Badanie fluorescencji światłouczulacza fotolonu w komórkach He-La

Badanie fluorescencji światłouczulacza fotolonu w komórkach He-La

inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
Badanie fluorescencji światłouczulacza fotolonu w komórkach He-La
Fluorescence of Photolon photosensitizer entrapped in He-La cells
Leon Czernielewski, Magdalena Przybyło, Agnieszka Ulatowska-Jarża, Halina Podbielska
Instytut Inżynierii Biomedycznej i Pomiarowej, Wydział Podstawowych Problemów Techniki, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże S. Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław, tel. +48 71 320 28 25, e-mail: [email protected]
Streszczenie
Słowa kluczowe: fotolon, fotodynamiczna diagnostyka,
komórki He-La
podejściu do pacjenta. We wrześniu 2011 roku odbył się
pierwszy Światowy Kongres Europejskiego Stowarzyszenia na rzecz Medycyny Opartej na Prewencji i Spersonalizowanym Podejściu do Pacjenta, podczas którego
poruszano między innymi problematykę zindywidualizowanej diagnostyki i optymalizacji dawek środków terapeutycznych [1]. Dążenie do zindywidualizowanej terapii
i spersonalizowanego podejścia do pacjenta zakłada dobór
odpowiednio spersonalizowanych dawek środków leczniczych. W terapii i diagnostyce fotodynamicznej istnieje
bardzo duża rozbieżność w zakresie dozymetrii: doboru
warunków oświetlenia, a także dawek światłouczulaczy
[2, 3]. Dotyczy to również zastosowań PDT (Photodynamic
Therapy) i PDD (Photodynamic Diagnosis) w ginekologii
[4, 5]. Celem niniejszej pracy było wyznaczenie minimalnej dawki światłouczulacza, którego fluorescencję można
jeszcze zaobserwować w komórkach He-La.
Abstract
Materiały i metody
The entrapment of the photosensitizer Photolon into
the He-La cells, was studied. The fluorescence of photosensitizer was examined without and in the presence
of formaldehyde. The study was performed by means of
confocal microscopy of cells incubated for 4 hours and
12 hours. It was stated that 4 hours is the shortest time of
incubation allowing the observation of Photolon in the
He-La cells and the minimal concentration of photosensitizer is 1mg/ml (1,67 × 10 -6 M).
Światłouczulacz
Obiektem badań był światłouczulacz fotolon (1, 3, 5,
8-tetramethyl-4-ethyl-2-vinyl-chlorin-6-carbonic-acetic7-propion acid sodium-vapor salt). Należy on do grupy
związków jednofotonowych. Nie jest jeszcze powszechnie
stosowany, aczkolwiek jego właściwości zostały opisane
w niektórych pracach [6, 7]. Został zaaprobowany do leczenia nowotworów skóry i błony śluzowej (m.in. na Białorusi
i w Rosji). Może być aplikowany dożylnie lub miejscowo.
Możliwe są również pewne nieonkologiczne zastosowania
tego związku [8]. Produkt w postaci bezwonnego, ciemnozielonego i silnie higroskopijnego proszku rozpuszcza się
w wodzie, buforach i soli fizjologicznej. W badaniach spektroskopowych zastosowano buforowe (PBS – Phosphate-Buffered Saline) wodne roztwory fotolonu, przy pH 6 oraz
pH 7. Badania z zastosowaniem hodowli komórkowych
przeprowadzono z wykorzystaniem buforu fosforanowego o pH 7,4.
W pracy badano wnikanie światłouczulacza fotolonu do
komórek He-La. Przeprowadzono badania spektroskopowe fotolonu w obecności i bez formaldehydu, stosowanego
do utrwalania komórek. Badania mikroskopowe przeprowadzono za pomocą mikroskopu konfokalnego. Komórki
inkubowano ze światłouczulaczem przez 4 i 12 godzin.
Natężenie fluorescencji fotolonu w komórkach zależy od
stężenia roztworu i czasu inkubacji. W wyniku przeprowadzonych pomiarów mikroskopowych wykazano, że
czas inkubacji niezbędny do zaobserwowania związku
wewnątrz komórek wynosi co najmniej 4 godziny, a minimalne stężenie światłouczulacza 1 mg/ml (1,67 × 10 -6 M).
