28), Aegilops variabilis (UUSS, 2n=4x=28)] oraz jeden gatunek diploidalny Aegilops
squarrosa (Triticum tauschii, DD, 2n=2x=14), a także formy amfiploidalne Aegilops spp. × Secale
cereale
oraz
kolejne pokolenia
mieszańcowe uzyskane z obustronnych
krzyżowań form
amfiploidalnych z pszenżytem uprawnym (odmiany: Bogo, Kitaro, Lamberto, Moreno i Secundo oraz
linia 8/88).
Celem prowadzonych badań było wprowadzenie chromatyny Aegilops do pszenżyta
heksaploidalnego a następnie określenie struktury chromosomowej uzyskanych mieszańców oraz
śledzenie ewentualnych zmian strukturalnych w kolejnych pokoleniach przy użyciu technik
cytogenetyki molekularnej. W tym celu dokonano identyfikacji poszczególnych chromosomów przy
użyciu markerów cytogenetycznych, techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)
w gatunkach: Ae. umbellulata (UU, 2n=2x=14), Ae. comosa (MM, 2n=2x=14) i Ae. longissima
(SlSl, 2n=2x=14) i Ae. sharonensis (SshSsh, 2n=2x=14), będących ewolucyjnymi przodkami gatunków
poliploidalnych, użytych w prezentowanym doświadczeniu.
W celu określenia składów chromosomowych badanych form zastosowano techniki
cytogenetyki molekularnej polegające na hybrydyzacji sond molekularnych z DNA w chromosomach
in situ. W prezentowanych badaniach genomowe DNA analizowanych gatunków posłużyło do
kategoryzacji chromosomów a cztery sekwencje powtarzalne: pSc 119.2 (otrzymana z żyta S. cereale)
oraz pAs1 (otrzymana z Ae. tauschii) oraz 35S rDNA i 5S rDNA służyły do identyfikacji
poszczególnych chromosomów.
Badania polegały na
analizie cytogenetycznej i molekularnej form wyjściowych (Ae.
biuncialis, Ae. ovata, Ae. kotschyi, Ae. variabilis i Ae. tauschii), amfiploidów Aegilops ssp. × S.
1
cereale oraz mieszańców (Aegilops ssp. × S. cereale) × pszenżyto. Wykazano różnice w lokalizacji
sekwencji powtórzeniowych pomiędzy analogicznymi chromosomami genomów wchodzących
w skład form wyjściowych i form mieszańcowych. Lokalizacja sygnałów w chromosomach genomu
M i S była bardziej zróżnicowana niż w chromosomach genomu U i D.
Identyfikowano także geny związane z odpornością na rdzę brunatną (powodowaną przez
Puccinia triticiana), mączniaka prawdziwego (powodowanego przez Blumeria graminis) oraz
łamliwość podstawy źdźbła (powodowaną przez Oculimaculla yallundae i O. acuformis) z pomocą
zweryfikowanych markerów molekularnych. Rośliny mieszańcowe posiadające chromatynę rodzaju
Aegilops kotschyi, Ae. variabilis, Ae. ovata i Ae. biuncialis są źródłem kompleksowej odporności na
rdzę (Lr37+Sr38+Yr17). Wyprowadzono również mieszańce posiadające chromosomy Ae. variabilis
lub Ae. tauschii, które są źródłem odporności na rdzę brunatną warunkowaną przez gen Lr39. Ponadto,
otrzymane rośliny mieszańcowe posiadające chromosomy Ae. variabilis cechują się obecnością genu
Pm13 (odporność na mączniaka prawdziwego).
Mieszańce pszenżyta z translokacjami chromatyny kozieńców o ustabilizowanej strukturze
i pożądanych cechach argonomicznych mogą być formami przeznaczonymi do dalszych prac
hodowlanych.
Praca częściowo została wykonana w ramach projektu finansowanego przez Narodowe Centrum
Nauki:
Nr projektu: UMO-2012/05/N/NZ9/01563
Tytuł projektu: Identyfikacja chromosomów w gatunkach diploidalnych i tetraploidalnych
kozieńców (Aegilops spp.) oraz w formach mieszańcowych w obrębie plemienia Triticeae
przy użyciu markerów cytogenetycznych
Kierownik projektu i wykonawca: Michał Kwiatek
2.
Wstęp
Pszenżyto uprawne (X Triticosecale Witt.) jest syntetycznym allopoliploidem pozyskanym
w obrębie plemienia Triticeae. Jest to mieszaniec międzyrodzajowy powstały w wyniku skrzyżowania
pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) i żyta (Secale cereale L.). Krzyżowania międzygatunkowe
oraz międzyrodzajowe są powszechnie stosownym narzędziem hodowli klasycznej w celu uzyskania
nowych gatunków (lub rodzajów), a także w celu poszerzania zmienności genetycznej już istniejących
taksonów. Wytworzenie zboża łączącego zalety pszenicy zwyczajnej i żyta było jednym z celów
hodowli końca XIX i XX wieku. Pszenica zwyczajna jest gatunkiem o stosunkowo dużych
wymaganiach glebowych, w przeciwieństwie do żyta, które może być uprawiane na lekkich,
piaszczystych glebach (Tarkowski 1975). Jest także gatunkiem dość wrażliwym na choroby grzybowe
(Wiśniewska i in. 2003, Wiśniewska i Kowalczyk 2005), szkodniki (Friebe i in. 1990), a także cechuje
2
się wrażliwością na deficyt wody (Saint Pierre i in. 2012). Co więcej, ziarno pszenicy posiada większą
zawartość białka i innych składników żywieniowych, które wpływają na wysoką jakość mąki
(Tarkowski 1989). Żyto natomiast jest zbożem o stosunkowo wysokiej odporności na stresy biotyczne
i abiotyczne (Rakowska 1994).
Pszenżyto stanowi obiecującą alternatywę dla żyta w użytkowaniu ziarna na paszę, przede
wszystkim jako odmiany ozime, dające wyższe plony o lepszych parametrach jakościowych ziarna.
Aktualnie (stan na 15.01.2013r.) w Krajowym Rejestrze Odmian znajduje się 38 odmian pszenżyta
ozimego oraz 9 odmian pszenżyta jarego. Podstawowym kierunkiem wykorzystania pszenżyta jest
produkcja pasz, głównie ze względu na wysoką zawartość białka o korzystnym składzie
aminokwasowym i wysokim współczynniku strawności (Arseniuk i Oleksiak 2002). Ze względu na
sposób wyprowadzania pszenżyta możemy wyróżnić pszenżyto pierwotne i wtórne (Kiss i Videki
1971). Pszenżyto pierwotne otrzymane jest poprzez krzyżowanie pszenicy z żytem, a następnie
kolchicynowanie płonych roślin pokolenia F1. W zależności od ploidalności pszenicy dobranej do
krzyżowania z żytem diploidalnym, uzyskuje się pszenżyto oktoploidalne (AABBDDRR),
heksaploidalne (AABBRR) i tetraploidalne (AARR). Zamierzony cel hodowców w uzyskaniu formy
mieszańcowej pszenicy z żytem został w pewnym sensie osiągnięty poprzez uzyskanie wtórnych form
