Grant MNiSW 4552/B/P01/2009/37 ,,Ocena ekspresji genów i białek

Grant MNiSW 4552/B/P01/2009/37
,,Ocena ekspresji genów i białek regulujących przepływ tkankowy, systemową
odpowiedź pro- i przeciw- zapalną oraz
stres oksydacyjny u dzieci z
nadciśnieniem tętniczym pierwotnym przed i w trakcie leczenia
hipotensyjnego”
Kierownik projektu: doc dr hab n. med. Mieczysław Litwin
Celem projektu jest ustalenie wzajemnego związku pomiędzy ekspresją wybranych
genów i białek determinujących przepływ tkankowy, systemową reaktywność
immunologiczną i stres oksydacyjny a zaburzeniami metabolicznymi oraz stopniem
uszkodzeń narządowych i ich regresją u dzieci z pierwotnym nadciśnieniem
tętniczym (ntp) przed i w trakcie leczenia hipotensyjnego.
Badania wykonywane będą poprzez ocenę:
a) ekspresji wybranych genów (techniką RT-PCR) oraz receptorów błonowych
leukocytów krwi obwodowej (techniką cytometrii cytometria przepływowej)
b) ekspresji niektórych mediatorów zapalenia w surowicy (techniką ELISA).
Ekspresja genów (w leukocytarnym DNA), kodujących białka przepływu tkankowego:
enzymy konwertujące angiotensynę (AC) i endotelinę-1(EC-1), receptor AT1
angiotensyny II (AT1R); receptory serotoniny (5-HTR): 1D, 2A oraz 3A.
Wykładniki systemowych reakcji pro-zapalnych:
a) ekspresja błonowych markerów aktywacji leukocytów, tj. TREM-1,CD14, CD16,
ICAM-1, CD163, CD64, CD11a, CD11b, CD11c, CD49d, HLA-DR, (cytometria) oraz
ich form
rozpuszczalnych w surowicy (sCD14, sTREM-1, sICAM-1, sVCAM),
b) ekspresja genów cytokin pro-zapalnych w leukocytach (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNFalfa) oraz receptorów blokujących IL-1: IL-1R2 (IL-1 decoy receptor), oraz IL- 1Ra
(IL-1 receptor accessory protein),
c) ekspresja mRNA chemokin w leukocytach (RANTES, MCP-1, MIP-1 alfa i beta)
oraz poziom tych białek i CRP w surowicy.
Markery systemowych reakcji przeciw-zapalnych: ekspresja genów IL-4, IL-10 oraz
oraz ich receptorów komórkowych w leukocytach (IL-4R, IL-10R) .
Markery stresu oksydacyjnego: oksydaza NADPH granulocytów: ekspresja genów
NOX1 i NOX3 oraz indukowanej syntazy, tj. iNOS; oksydacja białek: glutation i
peroksydaza glutationowa metodami spektrofotometrycznymi; oksydacja lipidów:
ekspresja
TBARS
(reaktywne
formy
kwasu
tiobarbiturowego
metodą
spektrofotometryczną), ADMA (asymetryczna dimetyloarginina), oksydowany
cholesterol-LDL; enzymy redukujące stres oksydacyjny, tj. dysmutaza
ponadtlenkowa oraz katalaza - techniką ELISA.
Zaburzenia metaboliczne:
a) ilość i dystrybucja tkanki tłuszczowej trzewnej i obwodowej (oceniane technikami
antropometrii, densytometrii oraz magnetycznego rezonasu jądrowego -NMR),
b) wykładniki gospodarki lipidowej w surowicy (poziom cholesterolu oraz
cholesterolu-HDL, apoproteiny A1 i B,
trójglicerydów, lipoproteiny a, kwasu
moczowego, homocysteiny, oraz insulinooporność).
Zakres uszkodzeń narządowych:
a) wykładniki wczesnego uszkodzenia tętnic (grubość kompleksu błona środkowabłona wewnętrzna tętnic szyjnych i pole przekroju ściany tętnicy szyjnej, oceniane
techniką ultrasonografii),
b) masa lewej komory (badanie echokardiograficzne).
Wszystkie wybrane parametry stresu oksydacyjnego z wyjątkiem, katalazy i
dysmutazy ponadtlenkowej oraz parametry uszkodzeń narządowych i dystrybucji
tkanki tłuszczowej są wykonywane rutynowo w grupie pacjentów objętych projektem
(szereg zacytowanych publikacji autorów projektu).
Selekcji parametrów do badań dokonano na podstawie literatury oraz własnego,
znacznego doświadczenia. Ich wybór słuŜy nadrzędnemu celowi projektu, tj. próbie
wykazania które z parametrów odpowiedzi immunologicznej, stresu oksydacyjnego,
zaburzeń metabolicznych oraz uszkodzeń narządowych w ntp u dzieci zaleŜą od
podwyŜszonego ciśnienia, a które nie.
Obserwowany w ostatnich latach znaczny rozwój technik diagnostyki cytogenetycznej
przyczynił się do zwiększenia wykrywalności aberracji chromosomowych, leŜących u podłoŜa
zaburzeń rozwoju. Diagnostyka taka, ze względu na rozmiary analizowanych fragmentów
chromosomów nosi nazwę cytogenetyki molekularnej, a termin analiza chromosomów czyli
kariotypowanie proponuje się zastąpić określeniem „molekularne kariotypowanie”.
Technikami, które coraz szerzej wykorzystuje się równieŜ w diagnostyce
dysmorfologicznej są m.in. MLPA, czyli multipleksowa amplifikacja sond zaleŜna od ligacji
oraz arrayCGH, czyli porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy.