Key words: Photolon, photodynamic diagnosis, He-La cells
Wstęp
W ostatnich latach obserwuje się coraz większe zainteresowanie terapią i diagnostyką fotodynamiczną. Jednocześnie
obserwujemy wysiłki w zakresie rozwoju medycyny opartej na przewidywaniu, prewencji i zindywidualizowanym
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 1/2012, vol. 18
55
Badania mikroskopowe
W badaniach wykorzystano mikroskop konfokalny (Carl
Zeiss Confocor 3) wyposażony w lasery (Argon oraz HeNe),
lampę halogenową do obserwacji w modzie DIC (Differential
Interference Contrast), termostatowany pierścień na szkiełka
zawierające komórki oraz komorę z kontrolowanym poziomem CO2. Obrazy konfokalne rejestrowano przy wzbudzeniu falą 405 nm, stosując filtr emisyjny górnoprzepustowy
575 nm. Do obrazowania wykorzystano obiektyw o korekcji wodnej, apochromatyczny (C-apochromat) o aperturze
numerycznej NA = 1.2 oraz powiększeniu 40×. Do obsługi
mikroskopu wykorzystano program ZEN (Carl Zeiss), za
którego pomocą kontrolowano długości fali światła wzbudzającego, średnicę pinhola, natężenie światła lasera.
Mikroskopia konfokalna pozwala na obrazowanie
o wysokiej rozdzielczości, nawet w przypadku próbek
o względnie dużej grubości. Dzięki umieszczeniu przed
detektorem specjalnej przesłony (pinhol) do detektora dociera jedynie sygnał zogniskowany na wybranym punkcie
próbki. Istnieje możliwość zbierania sygnału z większego
obszaru próbki za pomocą układów skanujących. Skanowanie może odbywać się w płaszczyźnie prostopadłej
do osi optycznej, jak też na głębokość próbki, co pozwala
na otrzymanie obrazów trójwymiarowych [9, 10]. Możliwe jest również nałożenie obrazu konfokalnego na obraz
otrzymany za pomocą kontrastu fazowego DIC.
Badania spektroskopowe
W celu optymalizacji parametrów obrazowania mikroskopowego penetracji fotouczulacza do wnętrza komórek
He-La, wykonano charakterystyki spektralne badanych
związków z wykorzystaniem spektrofluorymetru Carry
Eclipse (Varian). Pomiary wykonywano w 4-ściennych,
optycznie gładkich kuwetach polistyrenowych 10 × 10 mm
(Medlab-Products) oraz w kuwetach kwarcowych (Hellma). Widma wzbudzeniowe i emisyjne związków rozpuszczonych w wodzie bądź etanolu zbierano przy sze-
56
rokościach szczelin równych 1 mm, jeśli nie zaznaczono
inaczej. Prędkość akwizycji danych wynosiła 5 nm/s.
Wyniki badań spektroskopowych
W celu określenia zakresu długości fal umożliwiających
wzbudzenie fotolonu zebrano widma wzbudzeniowe
związku przy długości emisji λ em = 663 nm (rys. 1). Maksimum wzbudzenia fotolonu wyznaczono na 405 nm.
30
25
I [a.u.]
20
15
10
5
0
400
450
500
550
λ [nm]
Rys. 1 Widmo wzbudzeniowe wodnego roztworu fotolonu
(C = 10 -6 M, λem = 663 nm, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
Widmo emisyjne fotolonu przy długości fali wzbudzającej λ ex = 405 nm przedstawia rysunek 2. Maksimum emisji
fotolonu wyznaczono na 664 nm.
30
25
20
I [a.u.]
inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
Linie komórkowe
Komórki linii He-La hodowano w medium DMEM (zmodyfikowane podłoże wzrostowe – Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium) w temperaturze 37oC, 5% CO2 do poziomu konfluencji > 85%. Na potrzeby obrazowania mikroskopowego komórki przenoszono na szkiełka mikroskopowe metodą trypsynizacji i inkubowano do czasu pomiaru (37oC, 5% CO2).
Do obrazowania mikroskopowego komórki inkubowano w obecności fotouczulacza przez 4 lub 12 godzin. Komórki inkubowane przez 4 godziny obrazowano w postaci
utrwalonej 3% roztworem paraformaldehydu. Pomiary
spektrofluometryczne nie wykazały istotnych różnic
w widmach emisyjnych badanych związków w obecności
i bez paraformaldehydu, wykluczając tym samym obecność ewentualnych artefaktów w obrazach mikroskopowych związanych z procedurą utrwalania komórek (zob.
podrozdział Badania spektroskopowe).
Obrazowanie komórek inkubowanych przez 12 godzin
prowadzono w trybie przeżyciowym, z wykorzystaniem
modułu termostatu stolika mikroskopowego (37oC, 5% CO2).
15
10
5
0
600
625
650
675
700
λ [nm]
Rys. 2 Widmo emisyjne wodnego roztworu fotolonu
(C = 10 -6 M, λex = 405 nm, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
Zależność natężenia emisji fotolonu w funkcji pH przedstawia rysunek 3. Spadkowi pH towarzyszy spadek natężenia fluorescencji oraz nieznaczne przesunięcie maksimum
intensywności w kierunku fal krótszych (z 664 na 659 nm).