pszenżyta heksaploidalnego. Według Merkera (1976) przewagę pszenżyta wtórnego nad pszenżytem
pierwotnym można wyjaśnić w trojaki sposób. Po pierwsze, chromosomy genomów A i B pochodzące
z form o różnym poziomie ploidalności koniugują ze sobą tworząc wtórne pszenżyto, zatem
wprowadzają pożądaną w hodowli zmienność genetyczną (Sisodia i McGinnis 1970). Po drugie,
pszenżyto wtórne cechuje się wyraźnie lepszą stabilnością mejotyczną, jednakże istnieją niewielkie
różnice w ilości uniwalentów pomiędzy formami pszenżyta 6x z cytoplazmą heksaploidalnych
i tetraploidalnych pszenic (Thomas i Kaltsikes 1972). Po trzecie, wyprowadzenie pszenżyta wtórnego
daje możliwość uzyskania substytucji chromosomów genomu D w miejsce chromosomów żytnich.
W celach poznawczych powstało wiele form pszenżyta o różnym stopniu poliploidalności oraz
o zróżnicowanym podłożu genetycznym. Wzorem pszenicy, pszenżyto stało się obiektem badań nad
introgresją chromatyny spokrewnionych gatunków. Pierwsze mieszańce oddalone pszenżyta z obcą
cytoplazmą powstały w wyniku krzyżowań z kozieńcami (Aegilops ovata L., Ae. caudata L.) oraz
dziką pszenicą T. timopheevi Zhuk. (Sánchez-Monge 1974).
Kozieńce są roślinami rejonu śródziemnomorskiego. Występują naturalnie od Wysp
Kanaryjskich po zachodnią Azję (Van Slageren 1994). Występowanie w zróżnicowanych warunkach
środowiskowych jest spowodowane szerokimi zdolnościami adaptacyjnymi tych gatunków. Fakt ten
wyjaśnia posiadanie przez gatunki Aegilops wielu ważnych agronomicznie cech, do których zalicza się
przede wszystkim cechy warunkujące odporność lub tolerancję na stresy biotyczne i abiotyczne oraz
cechy poprawiające jakość i strukturę plonu. Przeniesienie obcych genów, które mogą warunkować
pożądane cechy, można osiągnąć poprzez wyprowadzenie linii translokacyjnych za pomocą
krzyżowań oddalonych a następnie krzyżowań wypierających (wstecznych), bądź technik inżynierii
3
genetycznej (transformacja genetyczna, kultury in vitro). W badaniach strukturalnych nad introgresją
chromatyny Aegilops do innych rodzajów plemienia Triticeae powszechnie używane są metody
cytogenetyki molekularnej. Metoda genomowej hybrydyzacji in situ (GISH) pozwala na
dyskryminację chromosomów pochodzących od różnych komponentów użytych w krzyżowaniu. Do
określenia poszczególnych typów chromosomów używa się przede wszystkim metody FISH
(fluorescencyjna hybrydyzacja in situ), która wykorzystuje specyficzne sondy oparte o m.in.: rDNA;
przycentromerowe, interkalarne, bądź przytelomerowe sekwencje satelitarne, a także sekwencje
syntetyczne (sztucznie wygenerowane, krótkie sekwencje nukleotydowe). Powszechnie używana jest
także metoda C-prążków, która umożliwia identyfikację chromosomów poprzez wybarwienie
heterochromatyny.
Identyfikacja agronomicznie wartościowych cech możliwa jest dzięki zastosowaniu metod
genetyki molekularnej. Mając do dyspozycji coraz większą liczbę dostępnych markerów
molekularnych, analizy te głównie sprowadzają się do wykorzystania metod opartych o PCR.
3.
Cel pracy
Jak wykazano we Wstępie, zakres zmienności uprawnego pszenżyta heksaploidalnego jest
ograniczony, ponieważ jest to rodzaj bardzo młody, sztucznie wytworzony przez człowieka i nie
przeszedł ewolucji naturalnej, jak inne gatunki zbóż. Oprócz wielu zalet pszenżyto ma także pewne
niedoskonałości, takie jak niska wartość wypiekowa spowodowana brakiem genomu D pszenicy,
w którym zlokalizowane są najważniejsze geny warunkujące wartość technologiczną, oraz
zwiększająca się podatność na choroby powodowane przez grzyby patogeniczne, takie jak rdza
brunatna i żółta, mączniak prawdziwy i fuzarioza. Prezentowana rozprawa miała na celu zbadanie
możliwości poszerzenia zmienności genetycznej pszenżyta poprzez introgresję chromatyny z dzikich
gatunków rodzaju Aegilops.
Badania obejmowały:
1) wyprowadzenie roślin mieszańcowych Aegilops-pszenżyto poprzez obustronne krzyżowanie form
amfiploidalnych (Aegilops spp. × S. cereale) z pięcioma odmianami i jedną linią hodowlaną
pszenżyta,
2) wyprowadzenie czterech pokoleń roślin mieszańcowych (Aegilops spp. × S. cereale) × pszenżyto
za pomocą samozapyleń i krzyżowań wstecznych i ocenę efektywności krzyżowań,
3) analizę cytogenetyczną ancestralnych form diploidalnych kozieńców (Ae. umbellulata, UU; Ae.
comosa, MM; Ae. sharonensis, SshSsh; Ae. longissima, SlSl; Ae. tauschii, DD) oraz form
tetraploidalnych (Ae. kotschyii, UUSS; Ae. variabilis, UUSS; Ae. biuncialis, UUMM; Ae. ovata,
4
UUMM) a także mieszańców tych form z żytem i pszenżytem. W tym celu identyfikowano
chromosomy mitotyczne i mejotyczne za pomocą fluorescencyjnej i genomowej hybrydyzacji
in situ (FISH/GISH),
4) identyfikację genów odporności na rdzę brunatną (powodowaną przez Puccinia triticiana),
mączniaka prawdziwego (powodowanego przez Blumeria graminis) oraz łamliwość podstawy
źdźbła (powodowaną przez Oculimacula yallundae i O. acuformis) za pomocą zweryfikowanych
markerów molekularnych.
Celem badań było stwierdzenie, w jakim zakresie zastosowane techniki krzyżowań
umożliwiają przeniesienie całych chromosomów lub fragmentów chromatyny gatunków z rodzaju
Aegilops do pszenżyta uprawnego, czy obserwowana introgresja obcej chromatyny jest stabilna
w kolejnych pokoleniach oraz jakie geny warunkujące odporność roślin na choroby zostały
przeniesione do genomu pszenżyta. Cel ten realizowano za pomocą metod genetyki klasycznej oraz
genetyki i cytogenetyki molekularnej.
4.
4.1.
Materiał i metody
Materiał badawczy
Do badań użyto pięciu odmian pszenżyta ozimego (X Triticosecale Witt.): Bogo, Lamberto,
Kitaro, Moreno i Secundo, które uzyskano z firmy DANKO Hodowla Roślin Sp. z o.o. w Choryni
oraz jedną linię 8/88 otrzymaną z kolekcji Instytutu Genetyki Roślin PAN w Poznaniu.
Do krzyżowań z pszenżytem użyto pięciu form amfiploidalnych (Aegilops spp. × S. cereale):

