COBAS® TaqMan® CT Test, v2.0

Transkrypt

DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
CTM CT v2.0
48 Tests
P/N: 05055202 190
AMPLICOR® CT/NG Specimen Preparation Kit
CT/NG PREP
100 Tests
P/N: 20759414 122
ART: 07 5941 4
US: 83315
UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji
sekwencji kwasu nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz
związanych z nią procesów w ramach diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz
z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej
licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
ZASTOSOWANIE
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, jest testem in vitro, pozwalającym na amplifikację kwasów nukleinowych,
umożliwiającym jakościową detekcję DNA Chlamydia trachomatis w próbkach wymazów z kanału szyjki macicy
kobiet lub w moczu mężczyzn i kobiet. Próbki są przygotowywane przy użyciu zestawu do ręcznego
przygotowywania próbek AMPLICOR® CT/NG oraz analizatora COBAS® TaqMan® 48, który zapewnia
automatyczną amplifikację i detekcję.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Chlamydia jest bakterią Gram-ujemną, nieruchliwą, występującą jako obligatoryjny pasożyt
wewnątrzkomórkowy komórek eukariotycznych z uwagi na niezdolność do syntezy ATP. Rodzaj Chlamydia
obejmuje cztery opisane dotychczas gatunki: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum oraz C. pneumoniae
(TWAR). C. psittaci jest zasadniczo patogenem zwierzęcym, a chorobotwórcza rola C. pecorum nie jest jasna1.
Zakażenia Chlamydia trachomatis są obecnie drugą co do częstości przyczyną schorzeń przenoszonych drogą
płciową (STD, sexually transmitted diseases) w populacji ogólnoświatowej przy zapadalności wynoszącej około
89,1 miliona przypadków rocznie2. Częstość występowania w Stanach Zjednoczonych wynosi około 2,8 miliona
przypadków rocznie3. Chlamydia trachomatis powoduje zapalenie szyjki macicy, zapalenie narządów miednicy
mniejszej (Pelvic Inflammatory Disease, PID), niemowlęce zapalenie spojówek, niemowlęce zapalenie płuc,
zapalenie cewki moczowej, zapalenie najądrza oraz zapalenie odbytu1,4. Chlamydia trachomatis jest też
najczęstszą przyczyną (około 25–55% przypadków) niegonokokowego zapalenia cewki moczowej (NGU, nongonococcal urethritis) u mężczyzn. U kobiet konsekwencje zakażenia chlamydiami są poważne w przypadku
braku leczenia. Około połowy zakażeń przebiega bezobjawowo i dlatego wiele przypadków pozostaje
nierozpoznanych i nieleczonych, co prowadzi do dodatkowych problemów, szczególnie u kobiet ciężarnych.
U dzieci urodzonych przez kobiety z zakażeniem chlamydiami występuje wysokie ryzyko rozwoju wtrętowego
zapalenia spojówek i zapalenia płuc.
Tradycyjnie referencyjną, standardową metodę oznaczania C. trachomatis stanowią testy posiewowe. Jednak
kłopoty ze standaryzacją, wysoki stopień trudności technicznej, a także konieczność utrzymania żywotności
bakterii podczas transportu i przechowywania przed wykonaniem posiewu przyczyniły się do rozwoju innych,
nieposiewowych metod oznaczania C. trachomatis5. Metody niewymagające stosowania żywych bakterii
obejmują testy amplifikacji kwasu nukleinowego (nucleic acid amplifacion test – NAAT), testy z użyciem sond
kwasu nukleinowego, testy immunoenzymatyczne (enzyme immunoassay – EIA), testy immunofluorescencji
bezpośredniej (direct fluorescent antibody – DFA) oraz testy wiązania dopełniacza1,5. Badania kliniczne
wskazują, że metody NAAT cechują się większą czułością niż metody posiewowe i inne metody nieposiewowe,
dlatego stały się preferowaną metodą klinicznej diagnostyki laboratoryjnej zakażeń C. trachomatis5.
ZASADY PROCEDURY
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, opiera się na dwóch głównych procesach: (1) ręcznej obróbce próbki w celu
uzyskania DNA CT; (2) jednoczesnej amplifikacji PCR6 docelowego DNA z użyciem swoistych dla CT
komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, znakowanych podwójnym barwnikiem
fluorescencyjnym detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umożliwiają detekcję amplifikowanego
docelowego produktu CT (amplikonu) oraz kontrolę wewnętrzną DNA CT – preparatu, który amplifikuje się
i poddaje detekcji równocześnie z próbką.
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
05230144001-02PL
1
Doc Rev. 2.0
Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów oraz sondy swoiste dla DNA plazmidu utajonego CT, DNA
chromosomalnego genu ompA oraz DNA kontroli wewnętrznej CT. Odczynnik Master Mix został przygotowany
tak, aby zapewniać detekcję wszystkich 15 serowarów CT. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy
użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla kontroli wewnętrznej, podwójnie znakowanych
sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu CT i amplikonu kontroli
wewnętrznej CT.
Przygotowanie próbki
Komórki nabłonka dróg moczowo-płciowych pobrane w trakcie wymazu lub odwirowane z moczu poddaje się
działaniu roztworu detergentu w celu uwolnienia DNA chlamydii zawartego w ciałkach siateczkowatych. Kolejny
roztwór detergentu dodaje się w celu przygotowania lizatu próbki do amplifikacji.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Oprócz chromosomalnego DNA, C. trachomatis zawiera dodatkowo plazmid utajony o wielkości około 7500 par
zasad wspólny dla wszystkich serowarów C. trachomatis7,8. W teście COBAS® TaqMan® CT, v2.0,
wykorzystano primery CP102 i CP103 do określenia sekwencji DNA o długości około 206 nukleotydów
wewnątrz plazmidu utajonego C. trachomatis. Dodatkowo w teście COBAS® TaqMan® CT, v2.0, wykorzystano
również primery CTMP101 i CTMP102 do określenia sekwencji chromosomalnego DNA C. trachomatis
o długości około 182 nukleotydów.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach K do amplifikacji (K-tube)
lub tackach K (K-tray), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana w celu
denaturacji wyizolowanego DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. W trakcie schładzania
mieszaniny primery sensowne i antysensowne w sposób swoisty hybrydyzują do jednej z nici DNA, Z05
wydłuża primer i syntetyzowana jest druga nić DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając
dwuniciowej kopii DNA docelowych regionów CT i kontroli wewnętrznej CT. Mieszanina reakcyjna jest po raz
kolejny podgrzewana w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych
primerów. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. W obecności jonów
Mn2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dNTP) polimeraza DNA Z05 wydłuża przyłączone
primery wzdłuż docelowych matryc, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA, zwaną amplikonem. Analizator
COBAS® TaqMan® 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym
z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana
w analizatorze COBAS® TaqMan® 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie plazmidu utajonego CT
i/lub w regionach ompA w obrębie chromosomalnego DNA, które znajdują się pomiędzy dwoma primerami.
Ani cały plazmid utajony CT, ani chromosom nie są amplifikowane.
Amplifikacja kontroli wewnętrznej
W wykorzystujących enzymy procesach amplifikacji, takich jak PCR, zawartość inhibitorów w próbce może
skutkować zmniejszoną wydajnością amplifikacji. Kontrola wewnętrzna CT umożliwia identyfikację poddanych
obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Kontrola wewnętrzna CT
to niezakaźny, rekombinowany plazmid DNA z identycznymi jak w sekwencji docelowej C. trachomatis
regionami wiążącymi primery, losową sekwencją wewnętrzną o podobnej długości i składzie zasad jak
sekwencja docelowa C. trachomatis oraz unikalnym regionem wiążącym sondy, odróżniającym amplikon
kontroli wewnętrznej CT od amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną
amplifikację docelowego DNA kontroli wewnętrznej CT i C. trachomatis. Odczynnik kontroli wewnętrznej CT
wchodzi w skład testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i jest wprowadzany do każdej reakcji amplifikacji w celu
równoczesnej amplifikacji z docelowym DNA z próbki. Kontrola wewnętrzna CT ma za zadanie zapewniać, że
próbki nie zawierają inhibitorów mogących zakłócać amplifikację i detekcję 20 lub więcej kopii docelowego
kwasu nukleinowego C. trachomatis, jak oszacowano przy użyciu analizy Poissona.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki w teście COBAS® TaqMan® CT, v2.0, uzyskuje
się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP).
Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę9, lecz nie
łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się
dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu
dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dNTP) w odczynniku Master
Mix. Dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość
zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Pod
wpływem działania enzymu AmpErase zniszczeniu ulegają wszelkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po
wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku
Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
2
przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym
łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą
amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego
cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego, powstałego podczas amplifikacji.
Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS® TaqMan®
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, wykorzystuje technologię PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)10,11.
Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie
rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji
fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się
z oligonukleotydów swoistych dla plazmidu utajonego CT, regionu ompA CT i kontroli wewnętrznej CT,
znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W sondach dla plazmidu utajonego CT i genu ompA
w teście COBAS® TaqMan® CT, v2.0, wykorzystano ten sam barwnik reporterowy, natomiast kontrola
wewnętrzna CT jest znakowana fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym innym niż w przypadku sond dla
plazmidu utajonego CT i genu ompA. Gdy podwójnie oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi cząsteczki sond
są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu
przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sondy ulegają hybrydyzacji z odpowiednią sekwencją
docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05
aktywności 5' do 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko
wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwników reporterowych nasila się. Amplifikacja plazmidu utajonego
CT i/lub docelowego DNA genuompA są mierzone oddzielnie i przy innej długości fali niż w przypadku DNA
kontroli wewnętrznej CT. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje
efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną
identyfikację DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT.
ODCZYNNIKI
Zestaw do przygotowywania próbek AMPLICOR® CT/NG
(P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315)
CT/NG PREP
CT/NG URINE WASH
(CT/NG bufor płuczący do próbek moczu)
100 testów
1 × 50 ml
bufor Tris-HCl
300 mM chlorek sodu
< 0,1% detergent
0,09% azydek sodu
CT/NG LYS
(CT/NG odczynnik lizujący)
1 × 25 ml
bufor Tris-HCl
< 1% substancja ułatwiająca rozpuszczalność
0,09% azydek sodu
CT/NG DIL
(CT/NG rozcieńczalnik próbki)
2 × 50 ml
bufor Tris-HCl
6 mM chlorek magnezu
< 25% detergent
0,05% azydek sodu
(P/N: 05055202 190)
CTM CT v2.0
48 testów
Odczynniki do kontroli
CT IC
(kontrola wewnętrzna CT)
3 × 0,1 ml
bufor Tris-HCl
8 kopii/μl niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego), zawierającego
sekwencje wiążące primer C. trachomatis oraz unikatowy region
wiążący sondę, równoważne około 20 kopiom IC/test
< 0,005% poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
3
CT (+) C, v2.0
[C. trachomatis kontrola (+), v2.0]
1 x 0,75 ml
bufor Tris-HCl
8,6 kopii/μl niezakaźnego plazmidu DNA (syntetycznego), zawierającego
sekwencje C. trachomatis, równoważne około 20 kopiom/test
EDTA
0,05% azydek sodu
CT (–) C, v2.0
[C. trachomatis kontrola (–), v2.0]
1 x 0,75 ml
bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydek sodu
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
CT MMX, v2.0
(COBAS® TaqMan® CT Master Mix, v2.0)
3 × 0,75 ml
bufor Tricine
wodorotlenek potasu
octan potasu
glicerol
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,001% primery sensowne i antysensowne dla plazmidu utajonego CT i genu ompA CT
< 0,001% sondy oligonukleotydowe znakowane fluorescencyjnie, swoiste dla
plazmidu utajonego CT, genu ompA CT i kontroli wewnętrznej CT
< 0,001% aptamer
< 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna)
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjny)
0,09% azydek sodu
CT Mn2+
(roztwór manganu COBAS® TaqMan® CT)
3 × 0,2 ml
< 1,0% octan manganu
Lodowaty kwas octowy
0,09% azydek sodu
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K.
L.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Używany w niniejszej ulotce termin „kopia” odnosi się do 1 kopii docelowego kwasu nukleinowego
C. trachomatis. Jedna (1) kopia jest równoważna najmniejszej ilości docelowego kwasu
nukleinowego C. trachomatis, która daje dodatni wynik testu PCR.
Test ten jest przeznaczony do użytku wyłącznie w przypadku próbek pobranych z kanału szyjki
macicy oraz próbek moczu. Test nie jest przeznaczony do stosowania w odniesieniu do próbek
pobranych z gardła, odbytnicy ani innych typów próbek.
Nie pipetować za pomocą ust.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami
i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią
ochronę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce.
Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania porcji z butelek z odczynnikami.
Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipet.
Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych zestawów.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets – MSDS) są
dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
4
M.
Praca w laboratorium musi przebiegać jednokierunkowo – należy ją rozpocząć w obszarze
przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego
(amplifikacji/detekcji). Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej
czynności poprzedzającej proces amplifikacji. Nie wolno używać ich do innych czynności ani
przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które
należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do
przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem
próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA.
Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze
poamplifikacyjnym.
N.
Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne
procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories12 oraz w CLSI Document M29-A313. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie
powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie
dejonizowanej lub destylowanej.
UWAGA: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu
5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu
sodu.
O.
W przypadku próbek transportowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest
(Remel, Inc.) waciki należy pozostawić w probówce transportowej, aby zapewnić wzrokowe
potwierdzenie inokulacji próbki. Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano ocenie przy użyciu próbek
transportowanych w transportowej probówce z wacikiem i transportowym podłożem hodowlanym M4RT®
MicroTest (Remel, Inc.). Nie oceniano próbek transportowanych na transportowym podłożu hodowlanym
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) bez wacików i nie zaleca się stosowania tego rodzaju próbek z niniejszym
testem.
P.
Przechowywanie próbek moczu w temperaturze pokojowej (15–30°C) przez ponad 24 godziny może
spowodować degradację próbki. Próbek moczu przechowywanych przez ponad 24 godziny
w temperaturze pokojowej (15–30°C) nie należy używać do testów.
Q.
Odczynniki CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT MMX, v2.0; CT Mn2+, CT IC,
CT (+) C, v2.0, i CT (–) C, v2.0, zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami
wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą
objętością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
R.
Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym korkiem, aby
zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie należy stosować probówek
z korkiem zatrzaskowym.
S.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą,
oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody.
Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania
wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
A.
Przechowywać CT/NG LYS w temperaturze 2–25°C. Przechowywać CT/NG URINE WASH
i CT/NG DIL w temperaturze 2–8°C. W przypadku powstania osadu podczas przechowywania
powyższych odczynników należy je ogrzać do temperatury pokojowej (15–30°C) i dokładnie
wymieszać przed użyciem. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności.
B.
Przechowywać CT MMX, v2.0; CT Mn2+, CT (+) C, v2.0; CT (–) C, v2.0, i CT IC w temperaturze
2–8°C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty ważności.
C.
Pomiędzy przebiegami pracy urządzenia częściowo zużyte kontrole przechowuj w temperaturze
2–8°C. Przed użyciem należy sprawdzić datę przydatności otwartych kontroli. Odczynników
CT (+) C, v2.0, i CT (–) C, v2.0, można użyć do trzech razy w celu przygotowania kontroli roboczych
CT (+), v2.0, i CT (–), v2.0.
D.
Odczynniki CT MMX, v2.0; CT Mn2+ i CT IC są dostarczane w jednorazowych fiolkach
wystarczających na serię 16 reakcji. Niezużyty materiał z fiolek należy wyrzucić.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
5
E.
Odczynnik roboczy Master Mix (przygotowywany przez dodanie CT Mn2+ i CT IC do CT MMX, v2.0)
musi być przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (15–30°C) nie dłużej niż 2 godziny
lub w temperaturze 2–8°C nie dłużej niż przez 16 godzin. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać
do odczynnika Master Mix w ciągu 2 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania
odczynnika w temperaturze pokojowej (15–30°C) lub w ciągu 16 godzin od jego przygotowania
w przypadku przechowywania odczynnika w temperaturze 2–8°C.
F.
Poddane obróbce próbki zachowują stabilność do 2 godzin w temperaturze 15–30°C i przez 7 dni
w temperaturze 2–8°C.
G.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 90 minut od chwili dodania przygotowanych próbek badanych
i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix.
DOSTARCZONE MATERIAŁY
Odczynniki do przygotowywania próbki
A.
Zestaw do przygotowywania próbek AMPLICOR® CT/NG
(P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315)
CT/NG PREP
CT/NG LYS
(CT/NG odczynnik lizujący)
CT/NG URINE WASH
(CT/NG bufor płuczący do próbek moczu)
CT/NG DIL
(CT/NG rozcieńczalnik próbki)
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
B.
(P/N: 05055202 190)
CTM CT v2.0
CT IC
(kontrola wewnętrzna CT)
CT (+) C, v2.0
[C. trachomatis kontrola (+), v2.0]
CT (–) C, v2.0
[C. trachomatis kontrola (–), v2.0]
CT MMX, v2.0
(COBAS® TaqMan® CT Master Mix, v2.0)
CT Mn2+
(roztwór manganu COBAS® TaqMan® CT)
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Przyrządy i oprogramowanie
• Analizator COBAS® TaqMan® 48
• Oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub 3.3
• Stacja robocza dla programu AMPLILINK
• Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z podręcznikiem programu
AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3.
• Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 do użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep,
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48 oraz analizatorem COBAS®
AMPLICOR®
lub
Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep,
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS®
AMPLICOR® i aparatem cobas p 630
• Urządzenie do mocowania korka w probówkach K
• Zasobnik K do analizatora COBAS® TaqMan® 48
• Zasobnik na tace K do analizatora COBAS® TaqMan® 48
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
6
Pobieranie i transport próbek
Zestaw MicroTest M4RT® BL Ref. 12620, produkowany i dystrybuowany przez firmę Remel, Inc.
Produkt dostępny jest również w systemie zamówień firmy Roche (P/N: 04863607190).
• Polipropylenowe kubeczki do pobierania próbek moczu pozbawione substancji konserwujących
Materiały jednorazowego użytku
•
•
•
Probówki K
Tacki K do analizatora COBAS® TaqMan® 48
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipeta Eppendorf® Repeater® z końcówką 1,25 ml Eppendorf Combitip® Reservoir (jałowa,
pojedynczo pakowana)
Wytrząsarka do probówek
Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: 4-000-100) bądź jej odpowiednik
Polipropylenowe probówki z zakręcanym korkiem o pojemności 2,0 ml, jałowe, niesilikonizowane,
stożkowe (Sarstedt 72.693.105 lub odpowiednik)**
Statyw na probówki (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik)
Pipetory (pojemność 50 μl, 100 μl, 200 μl, 250 μl, 500 μl i 1000 μl)* z osłoną aerozolową lub
końcówkami z dodatnim wypieraniem
Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M
lub odpowiednik
Końcówki z przedłużoną osłoną aerozolową (Matrix 7055 lub odpowiednik) do stosowania
z próbkami transportowanymi na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel,
Inc.) (zestaw M4RT® MicroTest BL)
Blok grzejny 37°C ± 2°C
Papier chłonny
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
*
Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Aby zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki
i amplikonu, należy stosować osłonę aerozolową lub końcówki dodatniego wypierania, wolne od DNazy (lub wolne od nukleazy).
**
Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia
i możliwości krzyżowego skażenia próbek i kontroli. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Jedynie dopuszczalne próbki to:
1.
Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) transportowane w czystych pojemnikach polipropylenowych. Nie
używać próbek moczu pobranych do pojemników zawierających konserwanty.
2.
Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na transportowym podłożu hodowlanym
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.).
W celu uzyskania wiarygodnych wyników testu należy przestrzegać podanych poniżej instrukcji właściwego
pobierania próbek. Test nie jest przeznaczony do stosowania z próbkami pobranymi z gardła, odbytnicy ani
próbkami innymi niż wskazane.
Aby zagwarantować dostarczenie do badań w laboratorium próbek wysokiej jakości, próbki moczu i wymazy
z kanału szyjki macicy należy przetransportować do laboratorium w praktycznie najkrótszym czasie. Nie wolno
dopuścić do transportowania próbek w warunkach uniemożliwiających kontrolę temperatury.
A.
Pobieranie próbek
Próbki moczu (mężczyzn i kobiet)
UWAGA: Pacjenci muszą powstrzymywać się od oddawania moczu przez 2 godziny poprzedzające
badanie.
1.
Pobierz 10–50 ml pierwszej porcji moczu (pierwszą część strumienia) do czystego polipropylenowego
pojemnika bez środków konserwujących.
2.
Zamknij pojemnik z próbką i oznacz odpowiednią etykietą. Postępuj zgodnie z laboratoryjną
procedurą pobierania i transportu próbek. Próbkę można transportować do miejsca badania
w temperaturze pokojowej (15–30°C).
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
7
Wymazy z kanału szyjki macicy pobrane i transportowane na podłożu M4RT® MicroTest Culture
Transport System (Remel, Inc.)
1.
Wymazy z kanału szyjki macicy mogą być pobrane i transportowane na transportowym podłożu
hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) o pojemności 3 ml. Po usunięciu śluzu szyjkowego
należy stosować zalecane metody w celu pobrania komórek nabłonka walcowatego oraz komórek
okolicy połączenia nabłonka płaskiego i walcowatego14.
