FLUORESCENCJA MODULOWANA CEL ĆWICZENIA

FLUORESCENCJA MODULOWANA
CEL ĆWICZENIA
Pomiar i analiza widm fluorescencji modulowanej chlorofilu a w systemie PAM (ang. pulseamplitude-modulation).
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Ogólna charakterystyka procesu fotosyntezy
2. Architektura i komponenty aparatu fotosyntetycznego
 Fotosystem II (PSII)
 Transport elektronów na stronie akceptorowej PSII
 Barwniki fotosyntetyczne roślin wyższych
3. Fluorescencja chlorofilu a jako wskaźnik funkcjonowania fotosystemu II
4. Diagram Jabłońskiego
5. Krzywa indukcji fluorescencji chlorofilu a – test OJIP
UKŁAD POMIAROWY
1. Fluorymetr o podwójnej modulacji FL-3000 (PSI)
 jednostka kontrolująca
 głowica optyczna
 zestaw kuwet
SPRZĘT LABORATORYJNY
Wirówka laboratoryjna, przenośny spektrometr Aqua Pen,
moździeż, pipety
szkło laboratoryjne, probówki,
ODCZYNNIKI
1. bufor hepes (pH= 6.5)
Składnik
mol/litr
NaCl
MgCl2 (6H2O)
Hepes
1.5×10-2
5.0×10-3
2.0×10-2
2. DCMU, (diuron; 3-(3,4-dichlorofenylo)-1,1-dimetylomocznik)
3. CuCl2
WYKONANIE ĆWICZENIA
1.
2.
3.
4.
5.
Izolacja tylakoidów z liści rośliny wyższej (np. szpinaku,tytoniu, pietruszki)
Odwirowanie zawiesiny
Fotosyntetyczna adaptacja ciemnościowa
Pomiar efektu Kautsky’ego dla próbki natywnej
Pomiary dla próbek traktowanych CuCl2 oraz DCMU
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Opisać zarejestrowane widma fluorescencyjne
2. Do punktow doświadczalnych dopasować krzywą teoretyczną (równanie [1]). Wyznaczyć
składowe sygnału fluorescencji: początkową wartość fluorescencji F 0, wartość
maksymalną FM oraz jej wartość zmienną - FV. Wyznaczyć stałe czasowe.
3. Przedyskutować otrzymane wyniki.
Dodatek
Efekt Kautsky’ego- krzywa indukcji fluorescencji
(Kautsky i Hirsch 1931r)
.
zmiany zachowania fluorescencji
fotosystemu II rośliny
wystawionej na działanie światła ciągłego.
0,14
P (od 200 ms)
intensywność fluorescencji
0,12
I (od 20 ms)
FM
0,10
Fv=FM - F0
0,08
0,06
-aktywność PSII
-rozpraszanie energii wzbudzenia
w postaci ciepła
-wydajność transportu elektronów
w PSII
J (~2 ms)
0,04
0,02
0,00
-0,02
1E-4
F0
O (od 50 us)
1E-3
0,01
0,1
1
10
-efektywność przekazu energii do anten
(wskaźnik strat energii wzbudzenia
gdy jest ona przekazywana z anten do
RC)
-RC sa otwarte, QA całkowicie
utlenione
100
czas [s]
Maksymalna fotochemiczna wydajność PSII
FV
F  F0
 M
FM
FM
intensywnosc fluorescencji
znormalizowana do wartosci maksymalnej
1,0
0,8
Fv=FM - F0
0,6
FM
0,4
0,2
F0
punkty pomiarowe
krzywa teoretyczna
0,0
1E-4
1E-3
0,01
0,1
1
10
100
czas [s]
Należy „odciąć” trzy pierwsze punkty pomiarowe i wszystkie punkty poza plateau,
których wartość zaczyna się zmniejszać. Najlepiej „odciąć” tło i znormalizować oś y
do FM, wtedy y0=0.
F0 = A1+A2
Fv = ΣAi (i=3,4,5)

 t  t0  
   y0
FKautskyEffect (t )   Ai 1  exp  

t
i 1
i



n
[1]
LITERATURA
Orzechowska A. Wykład dla studentów MSIB, luty 2013
Burda K. Wykład z biofizyki dla studentów MSIB,semestr letni 2013
Berg J.M, Stryer L., Tymoczko J.L., Reakcje świetlne fotosyntezy w „Biochemia”,Wyd.
Naukowe PWN, 2009.
Rabinowitch E., Govindjee, Photosynthesis, John Wiley and Sons Inc. NY, 1969.
Blankenship R.E. Molecular mechanisms of photosynthesis, Blackwell Science, 2008.
Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki,
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH