Meotda oznaczania aktywności enzymatycznej b-N-acetylo

KINETYKA ENZYMÓW
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
• Kwas octowy – C
Wyznaczanie stałej Km i Vmax dla N-acetylo--D-glukozaminidazy ze
ślinianek szczura na podstawie reakcji z substratem syntetycznym
N-acetylo--D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wiązanie -N-acetyloglukozaminylowe (na nieredukującym końcu łańcucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak
kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywności acetyloglukozaminidazy stosuje się substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylowe.
Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości
fali  = 405 nm.
Bufor do reakcji enzymatycznej:
stężenie końcowe
58 mM kwas cytrynowy
41 mM NaH2PO4
0,1% Triton X-100
ilość
1,520 g
0,707 g
100 ml, doprowadzić przy użyciu
0,1 ml
NaOH do pH 4.2
Substrat:
p-nitrofenylo-N-acetylo-D-glukozamina
2 mg/ ml buforu
Stoper:
0,4 M glicyna – NaOH pH 10.7
WYKONANIE:
Przygotować kolejne rozcieńczenia wyjściowego roztworu substratu o stężeniu 2mg/ml – w
tym celu pobrać do oddzielnej probówki typu Eppendorf 240 l wyjściowego roztworu
substratu i uzupełnić buforem do objętości 480 l. Całość wymieszać. Z tak przygotowanego
rozcieńczenia pobrać objętość 240 l i uzupełnić buforem do objętości 480 l. Otrzymany
roztwór wymieszać. Postępować analogicznie, aż do otrzymania 5 kolejnych rozcieńczeń.
Do pięciu oddzielnych probówek typu Eppendorf odpipetować po: 600 l buforu i 180 l
homogenatu. Następnie do każdej mieszaniny dodać substrat o innym stężeniu w ilości 180
l. Wymieszać. Mieszaniny inkubować w temp. 37C i po czasie 1, 2, 4, 6 i 8 min pobierać
po 160 l mieszaniny i przenosić do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 0.5
ml stopera. Absorbancję powstałego produktu zmierzyć wobec ślepych odczynnikowych
(przygotowanych dla każdego stężenia substratu) przy długości fali  = 405 nm w
spektrofotometrze Bio-Rad. Ślepe odczynnikowe przygotować następująco: do pięciu
kolejnych probówek typu Eppendorf odpipetować po 130 l buforu i 30 l odpowiedniego
stężenia substratu, inkubować w temp. 37C przez 5 min, a następnie zatrzymać reakcje
dodając po 0,5 ml stopera. Mnożąc wartość absorbancji przez stałą k = 1007 otrzymujemy
stężenie rozłożonego substratu/powstałego produktu w nmol/ml. Masa 1 mola substratu =
342.3 g.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Dla każdego z użytych stężeń substratu S wykreślić krzywe kinetyczne wyrażające zależność
przyrostu produktu c od czasu inkubacji t. Znaleźć graficzne szybkości początkowe v0 i po
sporządzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczyć graficznie wartości Km i Vmax.
TABELA 1.
s = 0,125
nr
A 405
próbki
1
2
3
4
5
s = 0,250
6
7
8
9
10
s = 0,500
11
12
13
14
15
s = 1,000
16
17
18
19
20
s = 2,000
21
22
23
24
25
(mg/ml) =
c
t
(min)
(M)
1
2
4
6
8
(mg/ml) =
1
2
4
6
8
(mg/ml) =
1
2
4
6
8
(mg/ml) =
1
2
4
6
8
(mg/ml) =
1
2
4
6
8
(mmol/l)
v0
1/v0
1/s
Km
(M/min) (min/M) (1/mM) (mM)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
Vmax
(M/min)
Oznaczanie aktywności trypsyny na substracie syntetycznym – wpływ pH i
temperatury na aktywność enzymatyczną
A. WPŁYW PH
Trypsyna (EC 3.4.21.4; enzym proteolityczny soku trzustkowego, endopeptydaza z klasy
hydrolaz) katalizuje m.in. reakcję hydrolizy wiązań peptydowych, utworzonych przez
grupy karboksylowe argininy (Arg) lub lizyny (Lys) w łańcuchu polipeptydów i białek.