Ae. biuncialis × S. cereale (2n = 6x = 42, UUMMRR),

Ae. ovata × S. cereale (2n = 6x = 42, UUMMRR),

Ae. kotschyi × S. cereale (2n = 6x = 42, UUSSRR),

Ae. viriabilis × S. cereale (2n = 6x = 42, UUSSRR),

Ae. tauschii × S. cereale (2n = 4x = 28, DDRR).
Ziarniaki Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis, Ae. ovata i Ae. tauschii zostały pozyskane
przez Wojciechowską (1996) z kolekcji prof. Feldmana (Weizmann Institute of Science, Rehovot,
Israel). Formy amfiploidalne zostały otrzymane poprzez krzyżowania międzyrodzajowe pomiędzy
Aegilops spp. i żytem odmiany Strzekęcińskie. (Wojciechowska i Pudelska 1999, 2002a, b, 2005).
Ziarniaki żyta (Secale cereale) odmian: Strzękęcińskie oraz Dankowskie Złote (użyte do
analiz cytogenetycznych) otrzymano z firmy nasiennej DANKO Hodowla Roślin Sp. z o.o.
w Choryni. Ziarniaki Aegilops umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae. sharonensis i Ae.
speltoides otrzymano z National Small Grains Germplasm Research Facility, National Small Grains
Collection (Aberdeen, Idaho, USA).
5
4.2.

Metody badawcze
wyprowadzenie mieszańców (Aegilops spp. × S. cereale) × pszenżyto z pomocą krzyżowań
wstecznych i samozapyleń,

określanie żywotności ziaren pyłku przy użyciu 2% roztworu acetokarminu z gliceryną
(stosunek objętościowy 1:1),

analiza efektywności krzyżowań na podstawie średnich z roślin badanych kombinacji
krzyżówkowych, uzyskanych poprzez iloraz liczby otrzymanych ziarniaków przez liczbę
zapylonych kwiatków,

przygotowanie preparatów cytologicznych metodą maceracji enzymatycznej (podziały
mitotyczne) oraz metodą kwasową (podziały mejotyczne),

izolacja genomowego DNA przeznaczonego do analiz cytogenetycznych (Lombard i Delurme
1997),

izolacja genomowego DNA przeznaczonego do analiz molekularnych (Doohan i in. 1998),

izolacja i oczyszczanie plazmidowego DNA (5S, 35S rDNA, pSc 119.2) przy użyciu kitu
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Komórki E. coli TopF10` transformowane DNA
plazmidu pUC19 z insertem pSc 119.2,

amplifikacja sekwencji pAs1 z całkowitego genomowego DNA pszenicy (Triticum aestivum
L.) metodą PCR wg. Nagaki i in. (1995),

amplifikacja insertu w postaci sekwencji pSc119.2, 5S rDNA (Unfried i Gruendler 1990)
i 35S rDNA (Gerlach i Dyer 1980) z plazmidowego DNA metodą PCR,

znakowanie 5S rDNA i pAs1 tetra-metyl-rodaminą metodą PCR Labelling,

znakowanie sekwencji 35 rDNA i pSc 119.2 (Unfried i Gruendler 1990) przy użyciu zestawu
do nicktranslacji (Roche),

genomowa/fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH/GISH),

amplifikacja metodą PCR oraz rozdział elektroforetyczny markerów genów odporności,