W badaniach mikroskopowych na komórkach in vitro
trzeba uwzględnić obecność tła, pochodzącego od autofluorescencji badanych obiektów. Natężenie autofluorescencji spada wraz ze wzrostem długości fali wzbudzenia.
W celu zweryfikowania możliwości prowadzenia obrazowania mikroskopowego z zastosowaniem linii laserowych
o dłuższych falach (488 i 504 nm) zebrano widma emisyjne
fotolonu w funkcji dostępnych długości fali wzbudzenia
(rys. 4 A). Wraz ze wzrostem długości fali wzbudzającej zaobserwowano spadek maksimum natężenia fluorescencji
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 1/2012, vol. 18
30
25
25
15
I [a.u.]
I [a.u.]
20
pH = 7,0
pH < 7,0
20
10
pH = 7,0
pH < 7,0
15
10
5
5
0
0
400
450
500
λ [nm]
A
600
550
625
650
675
700
λ [nm]
B
20
18
18
16
14
12
14
16
10
8
405 nm
504 nm
488 nm
6
4
2
0
-2
600
Imax [a.u.]
I [a.u.]
Rys. 3 Zmiany widm wzbudzeniowych (A) i emisyjnych (B) wodnych roztworów fotolonu w funkcji pH roztworu (C = 10 -6 M, λex = 405 nm,
λem = 663 nm, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
12
10
8
6
4
625
650
675
700
725
750
775
800
400
λ [nm]
A
425
450
475
500
λ ex [nm]
B
Rys. 4 Zależność natężenia fluorescencji wodnych roztworów fotolonu w funkcji długości fali wzbudzenia (C = 10 -6 M, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
30
25
28
Imax [a.u.]
20
I [a.u]
30
1,0 × 10 -6 M
2,5 × 10 -7 M
0,9 × 10 -7 M
15
10
5
24
22
0
600
26
620
640
660
680
20
0,0
700
A
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
C [10-6 M]
λ [nm]
B
Rys. 5 Zależność intensywności fluorescencji wodnych roztworów fotolonu w funkcji stężenia fotolonu w próbce (λex = 405 nm, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
odpowiednio o 32 i 72% względem kontroli (λ ex = 405 nm)
dla λ ex = 488 nm oraz λ ex = 504 nm (rys. 4 B). Położenie maksimum emisji nie uległo zmianie.
W badaniach zaobserwowano również nieliniową zależność natężenia fluorescencji w funkcji stężenia fotolonu
w próbce, gdzie stwierdzono występowanie maksimum
intensywności emisji fluorescencji dla stężeń fotolonu
z przedziału 10 -6 –10 -7 M (rys. 5).
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 1/2012, vol. 18
Z uwagi na konieczność obrazowania próbek zarówno w postaci utrwalonej (czas inkubacji z fotouczulaczem 4 godziny),
jak i w trybie przeżyciowym (czas inkubacji 12 godzin) zbadano wpływ środka utrwalającego (3% paraformaldehyd) na widmo emisyjne fotolonu (rys. 6). Paraformaldehyd w stężeniach
znacznie przekraczających stężenia w próbkach obrazowanych
mikroskopowo nie powoduje zmiany intensywności fluorescencji fotolonu i nie przesuwa położenia maksimum emisji.
57
inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
30
25
Kontrola
Kontrola + FA
20
I [a.u.]
inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
30
15
10
5
Wnioski
0
600
620
640
660
680
700
λ [nm]
Rys. 6 Widma emisyjne wodnych roztworów fotolonu bez (kontroal)
i w obecności paraformaldehydu (kontrola + FA) (C = 10 -6 M,
λex = 405 nm, sex = 1 mm, sem = 1 mm)
Wyniki badań mikroskopowych
W badaniach określono niezbędny czas inkubacji pozwalający na skuteczne wniknięcie fotouczulacza do komórek. Po
przygotowaniu hodowli komórkowych dodano fotouczulacz
w trzech stężeniach (1,67 × 10-7 M, 1,67 × 10-6 M, 1,67 × 10-5 M),
analizując każde stężenie w jedno-, dwu- i czterogodzinnym
czasie inkubacji. Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji do każdej z komór dodano paraformaldehyd w celu
utrwalenia badanego preparatu. W pomiarach spektrofluorymetrycznych wykazano brak wpływu obecności paraformaldehydu na poziom fluorescencji fotolonu. W wyniku
przeprowadzonych pomiarów mikroskopowych wykazano,
że czas inkubacji niezbędny do zaobserwowania związku
wewnątrz komórek wynosi minimum 4 godziny, a minimalne stężenie światło uczulacza 1 mg/ml (1,67 x 10-6 M).
