Pracownia biochemii

Pracownia biochemii
Wydział Chemii UW
Ćwiczenie: Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka
Frakcjonowanie białek mleka metodą wysalania
Do 25 cm3 lekko ogrzanego mleka dodać powoli, mieszając, 10 cm3 1% kwasu octowego.
Wytrącony osad kazeiny odsączyć na lejku karbowanym. Odmierzyć pipetą automatyczną
3 cm3 przesączu (UWAGA – należy pamiętać o zmierzeniu całkowitej objętości zebranej
serwatki!) do probówki wirówkowej i dodać równą objętość nasyconego roztworu siarczanu
amonu. Wytrącony osad globulin odwirować przez 5 min. przy 5000 rpm. Usunąć delikatnie
pipetką pasteurowską supernatant przenosząc go do następnej probówki wirówkowej, zaś
osad globulin zachować do oznaczenia ilościowego. Do supernatantu dodawać małymi
porcjami stały siarczan amonu do wysycenia (ok. 1-1.5 g; na dnie powinno zostać trochę
nierozpuszczonych kryształków). Wytrącony osad albumin odwirować przez 5 min. przy
5000 rpm. Usunąć delikatnie pipetką pasteurowską supernatant, zaś osad zachować do
oznaczenia ilościowego.
Oznaczenie globulin i albumin mleka metodą Bradforda
Odczynniki: 0.9% NaCl, roztwór bydlęcej immunoglobuliny G o stężeniu 1.11 μg/μl, roztwór
albuminy surowicy ludzkiej o stężeniu 1.98 μg/μl, koncentrat odczynnika
barwiącego Bio-Rad Protein Assay
Sprzęt: probówki eppendorfa, statywy, pipety automatyczne 1-10 μl, 10-100 μl , 100-1000 μl
wraz z końcówkami, pipetki pasteurowskie, kuwety z polistyrenu, spektrofotometr
1. Krzywa wzorcowa
Do probówek eppendorfa zawierających po 1000 μl 0.9% roztworu NaCl dodać 2, 4, 6, 8, 10 i
12 μl wzorcowego roztworu: bydlęcej immunoglobuliny G o stężeniu 1.11 μg/μl i albuminy
surowicy ludzkiej o stężeniu 1.98 μg/μl - dobrze wymieszać. Następnie przenieść po 800 μl
powyższych roztworów do nowych probówek eppendorfa i dodać do nich po 200 μl
odczynnika Bio-Rad Protein Assay, wymieszać i pozostawić na ok. 15 minut. Zmierzyć
absorbancję w 595 nm wobec próby kontrolnej (800 μl 0.9% NaCl + 200 μl odczynnika BioRad Protein Assay).
2. Oznaczenie globulin i albumin
Osady globulin i albumin otrzymane podczas frakcjonowania białek mleka rozpuścić w 5 cm 3
0.9% roztworu NaCl (w razie potrzeby, w przypadku globulin, przenieść roztwór z osadem do
kolby miarowej na 50 lub 100 cm3 i dopełnić do kreski roztworem 0.9% NaCl). Przygotować
w probówkach eppendorfa po 1000 μl odpowiednio rozcieńczonych roztworów białek: 20krotnie w przypadku roztworu globulin (zakładając, że udało się je rozpuścić w 5 cm3) i 40krotnie w przypadku roztworu albumin. Do rozcieńczania użyć 0.9 % NaCl.
Następnie przenieść po 800 μl powyższych roztworów białek do probówek eppendorfa i
dodać do nich po 200 μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay, wymieszać i pozostawić na ok.
15 minut. Zmierzyć absorbancję w 595 nm wobec próby kontrolnej (800 μl 0.9% NaCl + 200
μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay). Zawartość białka w próbie odczytać z krzywej
wzorcowej.
Opis ćwiczenia powinien zawierać:
1. opis procesu frakcjonowania białek mleka wraz z krótkim uzasadnieniem
wykonywania poszczególnych etapów
2. krótkie omówienie zasady, na której opiera się oznaczanie białek metodą Bradforda
3. oszacowanie zawartości albumin i globulin w mleku:
•
wykreślić krzywą wzorcową dla bydlęcej immunoglobuliny G oraz albuminy
surowicy ludzkiej
•
na podstawie krzywych wzorcowych wyznaczyć zawartość albumin i globulin
w próbkach
•
oszacować procentową zawartość albumin i globulin w mleku.