analiza polimorfizmu endopeptydazy Ep-D1 sprzężonej z genem Pch1.
5.
5.1.
Wyniki
Krzyżowania
W pierwszym roku doświadczeń przeprowadzono dwukierunkowe krzyżowanie amfiploidów
Aegilops-Secale z pięcioma odmianami pszenżyta (Bogo, Lamberto, Kitaro, Moreno i Secundo) oraz
jedną linią hodowlaną 8/88. Uzyskano 88 roślin pokolenia F1 w jedenastu kombinacjach
krzyżówkowych, w których zapylaczem były formy amfiploidalne oraz 653 ziarniaki w 30
kombinacjach, w których zapylaczem były odmiany lub linia pszenżyta.
6
Ze względu na niską zdolność kiełkowania oraz porażenie ziarniaków patogenami grzybowymi,
uzyskano 24 rośliny pokolenia F1 w jedenastu kombinacjach, w których zapylaczem były formy
amfiploidalne: Secundo × AkSc [pszenżyto odm. Secundo × (Ae. kotschyi × S. cereale)], Secundo ×
AoSc, Kitaro × AkSc, Kitaro × AvSc, Moreno × AkSc, Moreno × AvSc, Moreno × AoSc, Lamberto ×
AvSc, 8/88 × AkSc, 8/88 × AvSc, 8/88 × AoSc; oraz 40 roślin pokolenia F1 w 6 kombinacjach (AkSc ×
Secundo, AvSc × Secundo, AbSc × Secundo, AoSc × Secundo, AvSc × Kitaro i AtSc × Bogo),
w których zapylaczem były odmiany lub linie pszenżyta.
Wszystkie 64 rośliny mieszańcowe pokolenia F1 poddano samozapyleniu bądź krzyżowaniom
wstecznym w kolejnych latach. W kolejnym roku doświadczeń uzyskano 741 ziarniaków, z których
do analiz i dalszego krzyżowania przeznaczono 323 roślin. W następnym roku uzyskano 446
ziarniaków, z których 300 roślin analizowano i przekazano do dalszych krzyżowań. W ostatnim roku
doświadczeń uzyskano 3370 ziarniaków, z których wybrano 206 celem wykonania analiz
genetycznych.
5.2.
Analiza żywotności ziaren pyłku
Analizie żywotności ziaren pyłku poddano 20 roślin każdej z pięciu kombinacji
amfiploidalnych, które następnie użyte zostały do krzyżowań z pszenżytem. Średnia żywotność ziaren
pyłku kształtowała się na poziomie wyższym niż 60% oprócz roślin kombinacji Aegilops tauschii × S.
cereale, których pyłek charakteryzował się średnią żywotnością w wysokości 42,1%. Średnia
żywotność ziaren pyłku użytych form pszenżyta w latach 2009 – 2012 zawierała się w granicach 86%
- 94%. Rośliny pokolenia F1 charakteryzowały się dużą zmiennością żywotności ziaren pyłku (4,8271,21%) w zależności od kombinacji krzyżówkowej. Najwyższą żywotność ziaren pyłku wykazywały
rośliny trzech kombinacji, których komponentem matecznym była linia pszenżyta 8/88. Rośliny
kombinacji pokoleń F2 i BC1F1 cechowały się żywotnością pyłku w zakresie 22,75-74,40%.
Stwierdzono brak żywotnego pyłku w roślinach (Ae. biuncialis × S. cereale) × Secundo. W kolejnym
roku doświadczeń analizie żywotności ziaren pyłku poddano 17 kombinacji krzyżówkowych pokoleń
F3, BC1F2, F1(BC1F1) oraz BC2F1. Rośliny pokolenia BC1F2, kombinacji Secundo × (Ae. kotschyi × S.
cereale) oraz (Ae. kotschyi × S. cereale) × Secundo posiadały pyłek o najwyższej żywotności
(odpowiednio 76,68% i 64,93%), natomiast rośliny pokolenia F1(BC1F2) kombinacji Secundo × (Ae.
kotschyi × S. cereale) charakteryzowały się najbardziej żywotnym pyłkiem (79,15%). W kolejnym
roku doświadczeń najniższe wartości procentowe żywotności ziaren pyłku (10,28% i 10,83%)
obserwowano w roślinach odpowiednio pokolenia F1(BC2F1) oraz pokolenia BC3F1 kombinacji
Secundo (Ae. tauschiii × S. cereale) × Bogo. Natomiast rośliny pokolenia F1(BC1F2) kombinacji
Secundo × (Ae. kotschyi × S. cereale) charakteryzowały się najbardziej żywotnym pyłkiem (79,15%).
7
5.3.
Analizy cytogenetyczne
Celem prowadzonych badań było określenie struktury chromosomowej materiałów
wyjściowych oraz śledzenie ewentualnych zmian strukturalnych w kolejnych pokoleniach przy użyciu
technik cytogenetyki molekularnej. Wykonano mapę fizyczną markerów cytogenetycznych metodą
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w chromosomach gatunków: Ae. umbellulata (UuUu,
2n=2x=14), Ae. comosa (McMc, 2n=2x=14), Ae. sharonensis (SshSsh, 2n=2x=14) oraz Ae. longissima
(SlSl, 2n=2x=14) będących ewolucyjnymi przodkami czterech gatunków tetraploidalnych: Ae. kotschyi
(UkUkSkSk), Ae. variabilis (UvUvSvS v), Ae. biuncialis (UbUbMbMb), Ae. ovata (UoUoMoMo), użytych
w prezentowanym doświadczeniu. Ponadto, analizowano chromosomy gatunku Ae. tauschii (DD),
który bezpośrednio został użyty do wytworzenia roślin amfiploidalnych Ae. tauschii × S. cereale.
Zastosowanie metody FISH z użyciem sond 5S rDNA, 25S rDNA, pSc119.2 i pAs1, pozwoliło na
identyfikację poszczególnych chromosomów oraz analizę lokalizacji sygnałów na chromosomie.
Z każdej grupy amfiploidów Aegilops-Secale wybrano po 20 genotypów i poddano analizie
struktury genomu techniką genomowej hybrydyzacji in situ (GISH i mcGISH). W amfiploidach
zidentyfikowano kompletne kariotypy Aegilops sp. – 28 chromosomów, (Ae. tauschii – 14
chromosomów). Odstępstwa od teoretycznej liczby chromosomów dotyczyły chromosomów żyta.
W trzech roślinach kombinacji Ae. kotschyi × S. cereale obserwowano 15 chromosomów żyta,
a w jednej roślinie 16 chromosomów. Jedna roślina kombinacji Ae. variabilis × S. cereale
charakteryzowała się obecnością 12 chromosomów S. cereale, natomiast w dwóch innych roślinach tej
kombinacji obserwowano 13 chromosomów żyta. Jedna roślina kombinacji Ae. ovata × S. cereale
posiadała introgresję chromatyny Aegilops ovata w telomerowej części chromosomu 3R Secale
cereale.
Składy chromosomowe 66 roślin mieszańcowych pokolenia F1 z 17 kombinacji
krzyżówkowych były analizowane za pomocą techniki GISH. Ogólna liczba chromosomów
mieszańców badanych kombinacji krzyżówkowych wahała się w granicach od 39 do 44. Liczba
chromosomów genomów U i S wahała się od 4 do 7 (dla każdego genomu), natomiast liczba
chromosomów genomu M zawierała się w przedziale 5 - 7. Chromosomy genomu R w mieszańcach
występowały przeważnie w liczbie 14, z wyjątkiem roślin kombinacji (Ae. variabilis  S. cereale) 
Secundo i (Ae. biuncialis  S. cereale)  Secundo, gdzie obserwowano od 12 do 14 chromosomów R.