2.
Do pobierania próbek używaj wyłącznie wacików pokrytych dakronem, rayonem lub alginianem
wapnia z uchwytem wykonanym z tworzywa sztucznego lub drutu innego niż aluminium. Nie używaj
wacików z drewnianą lub aluminiową rękojeścią.
3.
Pozostaw waciki w podłożu transportowym. Zamknij pojemnik z próbką i oznacz odpowiednią
etykietą. Postępuj zgodnie z laboratoryjną procedurą pobierania i transportu próbek. Próbkę można
transportować do miejsca badania w temperaturze pokojowej (15–30°C).
B.
Transport próbek
1.
Próbki moczu można transportować do miejsca wykonania testu w temperaturze 15–30°C. Próbki
moczu pozostają stabilne przez 24 godziny w temperaturze 15–30°C.
2.
Próbki moczu wymagające transportu do ośrodków wykonujących oznaczenie zlokalizowanych poza
miejscem pobrania muszą zostać przetransportowane w ciągu jednej nocy z zagwarantowanym
terminem dostawy w ciągu 24 godzin. Próbki można transportować w temperaturze 15–30°C.
W przypadku transportu próbek moczu w temperaturze 15–30°C do czasu transportu należy je
przechowywać w temperaturze 2–8°C, aby zagwarantować, że czas przechowywania
w temperaturze 15–30°C nie przekroczy 24 godzin. Próbki należy przesyłać zgodnie z odpowiednimi
przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych15.
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.)
1.
Wymazy transportować można do miejsca wykonania testu w temperaturze 15–30°C pod
warunkiem, że całkowity czas przechowywania i transportu w temperaturze 15–30°C nie przekroczy
14 dni. Jeżeli transport do laboratorium opóźnia się powyżej 14 dni od czasu pobrania próbki,
wymazy należy przechowywać w niskiej temperaturze. W przypadku próbek przeznaczonych do
posiewu należy postępować zgodnie z zaleceniami dla hodowli (-60°C, jeśli posiewu nie wykonano
w ciągu 24 godzin).
2.
Wymazy wymagające transportu do ośrodków wykonujących
miejscem pobrania można przesyłać w temperaturze
z laboratoryjnymi procedurami transportu próbek wymazów.
z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi
etiologicznych15.
C.
Przechowywanie próbek
oznaczenie zlokalizowanych poza
15–30°C po pobraniu zgodnie
Próbki należy przesyłać zgodnie
dotyczącymi transportu czynników
UWAGA: Rutynowe zamrażanie lub przedłużone przechowywanie próbek może wpływać na
skuteczność testu.
Próbki moczu, które nie zostaną poddane obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania, należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C i poddać obróbce w ciągu 7 dni od pobrania. Próbki moczu, których nie można poddać
obróbce w ciągu 7 dni od pobrania można przechowywać w temperaturze -20°C lub niższej przez okres do
30 dni.
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.)
Wymazy, które nie są badane z chwilą dostarczenia do laboratorium wykonującego oznaczenie, należy
przechowywać w temperaturze 15–30°C i poddać obróbce w ciągu 14 dni. Wymazy, które nie mogą być
poddane obróbce w ciągu 14 dni od pobrania, należy przechowywać w temperaturze -20°C lub niższej,
a następnie poddać badaniu w ciągu 30 dni od daty pobrania.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
8
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
UWAGA: Szczegółowe instrukcje obsługi, drukowania wyników i interpretacji znaczników, komentarze
i komunikaty błędów można znaleźć w Instrukcji obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48,
współpracującego z programem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3, oraz w Podręczniku
programu AMPLILINK w wersji serii 3.2, współpracującego z aparatem COBAS® AmpliPrep,
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS®
AMPLICOR®, lub w Instrukcji obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48, współpracującego
z programem AMPLILINK w wersji serii 3.3 i z programem AMPLILINK w wersji serii 3.3,
współpracującym z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® i aparatem cobas p 630.
UWAGA: Przed użyciem wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji należy ogrzać do
temperatury pokojowej (15–30°C). Należy wyjąć je z miejsca przechowywania
o temperaturze 2–8°C co najmniej 30 minut przed użyciem.
UWAGA: Próbki wymazów i moczu należy przed użyciem ogrzewać przez 15–30 minut do
temperatury pokojowej (15–30°C).
UWAGA: Tam gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową
lub dodatnim wypieraniem. Zachować najdalej posuniętą ostrożność, aby uniknąć
zanieczyszczenia.
Liczba testów w serii:
Każdy zestaw testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, zawiera odczynniki wystarczające na trzy przebiegi po
16 oznaczeń każdy, które wykonywać można oddzielnie lub równocześnie. W każdym z przebiegów testowych,
liczących do 48 próbek i kontroli, należy włączyć jedno równoległe oznaczenie kontroli CT (–) C, v2.0, oraz
CT (+) C, v2.0 (patrz rozdział „Kontrola jakości”). Odczynniki do amplifikacji i detekcji są pakowane
w 16-testowe fiolki jednorazowego użytku. Aby jak najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane
i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 16. Odczynniki do przygotowania
próbki są pakowane w 100-testowe butelki jednorazowego użytku.
Przygotowanie próbki i kontroli
A.
Przygotowanie próbek, miejsce wykonywania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar
przygotowania próbki
1.
Na każdą próbkę chorego oznacz jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem.
2.
Dodaj 500 μl CT/NG URINE WASH do każdej z oznaczonych probówek.
3.
Dokładnie wymieszaj mocz na mieszadle wibracyjnym (3–10 sekund). W przypadku stosowania
próbek zamrożonych należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej (15–30°C) przed mieszaniem
na mieszadle wibracyjnym (próbki o objętości powyżej 2 ml należy pozostawić na noc do
rozmrożenia w temperaturze 2–8°C). Kontynuuj obróbkę nawet w przypadku obecności
precypitatu. Ostrożnie zdejmij korki z pojemników z moczem. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć
skażenia rękawic moczem obecnym na korku. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed
przystąpieniem do otwarcia następnej próbki załóż czystą parę rękawic.
4.
Dodaj 500 μl każdej z dokładnie wymieszanych próbek moczu chorych do odpowiednio oznaczonej
probówki z odczynnikiem CT/NG URINE WASH. Użyj nowej końcówki z osłoną aerozolową dla
każdej próbki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
5.
Przez 15 minut inkubuj probówki w temperaturze 37°C.
6.
Odwiruj przy prędkości ≥ 12 500 x g przez 5 minut.
7.
Odlej supernatant i osusz każdą probówkę oddzielnym arkuszem bibuły absorpcyjnej.
8.
Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek, dodaj po 250 μl
odczynnika CT/NG LYS do każdej probówki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na
mieszadle wibracyjnym.
9.
Przez 15 minut inkubuj probówki w temperaturze pokojowej (15–30°C).
10.
odczynnika CT/NG DIL do każdej probówki. Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na
11.
Odwirowuj probówki przez 10 minut z prędkością ≥ 12 500 × g.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
9
12.
Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej (15–30°C) przez najwyżej
2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek K lub tacek K zawierających
odczynnik Master Mix. Jeżeli próbki nie będą przenoszone do probówek K lub tacek K w ciągu
2 godzin, przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przygotowane próbki,
przechowywane w temperaturze 2–8°C, muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni.
Próbki z wymazów
UWAGA: Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano ocenie z wykorzystaniem transportowego
podłoża hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.). Stosowanie alternatywnych
podłoży transportowych musi zostać poddane walidacji przez laboratorium.
1.
Sprawdź, czy probówka z transportowym podłożem hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel,
Inc.) zawiera wacik. Waciki należy pozostawić w probówce z transportowym podłożem hodowlanym
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.), aby uniknąć narażenia próbki na niewłaściwe warunki. Obecność
wacika w probówce z transportowym podłożem hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) nie
gwarantuje prawidłowego pobrania próbki.
2.
Na każdą próbkę chorego oznacz jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem. Nie
należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
3.
Dodaj 100 μl odczynnika CT/NG LYS do oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml.
4.
Wymieszaj próbki na mieszadle wibracyjnym. Jeśli próbki były przechowywane w stanie
zamrożonym, rozmroź je w temperaturze pokojowej (15–30°C) przed mieszaniem na mieszadle
wibracyjnym. Ostrożnie zdejmij korki z probówek z próbkami. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć
skażenia rękawic. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed przystąpieniem do otwarcia
następnej próbki załóż czystą parę rękawic.
5.
Przy użyciu pipetora z osłoną aerozolową dodaj 100 μl dobrze wymieszanej próbki do odpowiedniej
probówki zawierającej CT/NG LYS. Użyj nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki.
Ponownie zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
6.
7.
odczynnika CT/NG DIL do każdej probówki. Ponownie zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj na
8.
9.
Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej (15–30°C) przez najwyżej
2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek K lub tacek K zawierających
odczynnik roboczy Master Mix. Jeżeli próbki nie będą przenoszone do probówek K lub tacek K
w ciągu 2 godzin, przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przygotowane
próbki, przechowywane w temperaturze 2–8°C, muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni.
B.
Przygotowanie kontroli, miejsce wykonywania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar
przygotowania próbki
UWAGA: Przygotowuj świeże kontrole robocze (Working Controls) każdego dnia, w którym
wykonywane są testy. Kontroli roboczych można używać do przygotowania wielu kontroli
obrobionych (Processed Controls) w ciągu dnia, lecz należy je wyrzucić pod koniec dnia.
UWAGA: Odczynniki CT (+) C, v2.0, i CT (–) C, v2.0, dołączone do zestawu testu COBAS® TaqMan®
CT, v2.0, są przeznaczone do maksymalnie trzykrotnego przygotowania kontroli
roboczych CT (+), v2.0, i CT (–), v2.0.
UWAGA: W przypadku badania zarówno wymazów, jak i próbek moczu konieczne jest
przygotowanie jednego zestawu kontroli dla każdego typu próbek.
Kontrole robocze: Przygotuj następujące kontrole robocze CT (+), v2.0, i CT (–), v2.0.
1.
2.
3.
Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 1 ml CT/NG DIL do każdej z dwóch 2-mililitrowych
polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem „Kontrola robocza
CT (+), v2.0”, a drugą „Kontrola robocza CT (–), v2.0”.
Przez 5 sekund mieszaj CT (+) C, v2.0, oraz CT (–) C, v2.0, na mieszadle wibracyjnym
z maksymalną prędkością. Ostrożnie zdejmij korki z probówek. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć
skażenia rękawic. W przypadku zanieczyszczenia rękawic przed kontynuacją pracy załóż czystą
parę rękawic.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 100 μl CT (+) C, v2.0, do probówki
oznaczonej jako „Kontrola robocza CT (+), v2.0”. Zamknij i przechowuj probówkę CT (+) C, v2.0,
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
10
4.
