Test zestawów Thermo DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits

Test zestawów Thermo DyNAmo™
ColorFlash qPCR Kits
„Więc chodź, pomaluj mój świat na żółto i na niebiesko” – śpiewali 2+1.
Myślę że to dobre motto dla nowych KITów do qPCR stworzonych przez
Thermo. DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits to zestawy reagentów do
ilościowego PCR, które wyróżniają się… no właśnie, kolorami.
Słowem wstępu
Thermo DyNAmo™ ColorFlash, produkowane pod banderą Finnzymes, to dwa
zestawy, oparte o doskonałą chemię znaną ze wcześniejszych zestawów
DyNAmo™. Zestawy te, co jest charakterystyczne dla tej marki, działają w oparciu
o inną niż Taq polimerazę – enzym Tbr izolowany z pokrewnego do T. aquaticus
gatunku bakterii.
Czym różni się DyNAmo ™ ColorFlash od poprzedników? Ano właśnie kolorami
reagentów- zarówno ROX, mastermix jak i bufor do rozcieńczania próbek są
podbarwione kolorami, które nie zakłócają reakcji qPCR, ani odczytu
fluorescencji. Ich spektra nie nachodzą na spektra typowe dla kanałów odczytu i
wzbudzenia naszych termocyklerów.
Po co wprowadzono kolorowe odczynniki? W ramach odpowiedzi od razu nasuwa
mi się skojarzenie serologiczne- odczynniki używane w oznaczaniu grup krwi są
podbarwione na podobne kolory (żółć i błękit) by zapobiec pomyłkom w kolejności
dodawania reagentów, które mogłyby być tragiczne w skutkach. Niby jest to
niewielkie ułatwienie, na które „rutyniarze” laboratoryjni nie zwrócą wielkiej
uwagi, ja jednak złapałam się na tym, że upewniałam się patrząc na kolor
roztworu, czy wszędzie dodałam do gotowego mixu próbki cDNA rozcieńczonej
żółtym buforem- to naprawdę potrafi usprawnić pracę, czego dowodem jest
właśnie rutynowe zastosowanie podobnego pomysłu w serologii. Myślę że
propozycja Thermo Scientific szczególnie przypadnie do gustu osobom, które
dopiero zaczynają swoją przygodę z dużymi zestawami prób np. na płytkach 96
dołkowych.
Test zestawu DyNAmo™ Flash Probe qPCR Kit
Na pierwszy ogień wybrałam zestaw ColorFlash ™ Probe, dedykowany pod
sondy molekularne i pokusiłam się o amplifikację jednego z ludzkich genów
konstytutywnych, GUSB. Obrany amplikon był dość typowy, ~100nt, 40% GC.
Przeprowadziłam reakcję qPCR dla seryjnych rozcieńczeń standardu dla tego
genu, żeby ocenić parametry wydajności reakcji. Muszę przyznać, że zestaw
zaskoczył mnie bardzo pozytywnie, na co wskazują ładne parametry
krzywej standardowej.
Krzywa
standardowa przygotowana w oparciu o zestaw ColorFlash ™ Probe
Kolejny test wykonałam, by porównać ColorFlash z dwoma, używanymi obecnie
rutynowo w mojej pracy, zestawami znanych producentów. Próbki w dwóch
powtórzeniach dla każdego reagentu, zawierające po ~15tys cząsteczek
standardu GUSB, zostały poddane reakcji z tym samym stężeniem sond i
starterów na standardowym programie 2-step (95 degC ->60 degC) x 45cykli.
Rezultat dla wszystkich reagentów był zbliżony, punkt Ct dla mojej najlepszej
polimerazy był o 1 cykl niższy niż dla DyNAmo, za to Ct naszego zestawu do
genotypowania spóźniał się w stosunku do DyNAmo o 1 cykl. Uznaję więc, że
wszystkie 3 zestawy sprawdzają się równie dobrze, co pozytywnie świadczy
o testowanym przeze mnie zestawie Thermo.
Name
Ct
1
22,88
1
22,68
DyNAmo
20,95
DyNAmo
2
2
21,12
20,18
20,32
Test zestawu DyNAmo™ ColorFlash SYBR® Green qPCR Kit
Uznawszy, że wyniki dla zestawu Probe są satysfakcjonujące, przeszłam do testów
ColorFlash ™ SYBR Green, działającego w oparciu o poczciwy barwnik
niespecyficzny. Amplifikowałam ten sam fragment genu co poprzednio, tym razem
jednak z oczywistych względów bez dodatku sond.
Znów przeprowadziłam reakcję qPCR dla seryjnych rozcieńczeń standardu i
oprócz krzywej (danych nie publikuję, ale parametry są zbliżone do tych z analizy
zestawu Probe) wykonałam analizę krzywej topnienia.
Krzywe
topnienia wykonane na serii rozcieńczeń dziesiętnych amplikonu GUSB. Krzywa
turkusowa dla NTC wskazuje na formowanie par primer-dimer.
Zestaw wykazuje bardzo ładną, silną fluorescencję, barwnik jest stabilny w
trakcie trwania reakcji, nie mam się do czego przyczepić- oceniam go
pozytywnie.
Podsumowanie
Na rynku qPCR jest z czego wybierać. Każda większa firma produkuje swoje
zestawy, które mają podobne parametry, dobrą wydajność i w zasadzie trudno się
na cokolwiek zdecydować.
Jeżeli szukacie zestawu, który Was nie zawiedzie- możecie śmiało spróbować KITu
z barwnej gamy produktów DyNAmo ™. Jeżeli macie pod opieką początkujących
pracowników, tym bardziej kolorowe reagenty mogą być ciekawą propozycją,
która pomoże „nowym” wdrożyć się w badania. Mogę jednak z czystym
sumieniem zestawy polecić nie ze względu na kolory, ale dlatego, że po
prostu dobrze się sprawdzają w typowych zastosowaniach. Do
przeprowadzania reakcji opartych na SYBRze, do ilościowania na sondach
i genotypowania końcowego (endpoint genotyping) śmiało można zakupić
produkty Thermo Scientific.
Marzena Wojtaszewska
Dystrybutorem DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits jest firma ABO.
Name
Type
Ct
1 Unknown 22,88
1 Unknown 22,68
Given Conc
Calc Conc
(copies/reaction) (copies/reaction)
10000
CT
10000 22,78
11411,99
DyNAmo Unknown 20,95
35012,51 21,04
DyNAmo Unknown 21,12
31391,86
2 Unknown 20,18
57911,63 20,25
2 Unknown 20,32
53040,04
Data publikacji: 08.01.2013r.