recenzja2 - Instytut Chemii Bioorganicznej

Poznań, 21 listopad 2016
Profesor dr hab. Jadwiga Jaruzelska
Instytut Genetyki Człowieka PAN
ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
[email protected]
Recenzja rozprawy doktorskiej
pt. ”Struktura drugorzędowa segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy oraz jej konserwatywne
motywy strukturalne”
Dla: Rady Naukowej Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN
Doktorantka: Pani mgr Marta Soszyńska-Jóźwiak
Jednym z istotnych problemów medycznych i społecznych związanych z wirusem grypy typu
A jest jego zmienność i stąd brak skutecznej terapii, która zapobiegałaby wybuchającym w
świecie pod wpływem tego wirusa epidemiom i pandemiom. Dlatego opracowanie bardziej
skutecznych metod zapobiegania im wydaje się niezwykle istotne. Jednym z warunków
odniesienia sukcesu w tej dziedzinie jest lepsze poznanie struktury drugorzędowej oraz
przestrzennej wirusa oraz ocena istotności poszczególnych regionów jego genomu w różnych
etapach cyklu życiowego, np. w replikacji. Choć główne elementy cyklu replikacji wirusa
grypy są dobrze opisane w literaturze, wiedza na temat struktury drugorzędowej jego RNA jest
niewielka. Znakomity Zespół Pani Profesor Elżbiety Kierzek od lat zajmuje się próbą poznania
struktury wirusa grypy wykorzystując w tym celu szeroki wachlarz technik chemicznych,
enzymatycznych oraz bioinformatycznych. Zespół ten opisał niedawno strukturę drugorzędową
całego segmentu 8, stanowiącego jeden z ośmiu segmentów genomu wirusa grypy typu A.
Należy podkreślić, że jest to jak dotąd jedyny segment genomu tego wirusa, którego struktura
drugorzędowa została określona. Rozprawa doktorska Pani mgr Soszyńskiej-Jóźwiak stanowi
kontynuację powyższych osiągnięć Zespołu. Wybór segmentu 5 został podyktowany wysokim
prawdopodobieństwem
występowania
w
nim
termodynamicznie
trwałej
struktury
drugorzędowej, w odniesieniu do obu typów RNA tego segmentu, RNA(+) oraz (-), które
zostało ocenione metodami bioinformatycznymi. Pani Soszyńska-Jóźwiak założyła, iż
drugorzędowa struktura RNA wirusa jest istotna dla prawidłowego przebiegu jego cyklu
replikacyjnego oraz wydajnego namnażania w komórce gospodarza. Istotnym kryterium w
1
wyborze segmentu 5 wirusa do badań struktury drugorzędowej była obecność w nim motywów
zakonserwowanych, które mogłyby wskazywać na istotną rolę w powyższych procesach. Pani
mgr Soszyńska-Jóźwiak zastosowała imponującą gamę technik bioinformatycznych,
chemicznych oraz enzymatycznych, do określenia struktury drugorzędowej dwóch wybranych
do badań motywów strukturalnych segmentu 5, motywu M121 oraz M198. Zachowawczość
tych motywów sięgała odpowiednio, 91.0 oraz 86,9%. Dużym osiągnięciem w tej części
rozprawy było uzyskanie spójnych wyników dotyczących struktury drugorzędowej badanych
motywów, przy pomocy różnych analiz.
Następny etap rozprawy w naturalny sposób prowadził do sprawdzenia funkcjonalności
motywów M121 oraz M198. W tym celu Pani Soszyńska-Jóźwiak zaprojektowała gamę
antysensownych oligonukleotydów komplementarnych do niesparowanych a jednocześnie
dostępnych fragmentów powyższych motywów. Oczekiwała, że przynajmniej niektóre
zaprojektowane przez nią oligonukleotydy nonsensowne spowodują zahamowanie namnażania
wirusa grypy w modelowych dwóch liniach komórkowych, MDCK oraz MDCK-HA. W
przypadku motywu M121 znaczący efekt hamowania namnażania wirusa udało się uzyskać,
podczas gdy efekt antysensownych oligonukleotydów wycelowanych w motyw M198 był
stosunkowo niewielki. Dlatego kwestia funkcjonalności tego regionu zostanie poddana
dalszym badaniom.
