docUzyskanie genetycznie modyfikowanych bakterii Escherichia coli
download 
Reklamacja Transkrypt
Uzyskanie genetycznie modyfikowanych bakterii Escherichia coli
Hanna Przystałowska Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki Uzyskanie genetycznie modyfikowanych bakterii Escherichia coli zdolnych do przekształcania glicerolu do 1,3-propanodiolu Niniejsza praca doktorska pt. „Uzyskanie genetycznie modyfikowanych bakterii Escherichia coli zdolnych do przekształcania glicerolu do 1,3-propanodiolu” realizowana jest w ramach zadania 1.4 pt. „Genetyczna modyfikacja mikroorganizmów” należącego do szerszego projektu pt. „Biotechnologiczna konwersja glicerolu do polioli i kwasów dikarboksylowych”. Celem projektu jest opracowanie technologii mikrobiologicznej konwersji odpadowego glicerolu, powstającego przy produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych (tzw. biodiesla), do 1,3-propandiolu (1,3-PDO) i innych cennych związków chemicznych, na które w przemyśle istnieje duże zapotrzebowanie. W kolejnym etapie inne zespoły Konsorcjum zajmą się wyizolowaniem 1,3-PDO z podłoża hodowlanego oraz jego oczyszczeniem. Następnie zostanie opracowana technologia wykorzystania 1,3-PDO do syntezy poliuretanów i nienasyconych poliestrów. Frakcja glicerynowa powstająca podczas produkcji biopaliwa jest zanieczyszczona i nie nadaje się do wykorzystania przez przemysł farmaceutyczny, czy kosmetyczny. Realną i ekonomiczną drogą jej utylizacji stała się fermentacja mikrobiologiczna. Użycie glicerolu do produkcji poliolu pozwoli na rezygnację ze stosowania w tej dziedzinie surowców ropopochodnych. Naturalne złoża stopniowo się kurczą, a potrzeby współczesnego przemysłu rosną w błyskawicznym tempie. Dlatego tak istotną rolę pełni odzyskiwanie ich z wielu źródeł wtórnych, w tym z rozmaitych odpadów przemysłowych. Światowe zapotrzebowanie na 1,3-PDO wzrasta z roku na rok. Diol ten budzi szczególne zainteresowanie przemysłu tworzyw sztucznych ze względu na możliwość produkcji nowego typu poliestrów [PTT-poli(tereftalan trimetylenu)] o niezwykle atrakcyjnych właściwościach fizykochemicznych i użytkowych. 1,3-PDO jest również ważnym surowcem do syntezy polimerów poliuretanowych. 1,3-PDO jest powszechnie wykorzystywany w Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego produkcji rozpuszczalników, klejów, tworzyw wielowarstwowych, żywic, detergentów, kosmetyków i innych. 1,3-PDO jest syntetyzowany głównie metodą chemiczną. Koncerny DuPont oraz Shell Company opracowały technologie chemicznej syntezy tego związku odpowiednio z akroleiny oraz tlenku etylenu. Kataliza chemiczna przebiega w wysokiej temperaturze, w obecności drogich katalizatorów, jest wysoce energochłonna, prowadzi do zwiększenia emisji dwutlenku węgla i powiększenia efektu cieplarnianego, oraz wykorzystuje nieodnawialne źródła energii. Przyszłościową alternatywą są procesy biotechnologiczne, wykorzystujące mikroorganizmy, które są zdolne do syntezy 1,3-PDO z substratów stanowiących odpad. Są to technologie przyjazne środowisku naturalnemu. Wykorzystanie naturalnych producentów 1,3-PDO (posiadających w swoim metabolizmie glicerolu szlak syntezy 1,3-PDO) staje się niemożliwe bądź ograniczone ze względu na ich patogenność, dlatego stworzenie rekombinowanych niepatogennych szczepów, wydajnie produkujących 1,3-PDO z glicerolu oraz opracowanie efektywnej technologii wykorzystującej te szczepy, jest obecnie istotnym zadaniem stawianym współczesnej biotechnologii. Celem niniejszej pracy było uzyskanie modyfikowanych bakterii E. coli, które nabędą zdolność wytwarzania 1,3-propanodiolu z glicerolu jako substratu. Bakterie E. coli w swoim metabolizmie glicerolu nie posiadają szlaku syntezy 1,3-PDO, natomiast jako organizm modelowy stanowią idealny system do produkcji cennych związków chemicznych. Realizacja celu przebiegała przez zaplanowanie i przygotowanie ekspresyjnych konstrukcji genowych, zawierających łącznie dwanaście heterologicznych genów zaangażowanych w biosyntezę 1,3-PDO, pochodzących z Citrobacter freundii i Klebsiella pneumoniae. Kolejnymi etapami realizacji pracy było wprowadzenie konstrukcji do komórek bakterii E. coli, analiza molekularna oraz metaboliczna rekombinanta. Celem analizy metabolicznej była identyfikacja 1,3-PDO w płynie pohodowlanym, tym samym wykazanie prawidłowego funkcjonowania wprowadzonych heterologicznych genów u E. coli. Cel pracy został osiągnięty, modyfikowany szczep produkował ponad 10 g/L 1,3-PDO z 35 g/L glicerolu. Uzyskany szczep stanowi punkt wyjścia dla współpracującego zespołu do przejścia do hodowli na większą skalę dla potrzeb przemysłowych. Powodzenie tego projektu pozwoliłoby na częściowe uniezależnienie naszego kraju od drogiego importu niezbędnych surowców, na wprowadzenie do praktyki gospodarczej technologii o wysokim ładunku innowacyjności, zwiększenie roli nauki w rozwoju gospodarczym, wykorzystanie surowców odpadowych pochodzenia roślinnego w miejsce surowców kopalnianych, zmniejszenie emisji gazów cieplarnianych, redukcję emisji szkodliwych dla środowiska odpadów, wykorzystanie nowych źródeł energii, a tym samym na rozwój nowoczesnej, proekologicznej produkcji chemicznej. W Polsce istnieje wiele firm, które mogą być potencjalnymi odbiorcami 1,3-propanodiolu m. in. Zakłady Chemiczne Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego ZACHEM SA, Zakłady Chemiczne Organika-Sarzyna SA z Grupy Chemicznej CIECH SA, czy Chemiczne Zakłady Azotowe Kędzierzyn-Koźle. Projekt jest ważnym elementem innowacyjnej „zielonej chemii” opartej na surowcach odnawialnych, powiązany z produkcją biopaliw. Obecnie najważniejszym wyzwaniem dla ludzkości staje się rozwiązywanie problemów ekologicznych zagrażających istnieniu ludzi, jako gatunku biologicznego. Według oszacowań ekspertów WHO ¾ wszystkich chorób związanych jest ze złym stanem środowiska naturalnego. Przyczyny degradacji środowiska na skalę globalną wiążą się z dążeniem ludzi do coraz wyższego standardu życia i sięganiem w tym celu do technologii zanieczyszczających i dezintegrujących środowisko naturalne. Istotne są działania służące rozwiązywaniu problemów ochrony zdrowia i wyżywienia, zaspakajania potrzeb energetycznych, racjonalnego gospodarowania surowcami przy równoczesnym zachowaniu ostrych, wymagań ochrony środowiska. Okazuje się, że „zielone technologie” nie tylko chronią środowisko naturalne, ale również są korzystne z punktu widzenia ekonomicznego. Stwierdzenie „co dobre dla środowiska naturalnego, jest dobre dla biznesu” staje się coraz bardziej oczywiste i przenika do ludzi przemysłu. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