5.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 100 μl CT (–) C, v2.0, do probówki
oznaczonej jako „Kontrola robocza CT (–), v2.0”. Zamknij i przechowuj probówkę CT (–) C, v2.0,
Zamknij probówki kontroli roboczych i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przechowuj
w temperaturze pokojowej (15–30°C) i wyrzuć pod koniec dnia pracy.
Próbki moczu: Przygotuj następujące, poddawane obróbce kontrole: CT (+), v2.0, i CT (–), v2.0.
1.
2.
3.
4.
Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 250 μl CT/NG LYS do każdej z dwóch 2-mililitrowych
polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem „Przygotowana kontrola
robocza CT (+), v2.0”, a drugą „Przygotowana kontrola robocza CT (–), v2.0”.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 250 μl kontroli roboczej CT (+), v2.0,
do probówki oznaczonej „Przygotowana kontrola robocza CT (+), v2.0”.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 250 μl kontroli roboczej CT (–), v2.0,
do probówki oznaczonej „Przygotowana kontrola robocza CT (–), v2.0”.
Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przez 10 minut
inkubuj w temperaturze pokojowej (15–30°C). Przechowuj w temperaturze pokojowej (15–30°C)
i wyrzuć pod koniec dnia pracy.
Próbki z wymazów: Przygotuj następujące, poddawane obróbce kontrole: CT (+), v2.0, i CT (–), v2.0.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 100 μl CT/NG LYS do każdej z dwóch 2-mililitrowych
polipropylenowych probówek z zakrętką. Oznacz jedną probówkę napisem „Przygotowana kontrola
robocza CT (+), v2.0”, a drugą „Przygotowana kontrola robocza CT (–), v2.0”.
Używając pipetora z jałową końcówką, dodaj 100 μl transportowego podłoża hodowlanego M4RT®
MicroTest (Remel, Inc.) do każdej z probówek zawierających CT/NG LYS.
Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 200 μl kontroli roboczej CT (+), v2.0,
do probówki oznaczonej „Przygotowana kontrola robocza CT (+), v2.0”.
Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodaj 200 μl kontroli roboczej CT (–), v2.0,
do probówki oznaczonej „Przygotowana kontrola robocza CT (–), v2.0”.
Ponownie zamknij probówki i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym. Przez 10 minut
inkubuj w temperaturze pokojowej (15–30°C). Przechowuj w temperaturze pokojowej (15–30°C)
i wyrzuć pod koniec dnia pracy.
Amplifikacja i detekcja
UWAGA: Zasobniki na probówki K oraz uchwyt zasobnika należy przetrzeć tkaniną nieuwalniającą
włókien, zwilżoną 70% roztworem izopropanolu.
A.
Przygotowanie odczynnika
UWAGA: Główny rozcieńczalnik COBAS® TaqMan® CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), roboczy
główny rozcieńczalnik (Working MMX) oraz roboczy główny rozcieńczalnik z dodaną
próbką lub kontrolą są wrażliwe na światło. Chronić wymienione odczynniki przed
światłem.
UWAGA: Przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix odczynnik COBAS® TaqMan®
CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0); roztwór manganu COBAS® TaqMan® CT (CT Mn2+)
oraz kontrolę wewnętrzną COBAS® TaqMan® CT (CT IC) należy pozostawić do ogrzania
w temperaturze pokojowej (15–30°C) przez co najmniej 30 minut.
UWAGA: Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek i kontroli.
UWAGA: Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 2 godzin od jego przygotowania
w przypadku przechowywania go w temperaturze pokojowej (15–30°C) lub w ciągu
16 godzin od jego przygotowania w przypadku przechowywania w temperaturze 2–8°C.
UWAGA: Po dodaniu obrabianych próbek i kontroli do roboczego odczynnika MMX amplifikacja
powinna rozpocząć się w ciągu 90 minut.
1.
Pozostaw jedną fiolkę CT MMX, v2.0, jedną fiolkę CT IC oraz jedną fiolkę CT Mn2+ do ogrzania
w temperaturze pokojowej (15–30°C) przez co najmniej 30 minut.
2.
Umieść zasobnik na probówki K w uchwycie zasobnika. Włóż nowe probówki K lub nowe tace K
do zasobnika K, nie dotykając bocznych ścianek probówek ani dołków tac.
UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić
probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie
zasobnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
11
3.
Jeśli jest taka potrzeba, zdejmij korki z probówek K za pomocą urządzenia do mocowania korków.
Umieść korki w podręcznym uchwycie na probówki K.
4.
Przygotuj roboczy odczynnik MMX w następujący sposób:
Aby przygotować 16 testów, dodaj do jednej fiolki CT MMX, v2.0, 150 μl CT Mn2+ oraz 50 μl CT IC.
Zamknij buteleczkę i dokładnie wymieszaj zawartość, odwracając 10 razy. Nie wytrząsaj
roboczego odczynnika MMX na mieszadle wibracyjnym. Odczynnik roboczy MMX należy chronić
przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin (w przypadku przechowywania w temperaturze pokojowej
(15–30°C)) lub w ciągu 16 godzin (w przypadku przechowywania w temperaturze 2–8°C).
5.
Przenieś pipetą 50 μl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K lub do studzienki tacki K.
UWAGA: Jeżeli poddane obróbce próbki przed amplifikacją przechowywano zamrożone, należy je
rozmrozić w temperaturze pokojowej (15–30°C) i dobrze wymieszać na mieszadle wibracyjnym.
Odwiruj przygotowane próbki moczu przez 10 minut przy prędkości ≥ 12 500 × g.
UWAGA: Podczas dozowania odczynnika roboczego MMX nie wolno dotykać końcówką pipety
żadnej powierzchni innej niż zamierzona probówka K lub studzienka tacki K. Jeżeli
dojdzie do zetknięcia z powierzchnią zasobnika na tackę K, końcówkę należy wyrzucić,
aby uniknąć wprowadzenia inhibitorów PCR.
6.
Dodaj po 50 μl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K lub
studzienek tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu mikropipetor
z końcówką z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie wymieszaj każdą próbkę
i próbę kontrolną, trzy razy nabierając do mikropipetora i wypuszczając ponownie, nie
doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków.
UWAGA: Podczas dozowania poddanych obróbce próbek badanych i próbek kontrolnych nie wolno
dotykać końcówką pipety żadnej powierzchni innej niż zamierzona probówka K lub
tacka K. Jeżeli dojdzie do zetknięcia z powierzchnią zasobnika na tackę K, końcówkę
należy wyrzucić, aby uniknąć wprowadzenia inhibitorów PCR.
7.
Powtórz czynności z etapu 6 w odniesieniu do każdej próbki i poddawanej obróbce kontroli aż do
przeniesienia każdej z nich do probówki K lub tacki K. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyj
nowej końcówki. Sprawdź wzrokowo probówki w poszukiwaniu pęcherzyków i usuń je w razie
konieczności. Przykryj tackę K lub zamknij probówki K, używając urządzenia do mocowania korków.
Sprawdź wzrokowo, czy dodano odpowiednie objętości próbek.
8.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 90 minut od czasu dodania przygotowanych próbek badanych
i kontrolnych do probówek K lub studzienek tacki K zawierających roboczy odczynnik MMX.
9.
Na wypadek konieczności ponownego wykonania testu pozostałości każdej z przygotowanych
próbek przechowuj w temperaturze 2–8°C. Wszelkie ponowne testy należy wykonać w ciągu 7 dni
od przygotowania próbek.
B.
Ładowanie i obsługa analizatora COBAS® TaqMan® 48
1.
Włącz komputer na stanowisku roboczym i zaloguj się do systemu Windows XP, używając
odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła.
2.
Włącz analizator COBAS® TaqMan® 48. Upewnij się, że urządzenie uruchamia się i jest gotowe do
użytku. Jeśli nośniki K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się nadal w którymkolwiek
z termocyklerów, wyjmij je za pomocą przenośnika.
3.
Uruchom na komputerze program AMPLILINK. Zaloguj się, używając odpowiedniej nazwy
użytkownika i hasła.
4.
Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w zasobniku na probówki K, kliknij
ikonę z napisem Orders. Wybierz zakładkę z napisem Sample, następnie kliknij przycisk z napisem
New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadź numer porządkowy każdej
próbki. Wybierz plik z definicją testu dla testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0. Czynność powtórz dla
każdej próbki. Kliknij przycisk Save.
UWAGA: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić
probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie
zasobnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne.
5.
Wprowadź dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie Orders.
Kliknij przycisk New i przy użyciu klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadź dołączone do
zestawu dane dla testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0. W odpowiednich oknach wpisz numer serii testu
COBAS® TaqMan® CT, v2.0, datę przydatności do użycia, zakresy wartości kontroli Low (+) oraz
współczynniki kalibracji. Kliknij przycisk OK.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
12
6.
Przypisz numer zasobnika na probówki K do przebiegu testu, klikając zakładkę K-Carrier w oknie
Orders. W oknie K-Carrier kliknij przycisk New. W okienku na prawo od napisu „K-Carrier ID”
wprowadź numer zasobnika zamieszczony na jego kodzie kreskowym, używając klawiatury lub
czytnika kodów kreskowych. Wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu
testowego, dokonanego przy wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym (ID) zasobnika
na probówki K. Po dwukrotnym użyciu na jednym analizatorze tego samego kodu kreskowego
zasobnika wyniki uzyskane przy użyciu obu serii testów należy zaakceptować, zarchiwizować
i usunąć, zanim będzie można ponownie wykorzystać ten sam kod kreskowy. Z panelu testowego
w dolnej części okna wybierz opcję Test Definition, aby wykonać test COBAS® TaqMan® CT, v2.0.
7.
Na liście roboczej Worklist wybierz pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Zaznacz to pole w celu
uzyskania dostępu do menu rozwijanego i wybierz wymagany typ kontroli. Następnie dwukrotnie
kliknij pole z numerem identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli się okno LookUp
Control ze wszystkimi dostępnymi próbami kontrolnymi. Po wybraniu kontroli w dolnej części po
prawej stronie panelu Information wyświetlą się odpowiednie wartości kalibracji i kontrolne. Powtórz
opisaną procedurę w odniesieniu do wszystkich wymaganych kontroli.
8.
W celu wprowadzenia próbek na listę roboczą Worklist dwukrotnie kliknij pierwszą pozycję (wiersz)
okna informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample, zawierającego
numerację przypisaną danej próbce. W celu zaznaczenia więcej niż jednego numeru porządkowego
użyj klawiszy Shift + strzałek. Upewnij się, że opcji Test Definition zostały przypisane wszystkie
polecenia, aby móc wykonać test COBAS® TaqMan® CT, v2.0.