Zastosowane w wyselekcjonowanych grupach pacjentów z idiopatycznym opóźnieniem
rozwoju pozwalają na identyfikację aberracji chromosomowej u przeciętnie 3-10%, a w
niektórych pracach nawet u 38% badanych. Badania z uŜyciem aCGH wiąŜą się jednak z
bardzo wysokimi kosztami aparaturowymi (dostępne są więc w nielicznych ośrodkach), a
ponadto trudnościami w opracowaniu i interpretacji uzyskanego wyniku. MLPA jest metodą
zdecydowanie tańszą, a takŜe mniej skomplikowaną technicznie i z tego właśnie powodu
powszechnie dostępną. Jednak ze względu na brak standaryzacji i referencyjności posiada
wciąŜ jeszcze status techniki badawczej, a nie diagnostycznej. Trwają nadal prace
oceniające jej efektywność diagnostyczną.
Podstawą kwalifikacji chorych do badań z uŜyciem technik wysokiej rozdzielczości
poza cechami niepełnosprawności umysłowej, są takŜe inne, zazwyczaj niespecyficzne
cechy kliniczne, mogące sugerować obecność aberracji chromosomowych. Uzyskany wynik
daje przede wszystkim moŜliwość postawienia rozpoznania, ale równieŜ – poprzez
określenie genów zaangaŜowanych w rearanŜację – wyjaśnienia etiologii obserwowanych
zaburzeń oraz określenia zaleŜności między genotypem a fenotypem.
Zastosowanie najnowszych technik w diagnostyce medycznej ma niezaprzeczalny
wpływ na rozwój współczesnej dysmorfologii. Przyczynia się do identyfikacji nowych
zespołów, a w przypadku chorób juŜ znanych - daje moŜliwość bardziej wiarygodnego
określenia korelacji pomiędzy fenotypem a genotypem. Istnieje więc duŜa potrzeba
kontynuowania badań nad tymi zagadnieniami, przede wszystkim poprzez poszerzenie
grupy badanych pacjentów oraz odpowiedni ich dobór (selekcję) do testów diagnostycznych.
Wieloletnie doświadczenie, jakim dysponujemy w rozpoznawaniu zespołów
dysmorficznych pozwoliło nam na wyodrębnienie unikalnej grupy około 400 pacjentów, u
których (pomimo wszechstronnej diagnostyki) nie udało się ustalić rozpoznania. Postęp,
który dokonał się w ciągu ostatnich kilku lat w diagnostyce zespołów dysmorficznych o
niejasnej etiologii oraz wyniki własnych badań pilotowych uzasadniają wykorzystanie wobec
tej grupy techniki MLPA, wspomaganej w przypadkach z wykrytymi mikroaberracjami (w celu
uściślenia korelacji między fenotypem a genotypem) techniką arrayCGH. Uzyskane wyniki i
obserwacje kliniczne będą miały niewątpliwie duŜe znaczenie naukowe. Przyczynią się
bowiem do poszerzenia wiedzy na temat etiologii i symptomatologii znanych i nowych
(zidentyfikowanych w trakcie realizowania projektu) zespołów zaburzeń rozwoju, zwłaszcza
w kontekście oceny zaleŜności obrazu klinicznego choroby od jej podłoŜa genetycznego.
Trzeba tutaj podkreślić rolę lekarza dysmorfologa w analizowaniu wyniku uzyskanego
przy zastosowaniu ww. technik. Jest to z całą pewnością rola wiodąca. Podstawowe
znaczenie ma bowiem szczegółowe zdefiniowanie obrazu klinicznego kaŜdego wykrytego
defektu, jego ocena z punktu widzenia wykluczenia zmian polimorficznych (z
wykorzystaniem odpowiednich baz internetowych) i – poprzez porównanie obserwowanego
obrazu z uprzednio zdefiniowanym przez innych autorów – potwierdzenie jego związku ze
stwierdzoną aberracją. To z kolei moŜe umoŜliwić ustalenie klinicznych kryteriów
rozpoznawania wybranych rearanŜacji chromosomowych, zwłaszcza dotychczas
nieopisanych.
Oczekuje się, Ŝe realizacja projektu przyczyni się równieŜ do określenia częstości
występowania aberracji (zwłaszcza w regionach subtelomerowych) w wyselekcjonowanej
grupie pacjentów z nieustaloną etiologią zaburzeń, diagnozowanych za pomocą techniki
MLPA oraz udziału tych aberracji w powstawaniu chorób genetycznie uwarunkowanych.
Będzie to podstawą do opracowania w przyszłości schematu badań diagnostycznych z
wykorzystaniem konkretnych technik badawczych z uwzględnieniem określonych kryteriów
klinicznych, a ponadto – umoŜliwi rozszerzenie panelu badań oferowanych w ramach
diagnostyki prenatalnej. Pozwoli to na objęcie pacjenta wczesną opieką i zaoferowanie
przeprowadzenia diagnostyki prenatalnej dorosłym nosicielom takiej aberracji. Uzyskane
wyniki będą więc miały duŜe znaczenie praktyczne dla poradnictwa genetycznego i
diagnostyki przedurodzeniowej.
Wyniki badań oraz zgromadzony i opracowany dzięki nim materiał, z pewnością
przyczynią się do podniesienia poziomu naukowego naszego ośrodka, który moŜe stać się
interesującym partnerem do współpracy w programach zmierzających do dalszego
uściślania lokalizacji genów biorących udział we wczesnych etapach embriogenezy
człowieka, defekty których odpowiedzialne są za wystąpienie zespołów dysmorficznych.