W następnym etapie Pani mgr Soszyńska-Jóźwiak przeprowadziła bardzo złożoną
analizę struktury drugorzędowej całego segmentu 5 RNA(+) a uzyskany model okazał się w
wysokim stopniu uniwersalny dla wirusa grypy typu A. Bardzo ważnym osiągnieciem Pani mgr
Soszyńskiej-Jóźwiak było pokazanie, że struktura drugorzędowa motywów M121 oraz M198
określona w formie wyizolowanej pozostaje aktualna również w kontekście struktury całego
segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy.
Wyniki uzyskane w tej części rozprawy doprowadziły do ważnego przypuszczenia, że
ukazana zachowawczość struktury drugorzędowej może wskazywać na jej istotne znaczenie,
na różnych etapach cyklu replikacyjnego wirusa grypy.
Na podstawie uzyskanych danych na temat struktury drugorzędowej RNA(+) segmentu
5 oraz jej zachowawczości, zaprojektowano oligonukleotydy antysensowne, jednak tym razem
były one komplementarne do innych fragmentów segmentu 5, niż motywy M121 i M198.
Okazało się, że jeden z tych oligonukleotydów hamował namnażanie wirusa aż ośmio-krotnie
a kilka innych w mniejszym stopniu. Istotnym osiągnięciem tej części rozprawy był brak efektu
cytotoksycznego.
2
Rozprawę przeczytałam z dużym zainteresowaniem. Wnosi nowe interesujące dane do
zagadnienia dotyczącego relacji pomiędzy strukturą różnych zakonserwowanych motywów
strukturalnych w RNA wirusa grypy a jego funkcją. Jest ciekawa nie tylko z punktu widzenia
naukowego ale również potencjalnego zastosowania praktycznego w przyszłości.
Moje uwagi krytyczne są następujące:
1. Siedmiostronicowy tekst Streszczenia rozprawy jest stanowczo zbyt długi. Ta część nie
powinna przekraczać jednej strony. Skrócenie tekstu Streszczenia do jednej strony byłoby z
pewnością możliwe, pod warunkiem dokonania dogłębnej syntezy uzyskanych wyników.
2. Cel pracy mógłby być lepiej sformułowany. Wydaje się, że głównym celem było badanie
struktury drugorzędowej segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy, szczególnie pod kątem
zakonserwowanych motywów strukturalnych. Natomiast zamieszczona w tym paragrafie
siedmio-punktowa lista nie opisuje celu głównego a raczej cele szczegółowe.
3. Opis metodologii nie jest jasny, szczególnie dotyczący metod mapowania, co utrudniło mi
podążanie za wywodem Doktorantki. Jednym z niedociągnięć w tej materii jest np. brak opisu
metody SHAPE. To samo dotyczy innych fragmentów Materiałów i Metod, w których zabrakło
choćby jednozdaniowego wyjaśnienia zasady działania stosowanych technik lub innych
ważnych informacji. Np., w opisie metod na stronie 162 brak wyjaśnienia jakiego typu
modyfikacje powstawały w wyniku inkubacji z DMS, CMCT ketoksalu i NMIA. To
wyjaśnienie pojawia się dopiero w opisie Rysunku 15 Wstępu. Zamieszczenie tego typu
wyjaśnień stanowiłoby potwierdzenie, że Doktorantka rozumie zasadę działania technik oraz
metod, które zastosowała.
4. Kwestia przyjętych kryteriów oceny stopnia zachowawczości poszczególnych motywów
fragmentu 5, stanowiąca sprawę kluczową tej rozprawy została przedstawiona dopiero na końcu
rozprawy, w Materiałach i Metodach. Opis owych kryteriów powinien znaleźć się przed opisem
wyników.