9.
Kliknij przycisk Save, aby zapisać zlecenie dla danego zasobnika probówek K.
C.
Amplifikacja i detekcja
1.
Wybierz ikonę Systems w zakładce System; kliknij przycisk Open, aby otworzyć termocykler. Gdy
w oknie Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie uchylona i widoczny jest napis „Ready to
Load”, przyciągnij i przytrzymaj pokrywę termocyklera w celu otwarcia urządzenia. Za pomocą
przenośnika zasobników na probówki K umieść w termocyklerze załadowany zasobnik zawierający
zamknięte probówki K lub tackę K z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami.
Zamknij pokrywę termocyklera.
2.
Kliknij przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony TC w celu zamknięcia pokrywy termocyklera
i uruchomienia aparatu.
3.
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję.
WYNIKI (programu AMPLILINK w wersji serii 3.2)
Obliczanie wyników
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie określa, czy w próbce lub kontroli wykryto DNA CT.
Analizator COBAS® TaqMan® 48:
•
Określa wartość progową liczby cykli (Ct) dla DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT.
•
Określa, czy wykryto obecność DNA CT na podstawie wartości Ct dla DNA CT oraz DNA kontroli
wewnętrznej CT.
Walidacja przebiegu testowego w programie AMPLILINK w wersji serii 3.2
Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK v3.2 lub wydruk w poszukiwaniu znaczników i komentarzy
świadczących o tym, że dany przebieg testowy jest ważny.
Seria testowa jest ważna, jeśli żadna z kontroli testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 nie została
opatrzona znacznikiem błędu. W następstwie ważnego przebiegu testowego uzyskuje się
następujące wyniki:
Kontrola
Wynik
Interpretacja
Kontrola ujemna
Target Not Detected
Wynik kontroli w zakresie
Kontrola dodatnia
1 Positive
Przebieg jest nieważny, jeżeli kontrole testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 są opatrzone którymkolwiek
z poniższych znaczników:
Kontrola ujemna CT, v2.0:
Oznaczenie
Wynik
Interpretacja
_N_NC_INVALID
Invalid
Kontaminacja lub brak sygnału
dla IC.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
13
Kontrola dodatnia CT, v2.0:
Oznaczenie
Wynik
_L_LPC_INVALID
Invalid
Interpretacja
Wynik kontroli poza zakresem,
brak sygnału materiału docelowego
lub sygnału IC.
Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy powtórzyć go w całości, wraz z przygotowaniem próbek
i kontrolą, amplifikacją oraz detekcją.
Interpretacja wyników:
Aby ocenić ważność przebiegu, należy sprawdzić na wydruku wyniki dla poszczególnych próbek
w poszukiwaniu oznaczeń lub komentarzy. Wyniki należy interpretować następująco:
•
Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie od tego, jakimi
znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone.
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Oznaczenie
Wynik
Interpretacja
Brak oznaczenia Target Not Detected
Nie wykryto DNA C. trachomatis. Wynik badania próbki
w kierunku C. trachomatis jest prawdopodobnie ujemny. Wynik
ujemny nie wyklucza zakażenia C. trachomatis, gdyż wyniki
zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, braku
inhibitorów, oraz obecności DNA wystarczającej do detekcji.
Brak oznaczenia
1 Positive
lub
> 1 Positive
Wykryto DNA C. trachomatis. Próbka jest dodatnia dla
C. trachomatis.
_Q_RFITOOLOW
> 1 Positive
C. trachomatis.
_Q_QS_INVALID
Invalid
Próbka zawierająca inhibitory. DNA C. trachomatis, jeśli jest
obecny, nie będzie wykrywalny. Przygotuj jeszcze jedną
próbkę z oryginalnie pobranego materiału i powtórz test.
Inhibitory często są niestabilne, stąd próbki początkowo
zawierające inhibitor mogą nie wykazywać cech zahamowania
przy powtórzeniu testu. Jeżeli oryginalna próbka nie jest
dostępna, należy pobrać nową.
WYNIKI (programu AMPLILINK w wersji serii 3.3)
Obliczanie wyników
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie określa, czy w próbce lub kontroli wykryto DNA CT. Wraz
z wprowadzeniem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 pojawiła się jego nowa opcja dla jakościowego
wyniku testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0. W programie AMPLILINK w wersji serii 3.2 wynik jest przedstawiany
w inny sposób niż w programie AMPLILINK w wersji serii 3.3.
Analizator COBAS® TaqMan® 48:
• Określa wartość progową liczby cykli (Ct) dla DNA CT oraz DNA kontroli wewnętrznej CT.
• Określa, czy wykryto obecność DNA CT na podstawie wartości Ct dla DNA CT oraz DNA kontroli
wewnętrznej CT.
Walidacja przebiegu testowego w programie AMPLILINK w wersji serii 3.3
Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK v3.3 lub wydruk w poszukiwaniu znaczników i komentarzy
świadczących o tym, że dany przebieg testowy jest ważny.
Przebieg testowy jest ważny, jeżeli kontrole testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 nie są opatrzone
znacznikami. Poniższe wyniki uzyskano dla ważnego przebiegu testowego.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
14
Kontrola
Wynik
Interpretacja
Kontrola ujemna
NC Negative
Kontrola dodatnia
PC Positive
Przebieg jest nieważny, jeżeli kontrole testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 są opatrzone którymkolwiek
z poniższych znaczników:
Kontrola ujemna CT, v2.0:
Znacznik
Wynik
Interpretacja
NC_INVALID
Invalid
Kontrola dodatnia, brak sygnału
kontroli wewnętrznej lub sygnał
poza zakresem.
Kontrola dodatnia CT, v2.0:
Znacznik
Wynik
PC_INVALID
Invalid
Interpretacja
Kontrola ujemna lub poza zakresem,
brak sygnału kontroli wewnętrznej
lub sygnał poza zakresem.
Jeśli przebieg testowy jest nieważny, należy powtórzyć go w całości, wraz z przygotowaniem próbek i kontrolą,
amplifikacją oraz detekcją.
Interpretacja wyników:
Aby ocenić ważność przebiegu, należy sprawdzić na wydruku wyniki dla poszczególnych próbek
w poszukiwaniu znaczników lub komentarzy. Wyniki należy zinterpretować następująco:
UWAGA: Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie od tego, jakimi
znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone.
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Znacznik
Wynik
Interpretacja
Nie wykryto DNA C. trachomatis. Wynik badania próbki
w kierunku C. trachomatis jest prawdopodobnie ujemny. Wynik
ujemny nie wyklucza zakażenia C. trachomatis, gdyż wyniki
zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, braku
inhibitorów oraz obecności DNA w ilości wystarczającej do
detekcji.
Brak znacznika
CT Not Detected
Brak znacznika
CT Detected
CNTRL_FAIL
INVALID
Kontrola(e) nieważna(e). Przygotować inną próbkę
oryginalnie pobranego materiału i powtórzyć przebieg testowy.
S_INVALID
Invalid
Próbka zawierająca inhibitory. DNA C. trachomatis, jeśli jest
obecny, nie został wykryty. Przygotować jeszcze jedną próbkę
z oryginalnie pobranego materiału i powtórzyć test. Jeżeli
oryginalna próbka nie jest dostępna, należy pobrać nową.
C. trachomatis.
KONTROLA JAKOŚCI
Każdy przebieg testowy musi zawierać po jednej próbce kontroli (–) COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i kontroli (+)
COBAS® TaqMan® CT, v2.0. Tak jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy operator
powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych kontroli za każdym razem, kiedy przeprowadzany jest test,
do czasu osiągnięcia dużego stopnia zaufania dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Nie ma
wymagań co do położenia kontroli w zasobniku na probówki K. Należy sprawdzić, czy na wydruku
przebiegu znajdują się oznaczenia i komentarze, aby upewnić się, że jest on ważny.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
15
Kontrola ujemna
Kontrola CT (–) C, v2.0 musi dawać wynik „Target Not Detected” w programie AMPLILINK w wersji serii 3.2
lub wynik „NC Negative” w programie AMPLILINK w wersji serii 3.3. W przeciwnym razie cały przebieg testu
jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli
wyniki kontroli CT (–) C, v2.0 nadal są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche
w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrola dodatnia
Kontrola CT (+) C, v2.0 musi dawać wynik „1 Positive” w programie AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub wynik
„PC Positive” w programie AMPLILINK w wersji serii 3.3. W przeciwnym razie cały przebieg testu jest
nieważny. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki
kontroli CT (+) C, v2.0 znajdują się nadal poza przypisanym zakresem, należy skontaktować się z miejscowym
biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrola CT (+), v2.0, zawiera około 20 kopii/test sekwencji plazmidowego DNA C. trachomatis. Jest to blisko
czterokrotnie większa ilość niż minimalny poziom detekcji dla stosowanego testu, który określono za pomocą
analizy Poissona. Amplifikacja i detekcja kontroli CT (+), v2.0, potwierdza dokonanie procesu amplifikacji.
Kontrola CT (+), v2.0, nie monitoruje wydajności amplifikacji ani poziomu detekcji stosowanego testu.
Kontrola wewnętrzna
Kontrola wewnętrzna ma za zadanie identyfikować próbki zawierające inhibitory polimerazy. Stosowanie kontroli
wewnętrznej nie eliminuje całkowicie występowania wyników fałszywie ujemnych.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie
ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu
należy zachować wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do
amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane
odczynniki.
OGRANICZENIA METODY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Do badań należy używać tylko określonych rodzajów próbek. Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano
ocenie z użyciem próbek wymazów z kanału szyjki macicy, pobranych na transportowe podłoże
hodowlane M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) oraz próbek moczu kobiet i mężczyzn, który pobrano bez
zastosowania środków konserwujących. Nie oceniano stosowania testu w przypadku innych rodzajów
próbek, a ich użycie może powodować wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
Detekcja C. trachomatis jest zależna od liczby mikroorganizmów obecnych w próbce. Wpływ na nią
mogą mieć metody pobrania próbek, czynniki zależne od pacjenta (tj. wiek, wywiad w kierunku chorób
przenoszonych drogą płciową, obecność objawów), stadium zakażenia i/lub szczep wywołującej
zakażenie C. trachomatis.
Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Test COBAS®
TaqMan® CT, v2.0, uzupełniono o kontrolę wewnętrzną CT, aby umożliwić identyfikację poddanych
obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR w stopniu większym
niż 20 kopii/test.
Częstość występowania zakażenia chlamydiami w populacji może wpływać na skuteczność testu.
