klonowanie w płynnej kulturze z biopsją

Transkrypt

Klonowanie w płynnej kulturze z biopsją
Przyjazny piktorial dla początkujących
(LC Cloning - Newbie friendly pictorial tek)
by
creamcorn
wersja ang. www.en.psilosophy.info/gztbpdrkbfjlbbcncuasbpgz
original text: http://www.shroomery.org/forums/showflat.php/Number/5874305
[ tłumaczenie: cjuchu ]
Prosty sposób na klonowanie w płynnej kulturze.
Jest to sposób klonowania nie wymagający zaawansowanych metod, agaru, gloveboksów, komór
nadmuchowych, a nawet szybkowaru. Jest wystarczająco prosty do wykonania przez początkujących pftekowców. Prawdopodobnie znajdziesz tu również kilka dobrych wskazówek odnośnie płynnej kultury, jeśli się
z tym zmagałeś. Jak zawsze mile widziane komentarze, pytania, sugestie, oraz uznania! Przepraszam, że jest to
trochę rozwlekłe, lecz chciałem zająć się wszystkimi podstawami. Odpowiadałem na pytania początkujących
wystarczająco długo by przewidzieć je nim jeszcze zostaną zadane, więc mam nadzieję, że sprostałem
wszystkiemu.
Potrzebne materiały.
soma rights re-served
1
od 15.12.2015 na http://www.psilosophy.info/
www.psilosophy.info/gztbpdrkbfjlbbcncuasbpgz
Krok 1. Przygotowanie małej płynnej kultury
Jestem zdania, że PROSTE JEST NAJLEPSZE. Moje pojemniki na płynne kultury są zwykłymi słoikami, z
normalnymi starymi metalowymi pokrywkami i pierścieniem, ze zrobionym na górze jednym otworem. Otwór
powinien być na tyle duży by zmieściła się w nim igła, z niewielkim zapasem, by później, podczas zasysania
roztworu, nie tworzyła się próżnia. Otwór jest zakryty kawałkiem taśmy mikroporowej, a następnie ponownie
zakrywany albo filtrem do kawy i gumką recepturką, albo kawałkiem luźno zmiętej folii aluminiowej, by
działała jako osłona przeciwpyłowa.
Słoik z jednym otworkiem.
Przepis: Przepis jest ten sam co dla każdej płynnej kultury; 4% podłoża wagowo. Możesz zastosować każde ze
standardowych podłoży w płynie, miód, karo, glukoza/słód, wszystkie zadziałają. Dla płynnej kultury ważna jest
jakość wody. Przekonałem się, że destylowana jest najlepsza i daje najczystszy roztwór. Możesz również
zastosować butelkowaną wodę źródlaną, lub wodę kranową przefiltrowaną w dzbanku Brita lub czymś takim.
(Przydatność twojej może się różnić w zależności od jakości lokalnej wody kranowej u ciebie. Ja w mojej okolicy
jej unikam.) Jakość miodu również bardzo się różni - przekonałem się, że ten konkretnie asortyment działa
według mnie fantastycznie, i nie daje żadnego osadu w płynnej kulturze, nawet bez filtrowania. Może będziesz
potrzebował poeksperymentować z markami i rodzajami miodu by znaleźć ten, który zadziała. Na pewno
możesz zdecydowanie zastosować karo, a jeśli jesteś pracowity i skłonny dopaść glukozę/słód, ze wszech miar
je zastosuj. Miód, który posiadam, zdaje się przewyższać karo, więc według mnie działa.
2
Odmierz 4 gramy podłoża na 100 ml wody.
Klonowanie zaczynam generalnie z małym ćwierćlitrowym pojemnikiem. Zobacz jak odmierzyłem dokładnie 4
gramy miodu. 1 mililitr wody waży 1 gram, więc dopełnię to do 100 ml. Wrzucam to do kuchenki mikrofalowej
na około 30 sekund, tylko by podgrzać wodę, dzięki czemu miód łatwiej się rozpuści, i mieszam. Tylko robiąc
większe kultury w płynie, przelicz to oczywiście by trzymać się tych 4%.
