Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia

Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 2: Chromatografia dwuwymiarowa (TLC 2D)
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie rozdziału mieszaniny aminokwasów w dwóch
układach rozwijających.
Aminokwasy: Asp, Cys, His, Leu, Ala, Val (1% roztwory wodne)
Eluent 1: n-butanol: kwas octowy: woda (4:1:1)
Eluent 2: fenol: woda (3:1)
Wizualizacja UV, następnie roztwór ninhydryny
Próbkę nanosimy w narożniku płytki. Po rozwinięciu w eluencie 1 suszymy starannie płytkę,
ponownie nanosimy próbkę w narożniku i rozwijamy płytkę w eluencie 2 tak, aby ścieżka
rozwinięcia 1 stanowiła teraz linię startową.
Płytkę suszymy (ostrożnie! fenol) i, po obejrzeniu w UV, wywołujemy roztworem
ninhydryny.
Obliczmy współczynniki Rf (dla obu układów). Po porównaniu z płytka wzorcową i
uwzględnieniu danych literaturowych wskazujemy, którego aminokwasu nie zawierała
badana mieszanina.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 3: Metody wizualizacji
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie selektywności wizualizacji w zależności od
stosowanego odczynnika.
Leki przeciwbólowe i substancje czyste: aspiryna, kwas salicylowy, paracetamol, kofeina,
witamina C (roztwory metanolowe)
Eluent 1: octan butylu: chloroform: 85% HCOOH (60:40:20)
Eluent 2: octan butylu: aceton: butanol: woda amoniakalna (50:40:30:10)
Wizualizacja UV, wybrany odczynnik
W1
UV 254
W2
pary jodu
W3
1% wodny roztwór KMnO4
W4
1% roztwór KMnO4 w stężonym kwasie siarkowym
W5
dwuchromian potasu
W6
1% alkoholowy roztwór FeCl3
W7
kwas siarkowy z aldehydem anyżowym (1 ml H2SO4, 0,5 ml aldehydu w 50 ml kwasu
octowego, ogrzewanie po spryskaniu)
W 8 kwas siarkowy z waniliną (1 g w 100 ml stężonego kwasu, ogrzewanie)
W9
stężony kwas azotowy
Na 2 płytki nanosimy wzorce i analizę (X, środkowy tor), rozwijamy we wskazanych
układach. Wysuszone płytki po obejrzeniu w UV wywołujemy wybranym odczynnikiem.
Obliczmy współczynniki Rf. Identyfikujemy X. Dodatkowo porównujemy metody
wizualizacji (czułość, skuteczność).
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4a: Ekstrakcja flawonoidów
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie wpływu metody przygotowania próbki na wynik
analizy.
Analiza: suszone owoce aronii
Ekstrakcja (wybór 3 różnych rozpuszczalników):
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
woda
5% HCl
5% NaOH
metanol
chloroform
toluen
octan etylu
??
Eluent 1: octan etylu: HCOOH: CH3COOH: woda (75:2:3:20)
Dwa suszone owoce macerujemy w probówce bagietką w ok. 1 ml wybranego
rozpuszczalnika. Uzyskany roztwór nanosimy na płytkę.
Po rozwinięciu oglądamy płytkę w świetle UV, zaznaczamy plamki. Umieszczamy płytkę w
oparach amoniaku, obserwujemy zmiany barw.
Proszę ocenić skuteczność ekstrakcji i wyjaśnić powód zmiany zabarwienia plamek po
zastosowaniu amoniaku.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4b: Nasycenie komory chromatograficznej (barwniki)
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie wpływu przygotowania komory chromatograficznej
na wynik analizy.
Analizowane substancje: barwniki według listy.
Eluent (wybrany): metanol, eter dietylowy: metanol (9:1), chloroform: metanol (9:1)
Warianty: zlewka + szalka, zlewka z paskiem bibuły (poniżej kontaktu z płytką) i szalką,
zlewka zabezpieczona folią, otwarta zlewka.
Proszę zaobserwować zmiany szybkości rozwijania płytek i maksymalne osiągane zwilżenie
płytki w zależności od zastosowanej metody.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4c: Analiza związku czynnego optycznie na impregnowanej płytce
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie rozdziału izomerów ibuprofenu.
Płytka: standardowa płytka nasycona przez 10 minut roztworem chlorowodorku L-argininy
(630 mg w 100 ml mieszaniny metanol-woda (9:1)), wysuszona i aktywowana
Eluent: acetonitryl: metanol: woda (5:1:1), kropla kwasu octowego
Na płytkę nanosimy różne ilości ekstraktu metanolowego ibuprofenu (roztwór nasycony).
Wykonujemy analizę porównawczą na nieimpregnowanej płytce.
Po rozwinięciu oglądamy płytkę w UV i wywołujemy ninhydryną. Oceniamy intensywnośc
zabarwienia i efekt 8.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4d: Dodatki do eluentów zwiększające selektywnośc.
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie rozdziału aminokwasów w obecności fruktozy.
Eluent: 40% roztwór fruktozy w wodzie.
Eluent kontrolny 1: woda
Eluent kontrolny 2: n-butanol: kwas octowy: woda (4:1:1)
Analizowane aminokwasy: Ala, Leu, Tyr, Val
Po rozwinięciu płytek (różna szybkość!) i wywołaniu ninhydryną oceniamy wpływ fruktozy
na rozdzielczość.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4e: Zastosowanie wskaźników pH w wizualizacji.
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie wizualizacji kwasów karboksylowych z
wykorzystaniem wskaźników pH.
Kwasy karboksylowe: benzoesowy, ftalowy, 4-metylobenzoesowy, 4-hydroksynbenzoesowy,
octowy.
Eluent: toluen: pirydyna (85:15)
Wskaźniki: zieleń bromokrezolowa, błękit bromotymolowy, czerwień metylowa.
Po rozwinięciu płytki i ostrożnym wysuszeniu (wyciąg!!) nanosimy roztwór wybranego
wskaźnika i oceniamy efekt. Zmianę zabarwienia barwników w zależności od pH warto
sprawdzić na płytkach do analizy kroplowej.
Współczesne metody chromatograficzne: Chromatografia cienkowarstwowa
Ćwiczenie 4f: Wpływ zakwaszenia eluentów na kształt plamek substancji o charakterze
kwasowym.
1. Celem ćwiczenia jest zaobserwowanie wpływu obecności kwasów w eleuencie na kształt
plamek analizowanych substancji.
Substancje: kwas salicylowy, aspiryna, dowolny inny kwas aromatyczny
Eluent 1: chlorofom: metanol (9:1)
Eluent 2: chlorofom: metanol (9:1) + 1 kropla kwasu octowego
Jak wyjaśnić różnice w kształcie plamek?