Dodatnie wartości predykcyjne ulegają zmniejszeniu przy badaniu populacji z niską częstością
zachorowań lub osób, u których nie występuje ryzyko zakażenia. Ponieważ częstość występowania
C. trachomatis w niektórych populacjach lub grupach pacjentów może być niewielka, odsetek wyników
fałszywie dodatnich, wynoszący 4–5%, może przekraczać odsetek wyników rzeczywiście dodatnich, co
sprawia, że wartość predykcyjna dodatniego wyniku badania jest bardzo mała. Niektórzy pacjenci
rzeczywiście zakażeni nie zostaną zidentyfikowani na podstawie oznaczenia pojedynczej próbki, dlatego
też nie można określić ani domniemać na podstawie danych klinicznych odsetka wyników fałszywie
dodatnich. Odsetek wyników fałszywie dodatnich może zależeć od przeszkolenia personelu,
umiejętności laboranta, obchodzenia się z odczynnikami i próbkami oraz innych podobnych czynników,
występujących w danym laboratorium.
Wiarygodność wyników zależy od sposobu pobrania, transportu, przechowywania i przygotowania
próbek. Nie zdefiniowano w pełni czynników wynikających z przechowywania próbek.
Dodanie do Master Mixu enzymu AmpErase umożliwia selektywną amplifikację docelowego DNA;
jednak aby uniknąć skażenia odczynników, konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej
i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji.
Niniejszego testu nie wolno używać do oceny skuteczności leczenia lub jej braku.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
16
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, należy interpretować, biorąc pod uwagę wszystkie dostępne wyniki badania klinicznego i badań laboratoryjnych.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
Odpowiedniość próbek (w przypadku wymazów) potwierdzić można tylko na drodze wizualizacji pod
mikroskopem komórek nabłonka walcowatego w próbkach.
Nie zaleca się stosowania testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, do oceny podejrzenia nadużyć
seksualnych ani w innych wskazaniach sądowo-lekarskich.
W każdym przypadku gdy wynik fałszywie dodatni lub fałszywie ujemny może prowadzić do
niekorzystnych następstw medycznych, socjalnych lub psychologicznych, zaleca się wykonanie
dodatkowych badań.
Wyniki testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, mają charakter jakościowy. Nie stwierdzono korelacji
między wielkością piku wyniku dodatniego testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, a liczbą komórek
C. trachomatis w zakażonej próbce. Niniejszy test wykrywa wyłącznie C. trachomatis, nie wykrywa
natomiast C. psittaci, C. pneumoniae ani C. pecorum.
Zaleca się wykonywanie oznaczeń próbek moczu mężczyzn i kobiet w teście COBAS® TaqMan® CT,
v2.0, przy użyciu losowo pobranych próbek pierwszej porcji moczu (określanej jako pierwsze
10–50 ml strumienia moczu). Nie oceniano wpływu innych zmiennych, takich jak pierwsza porcja
moczu w porównaniu ze środkową, próbki pobrane po kąpieli itd.
Nie oceniano również wpływu innych potencjalnych zmiennych, takich jak upławy, stosowanie
tamponów, irygacje itd., ani zmiennych związanych z pobieraniem wymazu.
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, nie zastępuje badania szyjki macicy ani pobierania próbek
z kanału szyjki macicy w diagnostyce zakażeń moczowo-płciowych. Występujące u chorych
zapalenie szyjki macicy, zapalenie cewki moczowej, zakażenia dróg moczowych lub pochwy może
mieć inne przyczyny lub może być wywoływane przez równoczesne zakażenie innymi patogenami.
Niniejszego produktu można używać tylko łącznie z analizatorem COBAS® TaqMan® 48.
Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub
nieważnych.
Poniżej zamieszczono listę niektórych substancji wpływających na wynik testu.
• Obecność śluzu w próbkach pobranych z szyjki macicy może hamować PCR i prowadzić do
fałszywie ujemnych wyników testu. Aby zapewnić optymalną skuteczność testu, zaleca się
stosowanie próbek wolnych od śluzu. Przed pobraniem próbki należy użyć gąbki lub dużego
gazika, aby usunąć wydzielinę szyjki macicy i upławy16.
• Próbki zawierające powyżej 7% (v/v) krwi mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie.
Mutacje w obrębie wysoce konserwatywnych regionów DNA plazmidu utajonego lub
chromosomalnego DNA C. trachomatis, z którymi łączą się primery i/lub sonda używane w teście,
choć rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności bakterii w tym przypadku.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod
użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia
jakościowych różnic występujących pomiędzy nimi.
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Swoistość analityczna:
Swoistość testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano ocenie, dodając DNA komórek z hodowli, hodowli
wirusowych lub plazmidowych konstruktów do odczynników do przygotowania próbek CT/NG. Próbki następnie
testowano za pomocą procedury testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0. Badano mikroorganizmy izolowane z dróg
moczowych. W przypadku żadnego spośród poniższych drobnoustrojów czy wirusów nie stwierdzono dodatniego
wyniku badania przy użyciu testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0:
Achromobacter xerosis
Acinetobacter Iwoffi
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter sp. genospecies 3
Actinomyces isrealii
Aerococcus viridans
Aeromonas hydrophila
Agrobacterium radiobacter
Alcaligenes faecalis
Bacillus thuringiensis
Lactobacillus acidophillus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus crisptus
Lactobacillus lactis lactis
Lactobacillus oris
Lactobacillus parabuchnerri
Lactobacillus vaginalis
Lactococcus lactis cremoris
Legionella bozemanii
Legionella pneumophila
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
17
Bacillus subtilis
Bacteriodes fragilis
Bacteriodes caccae
Bifidobacillus longum
Bifidobacterium adolescentis
Branhamella catarrhalis
Brevibacterium linens
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia pneumoniae
Chromobacter violaceum
Citrobacter freundii
Clostridium innocuum
Clostridium perfringens
Corynebacterium genitalium
Corynebacterium xerosis
Cryptococcus neoformans
Deinococcus radiopugnans
Derxia gummosa
Wirus Epstein-Barr
Eikenella corrodens
Enterobacter cloacae
Enterococcus avium
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Erysipelothrix rhusiopathiae
Escherichia coli
Ewingella americana
Flavobacterium meningosepticum
Gardnerella vaginalis
Gemella haemolysans
Gemella morbillorum
Haemophilus influenzae
Haemophilus ducreyi
Wirus Herpes simplex 1
Wirus Herpes simplex 2
Ludzki wirus brodawczaka typu 16
Ludzki wirus brodawczaka typu 18
Kingella kingae
Klebsiella pneumoniae ss ozaenae
Leuconostoc paramesenteroides
Micrococcus luteus
Moraxella osloensis
Morganella morganii
Mycobacterium smegmatis
Mycoplasma hominis
Neisseria elongata
Neisseria gonorrhoea
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria polysaccharea
Pasteurella maltocida
Pediococcus acidilactica
Peptostreptococcus magnus
Peptostreptococcus productus
Prevotella bivia
Prevotella corporis
Prevotella intermedia
Propionibacterium acnes
Proteus mirabilis
Providencia stuartii
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas putida
Rahnella aquatilis
Salmonella minnesota
Salmonella typhimurium
Serratia denitrificans
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus anginosus
Streptococcus bovis
Streptococcus dysgalatia
Streptococcus equinis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus salivarius
Treponema pallidum
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
Czułość analityczna: Oczyszczone DNA
W przypadku określania czułości analitycznej oczyszczonego DNA test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, cechuje
się możliwością detekcji w sposób powtarzalny (≥ 95% wyników dodatnich) 5 lub więcej kopii oczyszczonego
DNA C. trachomatis na reakcję PCR. Liczbę wykorzystanych w tym eksperymencie kopii DNA C. trachomatis
oszacowano za pomocą analizy Poissona.
Granica wykrywalności: Komórki C. trachomatis nienależące do odmian
Granicę wykrywalności testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 określono przez analizę rozcieńczeń komórek
C. trachomatis hodowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) oraz
w prawidłowym ludzkim moczu. Analizowano sześć członów paneli dla każdego typu matrycy. Ogółem
przeprowadzono 144 równoległe oznaczenia na stężenie dla każdego typu matrycy. Wartości graniczne dla
wyników ujemnych przeanalizowano przy liczbie powtórzeń wynoszącej 72.
Wyniki tego badania, przedstawione w tabeli 1, wskazują, że za pomocą analizy probitowej test COBAS®
TaqMan® CT, v2.0 umożliwiał wykrycie C. trachomatis w spodziewanych stężeniach 2,1 IFU/ml w przypadku
transportowego podłoża hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) i 1,2 IFU/ml w przypadku moczu. Ze
względu na zmienność liczby ciał wtrętowych w hodowli C. trachomatis liczba żywych bakterii C. trachomatis
nie jest bezpośrednio związana z ilością nadającego się do amplifikacji docelowego materiału CT.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
18
Tabela 1
Granica wykrywalności testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, dla komórek C. trachomatis
nienależących do odmian
Matryca
Stężenie
panelu
(IFU/ml)
Stężenie
panelu
(IFU/PCR)
Średnia
piku CT
Średnia
piku IC
Całkowita
liczba N
wyników
ważnych
Trafienia
dodatnie
%
dodatnich
M4RT
8
0,1
37,7
36,3
144
144
100,0
M4RT
4
0,05
38,8
36,3
144
144
100,0
M4RT
2
0,025
40,2
36,2
144
132
91,7
M4RT
1
0,012
40,7
36,2
144
116
80,6
M4RT
0,5
0,006
40,9
36,2
144
73
50,7
M4RT
0
0
brak danych
36,2
72
0
0,0
95% wartość probitowa: 2,1 IFU/ml
95% przedział ufności: 1,8–2,7
Średnia
piku IC
Całkowita
liczba N
wyników
ważnych
Trafienia
dodatnie
%
dodatnich
34,6
36,1
144
144
100,0
0,2
37,8
36,2
144
143
99,3
2
0,1
38,6
36,1
144
144
100,0
Mocz
0,5
0,025
40,3
35,9
143
110
76,9
Mocz
0,25
0,0125
41,4
36,0
144
87
60,4
Mocz
0
0
brak danych
35,8
72
0
0,0
Matryca
Stężenie
panelu
(IFU/ml)
Stężenie
panelu
(IFU/PCR)
Średnia
piku CT
Mocz
20
1
Mocz
4
Mocz
95% wartość probitowa: 1,2 IFU/ml
95% przedział ufności: 0,9–1,7
Granica wykrywalności: Komórki C. trachomatis nvCT (odmiana szwedzka)
Granicę wykrywalności testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0 określono przez analizę rozcieńczeń komórek
C. trachomatis nvCT hodowanych na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) oraz
w prawidłowym ludzkim moczu. Analizowano sześć poziomów paneli dla każdego typu matrycy. Ogółem
przeprowadzono 144 równoległe oznaczenia na stężenie dla każdego typu matrycy. Wartości graniczne dla
wyników ujemnych przeanalizowano przy liczbie powtórzeń wynoszącej 72. Zastosowano 7–10-krotny wskaźnik
korekcji w celu dostosowania końcowego wyniku analizy probitowej dla skompensowania różnic w kopiach
docelowych między genem ompA (1 kopia na komórkę) i plazmidem utajonym (od 7 do 10 kopii na komórkę).
