Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/APC, Rabbit F(ab

Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/APC, Rabbit F(ab’)2
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/FITC, Rabbit F(ab’)2
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/RPE, Rabbit F(ab’)2
Przeznaczenie
Nr kat. C0222
Nr kat. F0434
Nr kat. R0436
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynniki C0222, F0434 i R0436 są przeznaczone do stosowania w cytometrii przepływowej. W cytometrii
przepływowej przeciwciała skierowane przeciwko lekkim łańcuchom kappa mogą być wykorzystane do
wykazania obecności takich łańcuchów na powierzchni komórek, a tym samym mogą posłuŜyć — wraz
z panelem innych przeciwciał (1–4) — do identyfikacji monoklonalności (ekspansji klonalnej) w zaburzeniach
proliferacji limfocytów B. Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych
metod diagnostycznych — powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Wprowadzenie
Na powierzchni większości komórek B, z wyjątkiem prekursorów komórek B oraz progenitorów prekursorów
komórek B, a takŜe dojrzałych komórek plazmatycznych, obserwuje się ekspresję immunoglobulin. W kaŜdej
komórce ekspresję wykazują łańcuchy lekkie tylko jednego typu. Prawidłowa krew obwodowa i węzły chłonne
zawierają zarówno komórki kappa-dodatnie, jak i lambda-dodatnie, przy czym w dwóch trzecich komórek
obserwuje się ekspresję łańcuchów kappa, a w jednej trzeciej — lambda (5). PoniewaŜ nowotwory limfoidalne
są zazwyczaj wynikiem ekspansji klonalnej jednej komórki, we wszystkich komórkach złośliwych ma miejsce
ekspresja tego samego izotypu łańcucha. Sygnałem pozwalającym podejrzewać zaburzenia proliferacji
limfocytów B o charakterze nowotworowym jest często wyraźna dominacja komórek, w których zachodzi
ekspresja pojedynczego typu łańcuchów (4). Opisano rzadkie przypadki chłoniaków nieziarniczych kappaujemnych lub lambda-ujemnych (4,6).
Dostarczany odczynnik
Koniugaty przeciwciał przeciwko łańcuchom lekkim kappa, C0222, F0434 i R0436, zostały sporządzone
z wyizolowanych ze względu na powinowactwo fragmentów F(ab')2 poliklonalnych przeciwciał króliczych.
Koniugaty dostarczane są w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej (BSA) oraz
15 mmol/L NaN3, pH 7,2. NaleŜy uŜyć 10 µl produktu, aby zabarwić do 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi
obwodowej.
StęŜenie koniugatu g/L: patrz etykieta na fiolce.
Przygotowanie
Nr kat.
przeciwciała
Fluorochrom
Odczynnik Ig
nr kat.
C0222
APC (allofikocyjanina)
X0998
F0434
FITC (izomer 1 izotiocyjanianu fluoresceiny)
X0929
R0436
RPE (R-fikoerytryna)
X0930
1. Przeciwciała uŜywane do koniugacji z APC, FITC i RPE były poddawane absorpcji w fazie stałej z białkami
osocza ludzkiego w celu usunięcia śladów zanieczyszczeń przeciwciałami.
2. Absorbowane przeciwciała były następnie oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa w kolumnie
z immobilizowanymi ludzkimi lekkimi łańcuchami kappa.
3. Przeciwciała izolowane ze względu na powinowactwo były rozkładane przez pepsynę, po czym izolowano
fragment F(ab')2 metodą filtracji Ŝelowej.
4. Na koniec fragment F(ab')2 skoniugowano z allofikocyjaniną, izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny lub
R-fikoerytryną.
Immunogen
Poliklonalne immunoglobulinowe łańcuchy lekkie typu kappa izolowane z puli prawidłowej ludzkiej surowicy.
Swoistość
Przeciwciała przeciwko łańcuchom lekkim kappa reagują z niezwiązanymi łańcuchami kappa oraz z łańcuchami
kappa w nienaruszonych cząsteczkach immunoglobulin. PoniŜej opisano ustaloną swoistość przeciwciał. Aby
uzyskać maksymalną czułość, przed oczyszczaniem ze względu na powinowactwo i rozkład pepsyną
przeprowadzono test swoistości metodą immunoelektroforezy krzyŜowej.
Immunoelektroforeza krzyŜowa: W teście przeciwciała z ludzkim osoczem pojawiają się wyłącznie osady
związane z łańcuchami kappa. Barwnik: Coomassie Brilliant Blue.
Cytometria przepływowa: Gdy przeciwciała przeciwko lekkim łańcuchom kappa stosowane są do lizatu pełnej
krwi ludzkiej zgodnie z procedurą wykonania odczynu razem z przeciwciałami Anti-CD19/RPE, HD37 lub
Anti-CD19/FITC, HD37, widoczny jest odczyn swoisty części limfocytów B CD19-dodatnich odpowiadającej
oczekiwanemu poziomowi ekspresji lekkich łańcuchów kappa.
Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej analiza zawiesiny pojedynczych komórek z utrwalanych
w formalinie i zatapianych w parafinie próbek tkankowych wykazała, Ŝe przeciwciała przeciwko lekkim łańcuchom
kappa znakują reaktywne rozrostowe węzły chłonne (10/10 przypadków). W chłoniakach nieziarniczych
przeciwciała znakowały 4/10 przypadków (5). W pozostałych przypadkach uzyskano wynik dodatni testu na
obecność łańcuchów lekkich lambda (5/10 przypadków) lub nie stwierdzono ekspresji łańcuchów lekkich
(1/10 przypadków) (4).
Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej analiza limfocytów z krwi obwodowej wykazała, Ŝe przeciwciała
przeciwko łańcuchom kappa znakują proporcjonalną ilość komórek w białaczkach limfocytowych z limfocytów B.
W jednym badaniu obejmującym 121 przypadków (2) w 37 przypadkach uzyskano wynik dodatni testu ekspresji
łańcuchów kappa. W innym badaniu, obejmującym 165 przypadków (3), w 97 przypadkach uzyskano wynik kappadodatni.
Środki ostroŜności
(112023-006)
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 1/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z
ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3 Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4.W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na
opakowaniu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do
opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów,
naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W trakcie przechowywania niekiedy moŜe wytrącić się
niewielka ilość osadu, powodując drobnoziarnisty odczyn nieswoisty. Proste odfiltrowanie koniugatu
(filtr 0,22 µm z octanu celulozy) przywróci jego pierwotną wysoką jakość. Koniugatów nie naleŜy przechowywać
w postaci rozcieńczonej. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami
w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować
z naszym działem wsparcia technicznego.
Uwaga dotycząca procedury
Przed wykonaniem odczynu na próbkach krwi obwodowej naleŜy poprzez odwirowanie wyizolować komórki
jednojądrowe na medium separującym lub przepłukać próbkę krwi w celu usunięcia rozpuszczalnych białek
surowicy. PoniewaŜ ludzkie monocyty wiąŜą immunoglobuliny surowicy za pośrednictwem ich receptorów
powierzchniowych Fc, komórki takie naleŜy usunąć lub zidentyfikować.
Wykonanie odczynu
1. Pobrać krew Ŝylną do probówki zawierającej środek przeciwkrzepliwy.
2. Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwkrzepliwego do probówki.
3. Dodać 2 mL buforu PBS 0,01 mol/L, pH 7,4. Delikatnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
4. Odwirować przez 5 minut przy 300 x g, następnie odciągnąć supernatant, pozostawiając około 50 µL cieczy.
5. Powtórzyć etapy 3 i 4 jeszcze dwukrotnie.
6. Dodać 10 µL frakcji immunoglobulin króliczych (nr kat. X0903) w charakterze odczynnika blokującego.
Wymieszać delikatnie mieszadłem wibracyjnym i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze
37 °C.
7. Dodać 10 µL przeciwciał przeciwko lekkim łańcuchom kappa skoniugowanych z fluorochromem. Delikatnie
wymieszać.
8. W charakterze kontroli ujemnej uŜyć niereaktywnych fragmentów F(ab’)2 immunoglobulin króliczych,
skoniugowanych z tym samym fluorochromem (patrz tabela).
9. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
10. Dodać do probówki 1–2 mL odczynnika powodującego lizę erytrocytów i delikatnie wymieszać.
Przestrzegać czasu i temperatury inkubacji zalecanych przez producenta odczynnika.
11. Odwirować próbkę przy 300 x g przez 5 minut.
12. Zaaspirować supernatant, pozostawiając około 50 µL płynu.
13. Dodać 2 mL buforu PBS 0,01 mol/L, pH 7,4. Delikatnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
14. Powtórzyć etapy 11 i 12.
15. Zawiesić osad w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL 1-procentowego roztworu
paraformaldehydu (środka utrwalającego) w buforze PBS 0,01 mol/L, pH 7,4.
16. Poddać analizie w cytometrze przepływowym.
Zaleca się dołączenie do kaŜdego pomiaru odpowiednich dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych w celu
weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek. NaleŜy pamiętać, Ŝe koniugaty fluorochromowe są wraŜliwe na
światło, w związku z czym w trakcie wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być
chronione przed światłem.
Piśmiennictwo
1. Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and
pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95.
2. Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
3. Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4. Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of
lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional
diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7.
5. Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor.
Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-63.
6. Kaleem Z, Zehnbauer BA, White G, Zutter MM. Lack of expression of surface immunoglobulin light chains
in B-cell non-Hodgkin lymphomas. Am J Clin Pathol 2000;113:399-405.
(112023-006)
C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 2/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Objaśnienia symboli
(112023-006)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed słońcem (patrz
sekcja nt. przechowywania)
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 3/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17