Przykładowe obrazy pokazano na rys. 7 i 8.
A
B
C
Rys. 7 Złożenie obrazu fluorescencyjnego (wzbudzenie 405 nm, filtr
emisyjny górnoprzepustowy 575 nm) oraz obrazu w świetle kontrastu
fazowego (DIC). Komórki He-La inkubowane 4 godziny w buforowym
roztworze fotolonu o stężeniu 1 mg/ml (A, B), PBS pH 7,4. Ta sama
próbka po jednogodzinnej inkubacji (C) – Rys. 7 w kolorze str. 1.
A
B
C
Rys. 8 Złożenie obrazu fluorescencyjnego (wzbudzenie 405 nm, filtr
emisyjny górnoprzepustowy 575 nm) oraz obrazu w świetle kontrastu
fazowego (DIC). Inkubacja 12 godzinna, stężenie fotolonu 1 mg/ml,
PBS pH 7,4. – Rys. 8 w kolorze str. 1.
58
Jak widać, zarejestrowany sygnał ma niskie natężenie,
niemniej jednak możliwa jest obserwacja fotolonu w komórce. Przeprowadzono też pomiary, podczas których
wydłużono czas inkubacji do 12 godzin. Udało się zaobserwować sygnał fluorescencyjny próbek fotolonu nawet
o stężeniu mniejszym niż w przypadku inkubacji 4-godzinej. Na rysunku 2 zaprezentowano obrazy mikroskopowe
fotolonu o stężeniu 1 mg/ml po 12 godzinach inkubacji.
Diagnostyka fotodynamiczna wymaga efektywnego wniknięcia fotouczulacza do badanych komórek. Wykrycie obecności fotouczulacza polega na wzbudzeniu układu odpowiednio
dobraną długością światła. W badaniach in vitro na komórkach
He-La pokazano, że związki światłouczulające nawet w małych dawkach mogą wniknąć do komórek i mogą być obserwowane na przykład za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Podziękowania
Badania były prowadzone w ramach projektu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki, Nr grantu ID 25111,
NN 518427736 „Badania nad dozymetrią światła i światłouczulaczy w diagnostyce Fotodynamicznej zmian przednowotworowych i nowotworowych szyjki macicy i sromu”. n
Literatura
1. http://www.epmanet.eu
2. L. Czernielewski, H. Podbielska: Problematyka dozymetrii w diagnostyce i terapii fotodynamicznej w ginekologii, Inżynieria Biomedyczna – Acta Bio-Optica et Informatica Medica, vol. 13, 2007, s. 154-158.
3. C.A. Morton, K.E. McKenna, L.E. Rhodes: Guidelines for topical photodynamic therapy: update, Br J Dermatol, vol. 159, 2008, s. 1245-1266.
4. L. Czernielewski, E.G. Bwire, E. Teterycz, M. Gryboś, H. Podbielska: Developments in photodynamic diagnosis and therapy in
gynecology – a review, [w:] H. Podbielska, A. Sieroń, W. Stręk (eds):
Aspects of photody-namic medicine II: some clinical aspects and
case reports, Indygo Zahir Media, Wrocław 2008, s. 177-236.
5. M. Löning, Ph. Soergel, P. Hillemanns: Fluorescence diagnosis
and photodynamic therapy in intra-abdominal gynecologic diseases and breast cancer – A review, Medical Laser Application,
vol. 24, 2009, s. 18-26.
6. A. Juzeniene: Chlorin e6-based photosensitizers for photodynamic therapy and photodiagnosis, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, vol. 6, 2009, s. 94-96.
7. L. Copley, P. Van Der Watt P., K.W. Wirtz, M.I. Parker, V.D. Learner: PhotolonTM, a chlorin e6 derivative, triggers ROS production and light-dependent cell death via necrosis, Int J Biochem
Cell Biol, vol. 40, 2008. s. 227-235.
8. H. Podbielska, W. Stręk, P. Dereń: New approach to PDT with
chlorophyll based photosensitizer and semiconductor laser,
Physica Medica, vol. 20, 2004, s. 61-68.
9. W.M. Petroll, J.V. Jester, H.D. Cavanagh: In vivo confocal imag-ing:
general principles and applications, Scanning, vol. 16, 1994, s. 131-149.
10. J.B. Pawley (ed.): Handbook of biological confocal microscopy,
2nd Edition, Plenum, New York 1995.
otrzymano / received: 15.09.2011
zaakceptowano / accepted: 21.12.2011
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 1/2012, vol. 18