Wyniki tego badania, przedstawione w tabeli 2, wskazują, że za pomocą analizy probitowej test COBAS®
TaqMan® CT, v2.0 umożliwiał wykrycie C. trachomatis nvCT (odmiana szwedzka) w stężeniach od 35,7 do
51,0 IFU/ml w przypadku transportowego podłoża hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) (średnio
43,3 IFU/ml) oraz od 14,7 do 21 IFU/ml w przypadku moczu (średnio 17,9 IFU/ml). Ze względu na zmienność
liczby ciał wtrętowych w hodowli C. trachomatis liczba żywych bakterii nie jest bezpośrednio związana z ilością
nadającego się do amplifikacji docelowego materiału CT.
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
19
Tabela 2
Granica wykrywalności testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0,
dla komórek C. trachomatis nvCT (odmiana szwedzka)
Średnia
piku IC
Całkowita
liczba N
wyników
ważnych
Trafienia
dodatnie
%
dodatnich
38,4
36,3
144
141
97,9
0,05
39,8
36,3
144
136
94,4
1
0,125
40,1
36,2
144
86
59,7
M4RT
0,5
0,006
40,6
36,2
143
68
47,6
M4RT
0,25
0,003
40,8
36,2
144
40
27,8
M4RT
0
0
brak danych
36,2
72
0
0,0
Matryca
Stężenie
panelu
(IFU/ml)
Stężenie
panelu
(IFU/PCR)
Średnia
piku CT
M4RT
8
0,1
M4RT
4
M4RT
Wartość probitowa 95%
(nieskorygowana)
5,1 IFU/ml
95% przedział ufności
3,9–7,2
(nr kopii docelowej z użyciem
7-krotnego wskaźnika korekcji)
35,7 IFU/ml
27,3–50,4
51 IFU/ml
39–72
uśrednionego wskaźnika korekcji)
43,3 IFU/ml
33,2–61,2
Matryca
Stężenie
panelu
(IFU/ml)
Stężenie
panelu
(IFU/PCR)
Średnia
piku CT
Średnia
piku IC
Całkowita
liczba N
wyników
ważnych
Trafienia
dodatnie
%
dodatnich
Mocz
20
1,0
35,6
36,1
144
144
100,0
Mocz
4
0,2
37,3
36,2
144
143
99,3
Mocz
1
0,05
39,9
36,1
144
120
83,3
Mocz
0,25
0,0125
40,6
36,0
144
71
49,3
Mocz
0,125
0,00625
40,9
36,0
143
39
27,1
Mocz
0
0
brak danych
35,9
72
0
0,0
(nieskorygowana)
2,1 IFU/ml
1,5–3,0
14,7 IFU/ml
10,5–21,0
21,0 IFU/ml
15,0–30,0
uśrednionego wskaźnika korekcji)
17,9 IFU/ml
12,8–25,5
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
20
Reprezentatywność
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, może wykrywać pojedynczą IFU na reakcję PCR dla wszystkich serowarów
C. trachomatis. Oznaczone w sposób ilościowy hodowle ATCC 15 różnych serowarów C. trachomatis
rozcieńczono w transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) i prawidłowym moczu
ludzkim do stężeń odpowiednio 80 IFU/ml i 20 IFU/ml. Stężenia te odpowiadają wejściowej wartości równej
1 IFU/PCR dla obu typów matrycy. Za pomocą testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano obróbce dwadzieścia
dwa (22) powtórzenia każdego z typów matrycy dla każdego serowaru. Wszystkie 15 serowarów wykryto
z odsetkiem wyników dodatnich równym 100% dla każdego typu matrycy.
Odtwarzalność
Aby ocenić odtwarzalność testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, badano dwa panele czteroelementowe: jeden
przygotowany na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.), a drugi w prawidłowym
moczu ludzkim. Panele przygotowano z oznaczonej ilościowo hodowli ATCC C. trachomatis i przechowywano
w stanie zamrożenia do temperatury –80°C. Człony paneli przygotowano dla stężeń CT wynoszących 0, 40, 80
i 120 IFU/ml w przypadku próbek na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) i dla
stężeń 0, 10, 20 i 40 IFU/ml w przypadku próbek moczu. Odtwarzalność oceniano dla różnych serii odczynników
i różnych przebiegów aparatu (zmian obsługi). Każdy operator wykonywał badania przez okres 5 dni przy użyciu
każdej z trzech serii odczynników.
W tabeli 3 zestawiono 2700 wyników z tego badania dla poddanych obróbce próbek na transportowym podłożu
hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.), natomiast wyniki poddanych obróbce próbek moczu są
przedstawione w tabeli 4. Wyniki ujemne uzyskano dla 100% ze 270 CT-ujemnych próbek każdej macierzy.
Całkowitą odtwarzalność dla transportowego podłoża hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) i próbek
moczu zestawiono odpowiednio w tabelach 3 i 4. Dla obu matryc wszystkie CT-dodatnie elementy panelu
w 100% uzyskały w badaniu wyniki dodatnie. Wartości współczynników zmienności dla pików CT były mniejsze
lub równe 2,3% dla próbek na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) oraz mniejsze
lub równe 4,2% w przypadku próbek moczu, co wskazuje na dobrą odtwarzalność jakościowych wyników testu.
Tabela 3
Całkowita odtwarzalność wyników dla komórek C. trachomatis na transportowym podłożu
hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.)
Liczba kopii
badanych CT IFU/ml
0
IFU/ml
40
IFU/ml
80
IFU/ml
120
IFU/ml
Całkowita liczba
ważnych oznaczeń
270
360
360
360
% wyników dodatnich
0%
100%
100%
100%
0
35,3
34,3
33,7
Wartość minimalna
0
32,5
31,3
31,4
Wartość maksymalna
0
39,1
37,1
37,8
Odchylenie standardowe
0
0,79
0,74
0,79
Współczynnik zmienności
0
2,2%
2,2%
2,3%
Średnia piku CT
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
21
Tabela 4
Całkowita odtwarzalność wyników dla komórek C. trachomatis w moczu
Liczba kopii
badanych CT IFU/ml
0
IFU/ml
10
IFU/ml
20
IFU/ml
40
IFU/ml
Całkowita liczba
ważnych oznaczeń
270
360
360
360
% wyników dodatnich
0%
100%
100%
100%
0
35,7
35,0
33,8
Wartość minimalna
0
34,1
33,2
31,9
Wartość maksymalna
0
41,9
40,3
39,4
Odchylenie standardowe
0
1,02
1,35
1,41
Współczynnik zmienności
0
2,9%
3,9%
4,2%
Średnia piku CT
Czułość diagnostyczna, swoistość diagnostyczna oraz korelacja
Skuteczność testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i testu BD ProbeTec ET (Becton Dickinson, Sparks, MD USA)
porównywano przez analizę próbek wymazów z kanału szyjki macicy oraz próbek moczu na transportowym
podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.), pobranych od osób zdrowych i zakażonych CT. Próbki
pobrano i testowano w Szwecji w miejscach o wysokiej częstości występowania szwedzkiej odmiany szczepu
(nvCT).
Za pomocą testów COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i BD ProbeTec ET zbadano ogółem 758 próbek moczu
(141 zamrożonych próbek moczu pobranych wcześniej i 617 świeżo pobranych próbek moczu). Dwie próbki
dające stale nieważne wyniki wykluczono z zestawu próbek. Czułość diagnostyczna w przypadku próbek
moczu wynosiła 95,7%. Swoistość diagnostyczna wynosiła 99,8%, a całkowita procentowa zgodność między
testami: COBAS® TaqMan® CT, v2.0, oraz BD ProbeTec ET (patrz tabela 5) w przypadku próbek moczu
wynosiła 98,7%. Wśród wyników badań moczu, które podzielono pod względem płci (patrz tabele 6 i 7), czułość
diagnostyczna wynosiła 95,9% w przypadku próbek pochodzących od mężczyzn i 95,5% w przypadku próbek
pochodzących od kobiet {dokładny test Fishera (wartość p ~ 1,0)}, natomiast swoistość diagnostyczna wynosiła
99,8% w przypadku próbek pochodzących od mężczyzn i 100% w przypadku próbek pochodzących od kobiet
{dokładny test Fishera (wartość p ~ 1,0)}. Całkowita procentowa zgodność wynosiła 98,8% w przypadku próbek
pochodzących od mężczyzn i 98,4% w przypadku próbek pochodzących od kobiet {dokładny test Fishera
(wartość p 0,7165)}. Dokładny test Fishera wskazuje na brak statystycznie istotnych różnic korelacji między
dwiema metodami testowymi w odniesieniu do próbek moczu pochodzących od mężczyzn, pochodzących od
kobiet oraz wszystkich próbek moczu.
Za pomocą testów COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i BD ProbeTec ET zbadano ogółem 413 próbek wymazów
z kanału szyjki macicy na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) (wszystkie
świeżo pobrane). Czułość diagnostyczna w przypadku próbek wymazów z kanału szyjki macicy na
transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) wynosiła 96,0%. Swoistość
diagnostyczna wynosiła 100%, a całkowita procentowa zgodność między testami: COBAS® TaqMan® CT, v2.0,
oraz BD ProbeTec ET (patrz tabela 8) w przypadku próbek wymazów z kanału szyjki macicy na transportowym
podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) wynosiła 99,5%.