Będzie to moja "główna" kultura. Z kultury tej pobierane są małe próbki do rozpoczęcia większych kultur w
płynie w słoikach półlitrowych, będących moimi kulturami "roboczymi", które wykorzystuję do zaszczepiania.
Reszta kultury głównej może być w lodówce, gdzie utrzyma się przez kilka miesięcy. Gdy skończy mi się
kultura robocza, trzeba tylko kilka kropli kultury głównej by zacząć na nowo cały półlitrowy słoik kultury
roboczej. Ważne by za każdym razem pobierać z kultury głównej, nie z roboczej do roboczej, w ten sposób
każda kultura robocza jest "drugim pokoleniem".
Krok 2. Sterylizacja
Według mnie istnieją tylko dwa dopuszczalne sposoby wysterylizowania płynnej kultury by uzyskać spójne
wyniki: gotowanie na parze i gotowanie w szybkowarze. Daje to alternatywę dla tych, co nie mają szybkowaru.
Dla niektórych działa gotowanie w kuchence mikrofalowej, lecz ja temu nie ufam. Jeśli dla ciebie to działa,
fantastycznie, rób tak.
W obu przypadkach, owiń górę słoika w cynfolię jak zwykle, i wypełnił strzykawkę do połowy wodą i także
zawiń w cynfolię. Obie te rzeczy wysterylizujemy jednocześnie.
3
Strzykawka z wodą.
Owinięte w folię i gotowe do sterylizacji.
4
Sterylizacja parowa:
Umieść tkaninę na dnie garnka ze szczelnie dopasowaną pokrywką. Użyj 3-5 cm wody. Umieść w środku słoik i
strzykawkę. Doprowadź do powolnego wrzenia. Gdy woda zacznie wrzeć, uruchom czasomierz na 30 minut.
Pod koniec 30 minut, wyłącz gaz, odejdź i nawet o tym nie myśl przez kilka godzin. Niech ostygnie.
Sterylizacja szybkowarowa:
Użyj szybkowaru zgodnie z jego instrukcją, z czymś, co utrzyma przedmioty nad dnem garnka (w rodzaju
tkaniny, lub siatki, jeśli taką masz). Powoli zwiększ ciśnienie. 10 psi wystarczy jeśli to wszystko co masz. 15 psi
jest również w porządku. Nie przekrocz 15 psi. Przy pożądanym ciśnieniu, nastaw czasomierz na 15 minut. Nie
przekrocz 15 minut. Gdy czas się skończy, wyłącz gaz i odejdź aż ostygnie.
Krok 3. Wybór okazu
Znajdź dobrze wyglądający owocnik! Chcemy sklonować cechy pożądane. Wiele osób ma różne pomysły na to,
który owocnik sklonować; tj. wybranie pierwszego wyrośniętego może dać szybki izolat do dalszej pracy,
wybranie dużego może dać genetyczne predyspozycje do dużych owocników; i tak dalej. Uważam, że istnieje
tak wiele wariacji w metodach uprawy, że nawet jeśli weźmiemy klona, nie mamy pojęcia jak bardzo będzie
przypominał swego "rodzica" gdy później wyrośnie - więc biorę ładnie wyglądający owocnik i mam nadzieję na
najlepsze. Czy był to dobry wybór, czy nie, przekonasz się w czasie gdy uzyskasz pierwszy plon z klonów, i
ocenisz, ile zajęło im wyrośnięcie, jakie uzyskałeś plony, i oczywiście, jaką mają moc po spróbowaniu kilku.
Jeśli okaże się, że nie są tak dobre jak miałeś nadzieję, nie irytuj się, możesz spróbować ponownie z innym
okazem pochodzącym z innej uprawy wielozarodnikowej. Jeśli okaże się dla ciebie, traktuj kulturę główną jak
złoto!