Powiązanie metod rDNA-FISH oraz FISH z sondami opartymi o sekwencje powtórzeniowe DNA
pozwoliło stwierdzić, iż chromosomy 2U, 2M, 2S, 3U, 3M, 3S, 6U, 5M oraz 6S najliczniej
występowały w badanych mieszańcach a w przypadku jednej rośliny mieszańcowej z chromatyną Ae.
tauchii zidentyfikowano wspominane powyżej chromosomy 1D i 3D.
148 roślin pokolenia F2 i BC1F1 posiadały od 31 do 44 chromosomów. Liczba chromosomów
genomu U i M wynosiła maksymalnie 5, a liczba chromosomów genomu S wynosiła maksymalnie 6.
Liczba chromosomów R w analizowanych mieszańcach była stała i wynosiła 14 za wyjątkiem roślin
8
kombinacji 8/88  (Ae. variabilis  S. cereale), gdzie obserwowano od 11 do 14 chromosomów
żytnich. Wśród wszystkich roślin kombinacji 8/88  (Ae. variabilis  S. cereale), (Ae. kotschyi  S.
cereale)  Secundo i (Ae. variabilis  S. cereale)  Secundo obserwowano translokacje punktowe
z udziałem chromatyny genomu S na chromosomach genomów A i B. Ponadto, obserwowano
translokacje terminalne z udziałem chromosomów 1U, 1B, 6U i 6B u 4 roślin pokolenia BC1F1
kombinacji Moreno  (Ae. ovata  S. cereale) i 3 w roślinach pokolenia F2 kombinacji (Ae. ovata  S.
cereale)  Secundo. 13 roślin pokolenia BC1F1 kombinacji Kitaro  (Ae. kotschyi  S. cereale)
posiadało 2 chromosomy 6U z translokowanym fragmentem chromatyny pszenżyta, zlokalizowanym
terminalnie.
W kolejnym roku doświadczeń przeanalizowano 300 roślin pochodzących z 17 kombinacji
krzyżówkowych pokolenia F3, BC1F2, F1(BC1F1), BC2F1. Obserwowano znaczną eliminację
chromosomów Aegilops w roślinach mieszańcowych w porównaniu z mieszańcami poprzedniego
pokolenia. Nie stwierdzono obecności chromatyny Aegilops w roślinach siedmiu kombinacji.
W pozostałych kombinacjach liczba chromosomów genomu U wynosiła od 0 do 5, liczba
chromosomów genomu S – od 0 do 6, natomiast liczba chromosomów genomu D – od 0 do 3.
W dwóch roślinach kombinacji
(Ae. kotschyi × S. cereale) × Secundo stwierdzono obecność
translokacji 5U-5A.
206 roślin otrzymanych z ośmiu kombinacji krzyżówkowych pokoleń F4, BC1F 3, F1(BC1F2),
BC2F2, F2(BC1F1), BC1[F1(BC1F1)], F1(BC2F1) i BC3F 1 zostało poddanych analizie cytogenetycznej.
Delecje oraz translokacje terminalne chromatyny pszenżyta,
obejmujące długie ramiona
chromosomów 3D występowały w 6 roślinach pokolenia BC3F1, kombinacji (Ae. tauschii × S.
cereale) × Bogo. Analiza częstości występowania chromosomów Aegilops za pomocą metod FISH
wykazała, iż w analizowanych mieszańcach występowały tylko chromosomy 2U, 3U, 2S, 3S i 3D.
Do badań metafazy I mejozy komórek macierzystych ziaren pyłku wybrano 42 rośliny z 9
kombinacji krzyżówkowych, a dokładniej: 2 rośliny pokolenia F1, 5 roślin pokolenia F1(BC1F1), 3
rośliny pokolenia BC2F1, 6 roślin pokolenia BC2F1, 1 roślinę pokolenia F3, 7 roślin pokolenia BC2F1, 4
rośliny pokolenia BC2F1, 11 roślin pokolenia F4, oraz 2 rośliny pokolenia BC3F1. Dla każdej rośliny
analizowano od 10 do 20 komórek macierzystych pyłku (KMP) podczas metafazy I mejozy. Składy
chromosomowe badano przy użyciu metody mcGISH. Średnia liczba biwalentów wynosiła 16,6 –
20,88 na komórkę macierzystą pyłku (KMP). Najwięcej uniwalentów obserwowano w roślinach
pokolenia F1 kombinacji (Ae. biuncialis × S. cereale) × Secundo – średnia 6,70/KMP, a najmniej
w roślinach pokolenia F1 kombinacji (Ae. variabilis × S. cereale) × Secundo – średnia 0,24/KMP.
Obserwowano również triwalenty o strukturze genomowej AB/AB/R lub UMU.
9
5.4.
Identyfikacja genów odporności na grzyby patogeniczne za pomocą markerów
molekularnych
W celu analizy obecności genów odporności na stres biotyczny powodowany infekcją
patogenów grzybowych w użytych do badań gatunkach Aegilops, roślinach amfiploidalnych (Aegilops
spp. × S. cereale) i formach pszenżyta przeznaczonych do krzyżowań użyto zweryfikowanych
markerów molekularnych. Identyfikowano obecność 12 markerów DNA genów odporności na rdzę
brunatną (powodowaną przez Puccinia triticina; Lr9, Lr10, Lr19, Lr20, Lr22a, Lr28, Lr29, Lr35,
Lr37, Lr39, Lr41, Lr47). Ponadto, 4 markery DNA genów odporności na mączniaka prawdziwego
(powodowanego przez Blumeria graminis): Pm1, Pm2, Pm3, Pm13. Identyfikowano również
obecność jednego markera enzymatycznego w postaci endopeptydazy EpD1b oraz sprzężonego z nim
markera DNA Xust2001-7DL, który powiązany jest z locus kodującym gen Pch1, odpowiedzialny za
odporność roślin na łamliwość źdźbła powodowaną przez Oculimaculla yalundae i O. acuformis.
W prezentowanej pracy w pokoleniu F1 wyselekcjonowano 6 roślin kombinacji (Ae. variabilis × S.
cereale) × Secundo oraz 2 rośliny kombinacji 8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale), które posiadały
jednocześnie markery Lr37 i Lr39 warunkujące odporność na rdzę brunatną i Pm13, który warunkuje
odporność na mączniaka prawdziwego oraz markery Pm1, Pm2 i Pm3. W kolejnych pokoleniach
rośliny czterech kombinacji z udziałem chromatyny amfiploida (Ae. variabilis × S. cereale), tj.: F2
8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale), F2 (Ae. variabilis × S. cereale) × Secundo, BC1F1 Lamberto ×
(Ae. variabilis × S. cereale) oraz BC1F1 8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale) charakteryzowały się
współwystępowaniem wszystkich pięciu analizowanych markerów. 19 roślin posiadających 5
markerów genów odporności pochodziło z kombinacji BC1F1 8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale). 16
roślin pokolenia F1(BC1F1) kombinacji 8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale) oraz 24 rośliny pokolenia
BC1F2 kombinacji 8/88 × (Ae. variabilis × S. cereale) charakteryzowały się współwystępowaniem
wszystkich analizowanych markerów. Współwystępowanie czterech markerów genów odporności
występowało także w 24 roślinach pokolenia F4 kombinacji Secundo × (Ae. kotschyi × S. cereale),
oraz w 23 roślinach pokolenia BC3F1 kombinacji (Ae. tauschii × S. cereale) × Bogo. Przeprowadzone