5. Dyskusyjna jest kolejność poszczególnych części rozprawy. Np., znacznie lepszym
rozwiązaniem byłoby zamieszczenie na początku monografii Wstępu, który wprowadzałby cel
pracy i pozwoliłby lepiej docenić nowatorskość oraz ważność podjętych badań. Potem powinny
nastąpić Materiały i Metody ponieważ zapoznanie się z warsztatem było ważne dla podążania
za wynikami. Ponadto, rozczłonkowanie dyskusji na poszczególne działy, nie sprzyjał
uzyskaniu syntetycznego obrazu dokonań Doktorantki. Zamieszczenie na końcu rozprawy np.
zestawienia celów z wnioskami byłoby bardzo cenne.
6. W końcowym podsumowaniu rozprawy brakuje odniesienia do Rycin.
3
7. opis rybozymu HDV w podrozdziale 4.5 na stronie 35 nie jest jasny.
8. Tekst monografii jest niestaranny i usiany „literówkami” które utrudniały zapoznanie się z
tekstem, niejednokrotnie zmieniając znaczenie poszczególnych słów. Np. „2’-O-getylo-RNA”,
„oligonukleotydy zostały syntetyzowane metodą aminofosforyną”, „korkiem” zamiast
„krokiem”, itd.
9. Doktorantka nie ustrzegła się przed stosowaniem żargonu laboratoryjnego, np. „dnazowanie”
10. Test zawiera ponadto sporo niezręczności językowych jak „suszono na wirówce
próżniowej”, „rozdzielano na żelu”, „ekran skanowano na aparacie”, „Jądrowa RNA helikaza”,
itd.
11. Stosowanie skrótów myślowych utrudniło podążanie za tekstem, np. „podczas gdy
podjednostki PB2 oraz PA/P3 są odpowiedzialne odpowiednio za wiązanie kapu oraz jego
odcięcie od mRNA gospodarza.” ,także: „jedno cykliczny wirus grypy”
12. Słowo „konserwatywność” zostało użyte w tekście około 130 razy, w tym w tytule
rozprawy. Chodziło prawdopodobnie o „zakonserwowanie”, „zachowawczość”. Choć pojęcia
„zakonserwowanie” i „konserwatywność„ są prawie identyczne w brzmieniu i przez to często
mylone, ich znaczenie różni się. Pojęcia te opowiadają angielskim „conservative” i
„conserved”. Pojęcie konserwatywny ”conservative” odnosi się wyłącznie do substytucji
aminokwasowych w białku, przy czym konserwatywną jest substytucja zamieniająca
aminokwas na inny lecz o podobnych właściwościach”. Natomiast „nie konserwatywna (przez
to często sprawcza w kontekście chorób) oznacza, że doszło do zamiany na aminokwas o
właściwościach odmiennych. Znaczenie zakonserwowany czyli „conserved” oznacza
ewolucyjną zachowawczość i chyba o to znaczenie chodziło Doktorantce.
Moje drobniejsze uwagi są następujące:
1. Wyniki hybrydyzacji do macierzy izoenergetycznych są słabo czytelne.
3. W Tabeli 9 dzielenie wyrazu w nagłówkach komplementarne nie jest prawidłowe.
4. Chyba „Gibco” a nie „Gibko”?
5. Triton X, czy chodziło o Triton X-100?
6. Co to jest grupa MMT?
7. Podrozdział 2.14 zawiera tylko dwa zdania. Brakuje informacji jak oczyszczano transkrypt.
8. Czy nie jest bardziej prawidłowy zapis: [Co(NH3)6]Cl3 zamiast Co(NH3)6Cl3 ?
9. Rysunek 1 zamieszczony we Wstępie rozprawy jest bardzo istotny i dlatego szkoda, że jego
opis jest zbyt skrótowy. Na Rysunku zamieszczone są przeróżne znaki i symbole, których
znaczenie nie zostało opisane.
4
10. W opisie Rysunku 11 brak odniesienia do 25-nukletydowego fragmentu.
Podsumowanie
Pomimo sporej liczby uwag krytycznych nie mam wątpliwości, że przedstawiona monografia
jest niezwykle interesująca i bardzo wartościowa pod względem naukowym. Zawiera nowe
dane, które mogą zostać wykorzystane w przyszłości w medycynie i z pewnością spełnia
wymogi stawiane rozprawom doktorskim. Dlatego wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr Marty
Soszyńskiej-Jóźwiak do następnych etapów przewodu doktorskiego.
5