05230144001-02PL
22
Doc Rev. 2.0
Tabela 5
Porównanie wyników prób moczu (pochodzących od osób zdrowych i zakażonych CT),
uzyskanych za pomocą testów COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i BD ProbeTec ET
Mocz ogółem
N = 758
Test CTM
CT, v2.0
Test BD ProbeTec ET
Wynik
dodatni
Wynik ujemny
Ogółem
Wynik dodatni
202
1
203
Wynik ujemny
9
546
555
Ogółem
211
547
758
Czułość diagnostyczna = 202/211 = 95,7% (95% CI 92,0%, 98,0%)
Swoistość diagnostyczna = 546/547 = 99,8% (95% CI 99,0%, 100,0%)
Całkowita zgodność % = 748/758 = 98,7% (95% CI 97,6%, 99,4%)
Tabela 6
Porównanie wyników prób moczu (pochodzących od zdrowych i zakażonych CT mężczyzn),
Mocz mężczyzn
N = 569
Test CTM
CT, v2.0
Test BD ProbeTec ET
Wynik
dodatni
Wynik ujemny
Ogółem
Wynik dodatni
139
1
140
Wynik ujemny
6
423
429
Ogółem
145
424
569
Tabela 7
Porównanie wyników prób moczu (pochodzących od kobiet zdrowych i zakażonych CT),
Mocz kobiet
N = 189
Test CTM
CT, v2.0
Test BD ProbeTec ET
Wynik
dodatni
Wynik ujemny
Ogółem
Wynik dodatni
63
0
63
Wynik ujemny
3
123
126
Ogółem
66
123
189
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
23
Tabela 8
Porównanie wyników wymazów z kanału szyjki macicy (pochodzących od zdrowych
i zakażonych CT kobiet) na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.),
uzyskanych za pomocą testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, i BD ProbeTec ET
Wymazy z kanału szyjki
macicy na podłożu M4RT®
N = 413
Test CTM
CT, v2.0
Test BD ProbeTec ET
Wynik
dodatni
Wynik ujemny
Ogółem
Wynik dodatni
48
0
48
Wynik ujemny
2
363
365
Ogółem
50
363
413
Błąd systemowy
Wskaźnik błędu systemowego dla testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, wyznaczono na podstawie analizy
100 testów, zarówno w przypadku transportowego podłoża hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.)
(10 IFU/ml), jak i moczu (5 IFU/ml), dla stężenia równego blisko trzykrotnej wartości granicy wykrywalności
klinicznej (patrz wyniki Granicy wykrywalności, powyżej). Wyniki dodatnie uzyskano dla wszystkich testów obu
typów próbek; daje to wskaźnik błędu systemowego równy 0,0%.
Substancje wpływające na wynik testu
Badanie substancji wpływających na wynik testu wykonano na transportowym podłożu hodowlanym M4RT®
MicroTest (Remel, Inc.) (10 IFU/ml) oraz na próbkach moczu (5 IFU/ml), dla stężenia każdego rodzaju próbki
równego blisko trzykrotnej wartości granicy wykrywalności klinicznej (patrz wyniki Granicy wykrywalności,
powyżej). Oznaczano próbki CT-dodatnie w kombinacji ze sprzedawanymi bez recepty 18 produktami
higienicznymi dla kobiet, śluzem szyjkowym i krwią pełną. W przypadku wszystkich badanych produktów
sprzedawanych bez recepty wykazano brak wpływu na detekcję zarówno sygnału docelowego CT, jak i sygnału
kontroli wewnętrznej. Obecność śluzu szyjkowego nie miała znaczącego wpływu na detekcję docelowego CT
ani na kontrolę wewnętrzną. Niski, lecz powtarzalny sygnał tła docelowego CT obserwowano w próbkach
wymazu na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.), zawierających powyżej 7%
krwi pełnej. Jednak zwiększony sygnał tła zawsze mieścił się poniżej granicy wyniku dodatniego testu i nie
uzyskano żadnych wyników fałszywie dodatnich.
Zahamowanie
Wskaźnik zahamowania testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, określono z użyciem świeżych i zamrożonych
pobranych wcześniej próbek moczu o wyniku ujemnym oraz świeżych próbek wymazów z kanału szyjki macicy
na transportowym podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) o wyniku ujemnym. Ogółem za
pomocą testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0, poddano analizie 910 próbek klinicznych: 547 ujemnych próbek
moczu (544 świeże i 3 pobrane wcześniej) i 363 ujemne wymazy z kanału szyjki macicy na transportowym
podłożu hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.) (tabela 9). Podczas początkowych badań zidentyfikowano
ogółem 7 wyników nieważnych: 6 świeżych próbek moczu i 1 wymaz. Ponowne badanie potwierdziło nieważny
wynik 2 próbek moczu, otrzymany wskaźnik zahamowania wyniósł zatem 0,4% w przypadku próbek moczu
oraz 0,2% w przypadku połączenia wszystkich próbek. Ponieważ jedna wykazująca zahamowanie próbka
moczu pochodziła od mężczyzny i jedna od kobiety, wskaźnik zahamowania w przypadku świeżych próbek
moczu pochodzących od mężczyzn wynosił 0,2%, a wskaźnik zahamowania w przypadku świeżych próbek
moczu pochodzących od kobiet — 0,8%.
05230144001-02PL
24
Doc Rev. 2.0
Tabela 9
Początkowe i końcowe poziomy zahamowania testu COBAS® TaqMan® CT, v2.0
Źródło próbek
Całkowita
liczba testów
Liczba
nieważnych
wyników
początkowych
testów IC
% nieważnych
wyników
początkowych
testów IC
Liczba
nieważnych
wyników
testów IC po
powtórzeniu
% nieważnych
wyników testów
IC po
powtórzeniu
Wszystkie
próbki o wyniku
ujemnym
910
7
0,8
2
0,2
Świeże próbki
moczu o wyniku
ujemnym
544
6
1,1
2
0,4
Świeże próbki
moczu o wyniku
ujemnym
pochodzące
od mężczyzn
421
5
1,2
1
0,2
Świeże próbki
moczu o wyniku
ujemnym
pochodzące
od kobiet
123
1
0,8
1
0,8
Pobrane
wcześniej
próbki moczu
o wyniku
ujemnym
3
0
0
0
0
Próbki
z wymazów
o wyniku
ujemnym
363
1
0,3
0
0
05230144001-02PL
25
Doc Rev. 2.0
LITERATURA
1.
Mahony, J.B., Coombes, BK., and Chernesky, M.A.. 2003. Chlamydia and Chlamydophila. In:
Manual of Clinical Microbiology, (P.R. Murray, ed.) 8th ed., ASM Press, Washington, D.C., 991-1004.
2.
Gerbase, A., Rowley J.T., and Mertens, T.E. 1998. Global epidemiology of sexually transmitted
diseases. Lancet 351:(S3) 2-4.
3.
Sexually Transmitted Disease Surveillance 2006 Supplement. Chlamydial Prevalence Monitoring
Project, Annual Report, Division of STD Prevention, Revised May 2008.
4.
Institute of Medicine. The hidden epidemic: confronting sexually transmitted diseases. Eng TR, Butler
WT, eds. National Academy Press, Washington DC, 1997.
5.
Miller W.C., Ford C.A., Morris M., et al. Prevalence of chlamydial and gonococcal infections among
young adults in the United States. JAMA. 2004; 291:2229-36.
6.
Stamm WE, Jones RS, Batteiger BE. Chlamydia trachomatis (Trachoma, Perinatal Infections,
Lymphogranuloma Venerum, and Other Genital Infections). In Mandell G.L., Benett J.E., Dolin R., eds.
Principles and Practices of Infectious Diseases. 6th ed. 2005. Elsevier, Churchill, Livingston: Vol 2.
7.
Mullis, K. B., Faloona, F. A., 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase–catalyzed chain
reaction. Methods in Enzymology 155:335-350.
8.
Palmer, L. and Falkow, S. 1986. A common plasmid of Chlamydia trachomatis. Plasmid 16:52-63.
9.
Peterson, E. M. and de la Maza, L. M. 1988, Restriction endonuclease analysis of DNA from
Chlamydia trachomatis biovars. Journal of Clinical Microbiology 26:625-629.
10.
Longo, M. C., Berniger M. L. S., and Hartley J. L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control
carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
11.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and
detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
12.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome
Research 6:986-994.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from
Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3
Wayne, PA: CLSI, 2005.
Schachter, J. and Stamm, W.E. 1995 Chlamydia. In: Manual of Clinical Microbiology, (P.R. Murray,
ed.) 6th.ed., ASM Press, Washington, D.C., 669-677.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, 2000. 704.
Centers for Disease Control and Prevention: Guidelines for treatment of sexually transmitted
diseases. 2002. Morbidity and Mortality Weekly Reports 2002 51: (NO. RR6): 1-78.
13.
14.
15.
16.
17.
05230144001-02PL
26
Doc Rev. 2.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 2.0
12/2009
"
Distributed by
•
Wprowadzono zmiany w rozdziale Wyniki, dotyczące walidacji przebiegu
testowego, interpretacji i kontroli jakości w programie AMPLILINK w wersji serii 3.2
i 3.3.
• Wprowadzono zmiany w piśmiennictwie, dotyczące podręczników aparatu
i programu, włączając program AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3.
• Zaktualizowano wyniki działania w celu dostosowania ich do użytku ze
zmodyfikowanymi parametrami PCR w zaktualizowanym pliku definicji testu.
• Zaktualizowano adresy firm stowarzyszonych.
• Oświadczenie licencyjne i informacja o symbolach IVDD zostały uprzednio dodane
do kart pomocniczych, pakowanych w zestawie.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z lokalnym przedstawicielem firmy Roche.
Test COBAS® TaqMan® CT, v2.0, wyprodukowany przez:
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273-3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
ROCHE, AMPLICOR, AMPERASE, AMPLILINK, COBAS, AMPLIPREP i TAQMAN są znakami towarowymi
firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
Microsoft oraz Windows są zarejestrowanymi znakami towarowymi lub znakami towarowymi, należącymi do
firmy Microsoft Corporation na terenie USA i/lub innych krajów.
ProbeTec jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Becton Dickinson.
Eppendorf Repeater® i Eppendorf Combitip® są zarejestrowanymi znakami towarowymi firmy EppendorfNetheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
M4RT® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Remel, Inc.
05230144001-02PL
27
Doc Rev. 2.0
Barwniki cyjaninowe zawarte w produkcie są objęte prawami patentowymi firmy GE Healthcare Bio-Sciences
Corp. oraz Carnegie Mellon University i udostępniane są firmie Roche na zasadzie licencji w celu ich włączenia
do składników zestawów badawczych i zestawów do diagnostyki in vitro. Wszelkie wykorzystanie takich
zestawów do celów innych niż badawcze lub związane z diagnostyką in vitro wymaga uzyskania podlicencji
od firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA, oraz Carnegie Mellon University,
Pittsburgh, Pensylwania, USA.
Copyright 2009, Roche Molecular Systems, Inc. Wszystkie prawa zastrzeżone.
12/2009
(05096642001-03ENGL)
Doc Rev. 2.0
05230144001-02
05230144001-02PL
Doc Rev. 2.0
28

COBAS® TaqMan® CT Test, v2.0

Transkrypt

Podobne dokumenty

Zestawy badań chłodziw

Opactwo cystersów p.w. N.M.P. i św. Bernarda,

Próbki do badań serologicznych (bruceloza, enzootyczna białaczka

Przygotowanie próbki do analizy GC/MS

Czytaj - AgrO

SKRÓCONA INSTRUKCJA POBIERANIA PRÓBEK WODY DO

spis treści Próbki od pacjenta

Instrukcja pobierania próbek gleb sadowniczych. • Próbki z pola

Nr 165/08/2016/F/1