analizy zymogramów endopeptydaz EpD1 oraz badania mające na celu identyfikację markera
Xust2001-7DL (sprzężonego z enedopeptydazą EpD1) nie wykazały obecności endopeptydazy EpD1b
sprzężonej z genem Pch1, warunkującym odporność na łamliwość źdźbła w badanych formach
amfiploidalnych (Aegilops spp. × S. cereale) i formach pszenżyta przeznaczonych do krzyżowań.
6.
Dyskusja
W prezentowanej pracy wykorzystano 5 form amfiploidalnych (Aegilops spp × S. cereale)
w celu podjęcia próby wprowadzenia zmienności do pszenżyta poprzez krzyżowanie z pięcioma
odmianami pszenżyta i jedną linią hodowlaną pszenżyta heksaploidalnego. Z doniesień literaturowych
wynika, iż wykorzystanie amfiploidów celem introgresji obcej chromatyny do gatunków pokrewnych
10
może być korzystne (Simonenko i in. 1998, Apolinarska 2010). Amfiploidy użyte w omawianej pracy
cechowały się poziomem ploidalności 6x lub 4x a także obecnością genomu R (podobnie jak w
formach pszenżyta), który według wstępnych założeń miał zapewnić częściową stabilność
cytogenetyczną otrzymanych mieszańców. Wśród 30 kombinacji krzyżówkowych pokolenia F1,
których formą ojcowską były amfiploidy Aegilops × Secale tylko rośliny jedenastu kombinacji
zawiązały ziarniaki. Z 4100 zapylonych kwiatków uzyskano tylko 88 ziarniaków, co stanowiło 2,15%
zawiązywania ziarniaków. Natomiast wśród krzyżowań, w których zapylaczem były formy pszenżyta,
we wszystkich 30 kombinacjach krzyżówkowych uzyskano ziarniaki. Efektywność krzyżowania była
zatem pięciokrotnie wyższa w przypadku, gdy komponentem matecznym były amfiploidy Aegilops ×
S. cereale. Wyniki te są zbieżne z badaniami nad otrzymaniem mieszańców Aegilops-Triticum
pokolenia F1 (Prażak 2001), gdzie procent zawiązywanych ziarniaków w przypadku, gdy formą
mateczną były kozieńce był siedmiokrotnie wyższy niż w przypadku krzyżowań odwrotnych. Można
zatem przypuszczać, że dużą rolę w tym procesie odgrywa żywotność ziaren pyłku. Ponadto niższa
efektywność krzyżowań w przypadku, gdy zapylaczem były formy amfiploidalne (Aegilops ×
S. cereale) spowodowana może być różnicą w morfologii i składzie białek ziaren pyłku. W badaniach
Kalinowskiego i in. (2001) ziarna pyłku amfiploidów Ae. kotschyi × S. cereale i Ae. variabilis × S.
cereale posiadają odmienną strukturę i kształt oraz 1 do 3 porów w porównaniu do ziaren pyłku form
wyjściowych z jednym porem. Procent zawiązywania ziarniaków poszczególnych kombinacji również
ulegał przyrostowi z pokolenia na pokolenie. Podobne wyniki otrzymano w badaniach mieszańców
pokolenia F2 do F5 Aegilops kotschyi Boiss. × Triticum aestivum L. cv. Rusałka (Prażak 2009).
Nieodłączną częścią badań nad mieszańcami oddalonymi są analizy cytogenetyczne pozwalające
stwierdzić stopień introgresji obcej chromatyny. W tym celu, jednym z głównych założeń
prezentowanej pracy było poznanie struktury i morfologii chromosomów gatunków rodzaju Aegilops,
użytych do krzyżowań. W tej pracy badano za pomocą metod cytogenetyki molekularnej
chromosomy, należące do genomów U, M, S i D, które są głównymi genomami w obrębie rodzaju
Aegilops (Van Slageren 1994). Jednym z założonych zadań analizy porównawczej wzorów sygnałów
FISH na chromosomach badanych genomów rodzaju Aegilops (U, S, M, D), w różnych stadiach
ewolucyjnych i mieszańcowych, było ustosunkowanie się do teorii Zohary’ego i Feldman’a (1962)
mówiącej, iż zazwyczaj jeden genom stanowi tzw. oś lub nazywany jest genomem podstawowym
(ang. pivotal genome). Z kolei genomy towarzyszące podlegają modyfikacjom w większym natężeniu
i znacznie różnią się od genomu rodzicielskiego, stąd nazywane są genomami różnicującymi (ang.
differential genome). Genom U, rozważany jako genom podstawowy o konserwatywnej strukturze,
jest zabezpieczeniem zapewniającym płodność mieszańca, podczas gdy główne rearanżacje zachodzą
w genomach różnicujących (Chee i in. 1995). Wyniki prezentowanych badań nie odbiegają od założeń
wspomnianej teorii. Jednakże, stwierdzono niewielkie różnice w dystrybucji sekwencji powtarzalnych
w chromosomach genomu U (Ae. umbellulata) i D (Ae. tauschii) w porównaniu z chromosomami tego
genomu w potomnych gatunkach. Natomiast dystrybucja sygnałów sekwencji powtórzeniowych
11
wskazuje , że chromosomy genomów M i S są bardziej zróżnicowane. Umiejętność identyfikacji
poszczególnych chromosomów Aegilops sp. pozwoliła śledzić ich zachowanie w następujących po
sobie pokoleniach mieszańcowych(Aegilops spp × S. cereale) × pszenżyto. W prezentowanej pracy
stwierdzono, iż samozapylenie, bądź krzyżowania wsteczne z pszenżytem miały istotny wpływ na
eliminację chromosomów kozieńców. W roślinach pokolenia F1 niezależnie od kombinacji
krzyżówkowej obserwowano przeważnie od 4 do 7 chromosomów kozieńców. Zidentyfikowano
udział chromosomów wszystkich grup homeologicznych. Ciekawym zjawiskiem były translokacje
wewnątrzgatunkowe pomiędzy chromosomami grup czwartej i szóstej genomów U i M w kombinacji
(Ae. biuncialis  S. cereale)  Secundo. W kolejnych pokoleniach, otrzymywanych poprzez
samozapylenia i krzyżowania wsteczne z pszenżytem, obserwowano coraz mniejszą liczbę
chromosomów Aegilops. Związek pomiędzy eliminacją chromosomów (bądź chromatyny) kozieńców
oraz obecnością translokacji z procentowym zawiązywaniem ziarniaków w kolejnych pokoleniach nie
jest jednoznaczny. Obserwowano wzrost zawiązywanych ziarniaków w stosunku do zapylonych
kwiatków porównując pokolenia, natomiast procentowy udział roślin poszczególnych kombinacji
krzyżówkowych, które posiadały translokacje (translokacje „punktowe” genomu S na chromosomach
genomów A i B pominięto) utrzymywał się na podobnym poziomie. Proces eliminacji obcej
chromatyny ma swoje podłoże w procesie mejozy, gdzie chromosomy introgresywne, nie posiadające
pary w postaci chromosomu homologicznego (uniwalenty) tworzą mikrojądra, na skutek czego ulegają
eliminacji. Analizy metafazy I mejozy komórek macierzystych pyłku wykonane na wybranych