Trypsyna katalizuje również wiązania estrowe czy amidowe w substratach syntetycznych
będących pochodnymi Arg lub Lys. Jeśli substratem jest chlorowodorek benzoilo-Largininy p-nitroanilidu (BAPNA) to po reakcji hydrolizy uwalnia się wolna p-nitroanilina,
która wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości fali  = 405 nm.
WYKONANIE:
Do siedmiu szklanych krótkich probówek odpipetować po 100 l roboczego roztworu
trypsyny, a do ósmej 100 l 1 mM HCl. Do siedmiu pierwszych probówek dodać po 1 ml
buforów o pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a do ostatniej probówki dodać 1 ml buforu o pH 7.
Następnie do każdej probówki dodać po 20 l substratu BAPNA i inkubować w łaźni
wodnej w temp. 37C przez 15 min. Reakcje zatrzymać dodając po 100 l stężonego
kwasu octowego i dokonać pomiaru absorbancji względem próby ślepej (ósma probówka)
przy długości fali  = 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad.
TABELA 2.
pH
A405
Aktywość enzymatyczna
U (mol/min)
Aktywność właściwa
U/mg
5
6
7
8
9
10
11
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej od pH roztworu i wyznaczyć
optimum działania trypsyny dla BAPNA jako substratu, przyjmując jako jednostkę
aktywności przyrost absorbancji o 0,1 w warunkach doświadczenia. Aktywność właściwa
to ilość jednostek aktywności przypadająca na 1 mg enzymu.
B. WPŁYW TEMPERATURY
Do pięciu probówek typu eppendorf (obj. 1,5 ml) odpipetować po 1 ml 0,2 M buforu
Tris-HCl o pH 8,0. Pierwszą probówkę umieści w lodzie, drugą pozostawić w temp.
pokojowej, trzecią umieścić w termobloku w temp. 37C, czwartą w termobloku w temp.
48C, a piątą w termobloku w temp. 60C. Po upływie 10 min, do każdej z probówek
dodać po 50 l roboczego roztworu trypsyny i po 20 l roztworu substratu BAPNA.
Wymieszać i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 30 min. Reakcję zatrzymać
dodając po 100 l stężonego kwasu octowego. Próbę ślepą przygotować w następujący
sposób: do probówki typu eppendorf odpipetować 1 ml 0,2M buforu Tris-HCl o pH 8,0,
50 l 1 mM HCl i 20 l roztworu substratu BAPNA. Wymieszać i inkubować w temp.
pokojowej. Po upływie 30 min dodać 100 l stężonego kwasu octowego. Następnie
zmierzyć absorbancję wszystkich próbek względem próby ślepej przy długości fali  =
405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Dane pomiarowe wpisać do tabeli 3.
TABELA 3.
Temp. (C)
A405
Aktywość enzymatyczna
U (mol/min)
Aktywność właściwa
U/mg
0
25
37
48
60
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej trypsyny od temperatury inkubacji.
Przedyskutować wyniki.
ODCZYNNIKI:
0,01 mM trypsyna (2,4 mg trypsyny w 10 ml 1 mM HCl) – przechowywana w lodzie. Roztwór
trypsyny roboczej – rozcieńczyć trypsynę 10 razy przy pomocy 1 mM HCl tzn. odpipetować 100
l wyjściowego roztworu trypsyny i dodać 900 l 1 mM HCl. Roztwór roboczy enzymu
przechowywać w lodzie. Substrat – 25 mM benzoilo-L-argininy p-nitroanilid (BAPNA) w
dimetylosulfotlenku (DMSO) (11 mg/ml). Stężony kwas octowy do przerywania reakcji
enzymatycznej. Bufory: 0,2 M Tris-HCl o pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 11.
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
pipety automatyczne, termostatowana łaźnia wodna, spekrofotometr, probówki, lód
LITERATURA:
1) B.D. Hames, N.M. Hooper: „Krótkie wykłady. Biochemia” (red. J. Michajda, A.
Augustyniak, K. Ziemnicki), Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2004, str. 95104.
2) „Techniki badań fizjologicznych” (red. A. Lityńska, M.H. Lewandowski), str. 78-79.