roślinach opisanych w tej pracy pokazują wysoką liczbę uniwalentów (średnia częstość występowania
- 6,7/komórkę macierzystą pyłku) w roślinach pokolenia F1 kombinacji (Ae. biuncialis × S. cereale) ×
Secundo oraz występowanie triwalentu o strukturze genomowej UMU. Obserwowane zaburzenia
mogły mieć wpływ na niską żywotność ziaren pyłku roślin tej kombinacji, która wynosiła 6,95%.
W przypadku rodzaju Aegilops, eliminacja chromosomów może być spowodowana poprzez działanie
genów gametocydalnych (Gc) (Endo i Tsunewaki 1975). Gamety posiadające chromosomy z genami
Gc indukują fragmentację chromosomów, aberracje bądź delecje fragmentów chromosomów
w gametach nie posiadających genów Gc (Nasuda i in 1998).
Rozwój linii introgresywnych pszenżyta jest konieczny w celu transferu pożądanych cech,
takich jak odporność na choroby wywołane przez grzyby patogeniczne. Połączenie metod genetyki
molekularnej, pozwalającej na identyfikację markerów genów odporności z metodami cytogenetyki
molekularnej zostało wykorzystane w prezentowanej pracy do selekcji genotypów pszenżyta
z introgresją chromatyny Aegilops, niosącej geny odporności na rdzę brunatną i mączniaka
prawdziwego. Analiza 892 roślin z 17 kombinacji krzyżówkowych pozwoliła wyodrębnić przy użyciu
metod genetyki molekularnej szeroką pulę roślin, w których zidentyfikowano współwystępowanie
kilku markerów genów odporności na rdzę brunatną i mączniaka prawdziwego. Tak zwana
piramidyzacja genów odporności ma na celu wykorzystanie kilku genów odporności pochodzących
z różnych źródeł (Chełkowski i in. 2003).
12
7.
Wnioski
1. Zastosowanie ustabilizowanych amfiploidów (Aegilops spp. × S. cereale, UUSSRR lub
UUMMRR bądź DDRR) do krzyżowań z pszenżytem 6×(AABBRR) warunkuje powstawanie
biwalentów genomu R, co korzystnie wpływa na stabilność genetyczną mieszańców, zdolność
zawiązywania ziarniaków i żywotność ziaren pyłku.
2. Efektywność krzyżowania była pięciokrotnie wyższa w przypadku, gdy komponentem matecznym
były amfiploidy Aegilops × S. cereale w porównaniu do krzyżowań odwrotnych.
3. Średnia żywotność ziaren pyłku roślin kombinacji (Ae. kotschyi × S. cereale) × pszenżyto, (Ae.
variabilis × S. cereale) × pszenżyto, (Ae. biuncialis × S. cereale) × pszenżyto i (Ae. ovata × S.
cereale) × pszenżyto ulegała wzrostowi z pokolenia na pokolenia oraz miała istotny wpływ na
procent zawiązywanych ziarniaków roślin z tych kombinacji.
4. Markery cytogenetyczne w postaci sekwencji powtarzalnych: 5S i 35S rDNA oraz pSc119.2
i pAs1 są efektywnym narzędziem identyfikacji chromosomów rodzaju Aegilops w mieszańcach
Aegilops × S. cereale oraz (Aegilops × S. cereale) × pszenżyto.
5. Chromosomy genomu U i D gatunków należących do rodzaju Aegilops charakteryzują się większą
konserwatywnością w stosunku do chromosomów genomów M i S biorąc pod uwagę dystrybucję
sekwencji powtarzalnych 5S i 35S rDNA oraz pSc119.2 i pAs1 w analizowanych gatunkach
diploidalnych tj. Ae. umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae. sharonensis i Ae. tauschii,
a także w gatunkach tetraploidalnych Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis i Ae. ovata oraz
w badanych formach amfiploidalnych Aegilops × S. cereale oraz mieszańcach (Aegilops × S.
cereale) × pszenżyto.
6. Zwielokrotnienie poziomu ploidalności indukuje eliminację loci 35S rDNA w chromosomach 1M,
5M, 5S i 6S tetraploidalnych gatunków Aegilops (Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis i Ae.
ovata) oraz w mieszańców Aegilops spp. × S. cereale i (Aegilops spp. × S. cereale) × pszenżyto
w porównaniu z gatunkami diploidalnymi tj. Ae. umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae.
sharonensis
7. W następujących po sobie krzyżowaniach wstecznych lub samozapyleniach występuje
sukcesywna eliminacja chromosomów kozieńców z mieszańców (Ae. kotschyi × S. cereale) ×
pszenżyto, (Ae. variabilis × S. cereale) × pszenżyto, (Ae. biuncialis × S. cereale) × pszenżyto
i (Ae. ovata × S. cereale) × pszenżyto (Aegilops tauschii × S. cereale) × pszenżyto.
13
8. Chromosomy Aegilops sp. należące do drugiej i trzeciej grupy homeologicznej występowały
najczęściej w kombinacjach (Ae. kotschyi × S. cereale) × pszenżyto, (Ae. variabilis × S. cereale)
× pszenżyto, (Ae. biuncialis × S. cereale) × pszenżyto oraz (Ae. ovata × S. cereale) × pszenżyto
oraz (Aegilops tauschii × S. cereale) × pszenżyto i uległy eliminacji w najmniejszym stopniu
podczas kolejnych krzyżowań.
9. Krzyżowania
międzyrodzajowe
indukują
translokacje
wewnątrzgatunkowe
pomiędzy
chromosomami czwartej i szóstej grupy homelogicznej genomów U i M w kombinacjach (Ae.
biuncialis × S. cereale) × pszenżyto oraz (Ae. ovata × S. cereale) × pszenżyto.
10. Wizualizacja punktowych translokacji genomu S na chromosomach genomu A i B w mieszańcach
(Ae. kotschyi × S. cereale) × pszenżyto oraz (Ae. variabilis × S. cereale) × pszenżyto świadczy
o wysokim stopniu pokrewieństwa tych genomów, a także może być spowodowana zbyt wysoką
temperaturą hybrydyzacji podczas GISH, co skutkowało zwiększeniem specyficzności sondy
molekularnej opierającej się na genomowym DNA, bogatym w sekwencje powtarzalne.
11. Rośliny mieszańcowe (Ae. kotschyi × S. cereale) × pszenżyto, (Ae. variabilis × S. cereale) ×
pszenżyto, (Ae. biuncialis × S. cereale) × pszenżyto i (Ae. ovata × S. cereale) × pszenżyto są
źródłem kompleksowej odporności na rdzę brunatną, źdźbłową i żółtą (Lr37+Sr38+Yr17).
12. Rośliny mieszańcowe (Aegilops spp. × S. cereale) × pszenżyto posiadające chromosomy Ae.
variabilis lub Ae. tauschii charakteryzują się obecnością markera genu Lr39 warunkującego
odporność na rdzę brunatną.
13. Rośliny mieszańcowe pszenżyta ze zidentyfikowanymi chromosomami amfiploida (Ae. variabilis
× S. cereale) cechują się obecnością markera genu Pm13 warunkującego odporność na mączniaka
prawdziwego.
14. Z mieszańców pszenżyta z amfiploidami (Aegilops spp. × S. cereale) wyselekcjonowano 150
roślin posiadających 4-6 markerów genów warunkujących odporność na rdzę brunatną (Lr37
i Lr39) i mączniaka prawdziwego (Pm1, Pm2, Pm3 i Pm13).
14
8. Literatura
1. Apolinarska B., Wiśniewska H., Wojciechowska B. (2010). Aegilops-rye amphiploids and
substitution rye used for introgression of genetic material into rye (Secale cereale L.). J. Appl.
Genet. 51(4): 413-20.
2. Arseniuk E., Oleksiak T. (2002). Production and breeding of cereals in Poland. Proc. 5th Int.
Triticale Symp., IHAR Radzików, Poland 30 June – 5 July. I: 7-13.
3. Chee P.W., Lavin M., Talbert L.E. (1995). Molecular analysis of evolutionary patterns of U
genome wild wheats. Genome 38: 290–297.
4. Chełkowski J., Golka L., Stępień Ł. (2003). Application of STS markers for leaf rust resistance
genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet. 44: 323-338.
5. Doohan F.M., Parry D.W., Jenkinson P., Nicholson P. (1998). The use of species-specific PCR
based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat. Plant Pathology 47: 197-205.
6. Endo T.R., Tsunewaki K. (1975). Sterility of common wheat with Aegilops triuncialis cytoplasm.
Heredity 66: 13–18.
7. Friebe B., Hatchett J.H., Sears R.G., Gill B.S. (1990). Transfer of Hessian fly resistance from
'Chaupon' rye to hexaploid wheat via a 2BS/2RL wheat-rye chromosome translocation. Theor.
Appl. Genet. 79: 385-389.
8. Gerlach W.L., Dyer T.A. (1980). Sequence organization of the repeating units in the nucleus of
wheat which contain 5S rRNA genes. Nucleic Acids Res. 11: 4851–4865.
9. Kalinowski A., Winiarczyk K., Wojciechowska B. (2001). Pollen proteins after two-dimensional
gel electrophoresis and pollen morphology of the amphiploids Aegilops kotschyi and Ae.
variabilis with Secale cereale. Sex Plant Reprod 14: 153–161.
10. Kiss A., Videki L. (1971). Developement of secondary hexaploid triticales by crossing Triticale
with rye. Wheat Inf. Ser. 32: 17-20.
11. Lombard V., Delourme R. (2001). A consensus linkage map for rapeseed (Brassica napus L.):
construction and integration of three individual maps from DH populations. Theor. Appl. Genet.
103: 491–507.
12. Merker A. (1976). The cytogenetic effect of heterochromatin in hexaploid triticale. Hereditas 83:
215-222.
13. Nagaki K., Tsujimoto H., Isono K., Sasakuma T. (1995). Molecular characterization of a tandem
repeat, Afa family, and its distribution among Triticeae. Genome 38: 479-486.
14. Nasuda S., Friebe B., Busch W., Kynast R.G., Gill B.S. (1998). Structural rearrengement in
chromosome 2M of Aegilops comosa has prevented the utilization of the Compair and related
wheat–Ae. comosa translocations in wheat improvement. Theor. Appl. Genet. 96: 780–785.
15. Prażak R. (2001). Cross direction for successful production of F1 hybrids between Triticum and
Aegilops species. Plant Breeding and Seed Science 45(1): 83-86.
16. Prażak R. (2009). Zmienność i współzależność niektórych cech w mieszańcach Aegilops
kotschyi Boiss. × Triticum aestivum L. cv. Rusałka. Biul. IHAR 252: 43-59.
15
17. Rakowska M. (1994). Antinutritive compounds in rye grain. Hod. Rośl. Aklim. 38: 21-42.
18. Saint Pierre C., Crossa J.L., Bonnett D., Yamaguchi-Shinozaki K., Reynolds M.P. (2012).
Phenotyping transgenic wheat for drought resistance. J. Exp. Bot. 63(5): 1-10.
19. Sánchez-Mongue E. (1974). Development of triticales in western Europe. Proc Symp Triticale El
Batán, México. p. 31-39.
20. Simonenko V.K., Motsny I.I., Sechnyak A.I., Kulbida M.P. (1998). The use of wheat-alien and
Aegilops-rye amphiploids for introgression of genetic material to wheat. Euphytica 100: 313–321.
21. Sisodia N.S., McGinnis R.C. (1970). Importance of hexaploid wheat germplasm in hexaploid
triticale breeding. Crop Sci. 10: 161-162.
22. Tarkowski C. (1975). Triticale – cytogenetyka, hodowla i uprawa. Roczn. Nauk Roln.,
Monografie, Seria D, Tom 157.
23. Tarkowski C. (1989). Biologia pszenżyta. Państwowe Wydawnictwo Naukowe.
24. Thomas J.B., Kaltsikes P.J. (1972). The genomic origin of the unpaired chromosomes in triticale.
Can. J. Genet. Cytol. 18 :687-700.
25. Unfried I., Gruendler P. (1990). Nucleotide sequence of the 5.8S and 25S rRNA genes and of the
internal transcribed spacers from Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 18: 4011.
26. Van Slageren M.W (1994). Wild wheats: a monograph of Aegilops L., and Amblyopyrum (Jaub.
& Spach) Eig (Poaceae). Agricultural University of Wageningen, the Netherlands, and
International Center for Agricultural Research in Dry Areas, Aleppo, Syria.
27. Wiśniewska H., Kowalczyk K. (2005). Resistance of cultivars and breeding lines of spring wheat
to Fusarium culmorum and powdery mildew. J. Appl. Genet. 46(1):35-40.
28. Wiśniewska H., Stępień Ł., Kowalczyk K. (2003). Resistance of spring wheat cultivars and lines
to leaf rust. J. Appl. Genet. 44(3): 361-368.
29. Wojciechowska B. (1996). Hybrids of tetraploid Aegilops sp. with Secale cereale. Genet. Pol.
37A: 174-178.
30. Wojciechowska B., Pudelska H. (1999). Production, morphology and fertility of the amphiploids
Aegilops variabilis × Secale cereale and Ae. kotschyi × S. cereale. Cereal Res. Commun. 27: 79–
82.
31. Wojciechowska B., Pudelska H. (2002a). Production and morphology of the hybrids Aegilops
kotschyi × Secale cereale and Ae. biuncialis × S. cereale. J. Appl. Genet. 43: 279–285.
32. Wojciechowska B., Pudelska H. (2002b). Hybrids and amphiploids of Aegilops ovata L. with
Secale cereale L.: production, morphology and fertility. J. Appl. Genet. 43: 415–421.
33. Wojciechowska B., Pudelska H. (2005). Production and characterization of amphiploids of
Aegilops kotschyi and Ae. biuncialis with Secale cereale, and of backcross hybrids of Ae.
biuncialis × S. cereale amphiploids with 2x and 4x S. cereale. J. Appl. Genet. 46: 157-161.
34. Zohary D., Feldman M. (1962). Hybridization between amphiploids and the evolution of
polyploids in the wheat Aegilops– Triticum group. Evolution 16: 44–61.
16