Krok 4. Biopsja
Oto gdzie można wykonywać sterylne procedury. Nie ma potrzeby przesadzać, wszystko co robię, to upewniam
się, że nie ma przeciągów, oczyszczam powierzchnię roboczą, myję ręce mydłem antybakteryjnym, i traktuję je
drugi raz jakimś środkiem dezynfekującym do rąk. Jeśli wpryskanie Oust'a w powietrze i umycie wszystkiego
wybielaczem lub czymkolwiek cię uszczęśliwi, proszę bardzo.
Weź owocnik, i przeczyść dokładnie trzon wacikiem nasączonym izopropylem. Przeczyść go naokoło. Nie
dotknij ręką żadnego obszaru w pobliżu miejsca biopsji. Przetrzyj igłę izopropylem (wypal jeśli potrzeba, ja się
tym nie kłopoczę - przecież właśnie ją wyjałowiliśmy!) i przekłuj nią trzon na wylot.
Przecieranie trzonu.
5
Robienie biopsji (Tutaj przydałyby się trzy ręce, ktoś musi trzymać aparat!
Trzeba oczywiście trzymać grzyb blisko kapelusza i przetrzeć u dołu,
a przy robieniu biopsji nie dopuścić by grzyb dotknął jakiejkolwiek powierzchni.)
Zdejmij folię z przygotowanego słoika z płynną kulturą. Przy pomocy suchego wacika wytrzyj z pokrywki
wszelkie skropliny/wilgoć. Następnie wacikiem nasączonym w alkoholu przetrzyj pokrywkę ponownie.
Przetrzyj jeszcze raz igłę, włóż ją w otwór, i naciśnij tłoczek. Woda w strzykawce wypchnie wycinek trzonu do
płynnej kultury. Szybko zakryj otwór kawałkiem taśmy mikroporowej (jeśli pokrywka wciąż jest mokra od
alkoholu, to w porządku, taśma przywrze dobrze gdy wyschnie) i zakryj wybraną przez siebie osłoną
przeciwpyłową.
Puknij ją! Możesz potrzebować pchnąć trochę mocniej, jednak płyn wypchnie kawałek trzonu.
6
Możesz odróżnić tu kawałek trzonu.
Mój roztwór naprawdę był przejrzysty,
przyrzekam, zrobiłem bez flesza by zredukować odblask i uzyskać,
miejmy nadzieję, kawałek wewnątrz.
Folia luźno umieszczona z powrotem jako osłona przeciwpyłowa, nie zapomnij opisać.
7
Wygląda na trochę poobijanego po przekłuciu!
Inkubuj i czekaj.
7-10 dni później powinieneś mieć ładnie wyglądający obłok grzybni.
Jak robią to na pokazie gotowania... "oto ten, który przygotowaliśmy wcześniej!" Wykonując wszystkie
powyższe kroki, trzeba pracować szybko by uniknąć zakażeń. Ja oczywiście przerywałem by wszystko
sfotografować, więc kto wie, czy mamy tu czystą próbkę.
Oto kultura główna po około 10 dniach kolonizowania. Zauważysz, że trochę już brakuje, gdyż wykorzystałem
trochę roztworu by zaszczepić większe kultury w płynie.
Główna kultura. Zauważ, że jest bardzo gruba!
8
Oczywiście moje małe otworki zaklejone taśmą mikroporową zapewniały całą potrzebną wymianę gazową.
Zauważ również kilka ciemnych plam, to pozostałości po trzonie. Rozpuścił się i rozpadł do tego stopnia.
Zmieni się na ciemno niebieski/szary, ponieważ z pewnością odgnieciesz go przy nakłuwaniu igłą!
Oto czynna kultura, ta ma 5 dni. Została rozpoczęta od około 4cm³ roztworu z kultury głównej, i potem była
stale mieszana na mieszadełku magnetycznym. Zastosuj je jeśli masz (lub je zrób), choć nie jest konieczne.
Grzybnia skolonizuje dobrze również bez niego, lecz potrwa to trochę dłużej. Transfer z płynnej kultury do
płynnej kultury jest SZYBKI bez względu na wszystko.
Wystarczająca ilość płynnej kultury by zabić małą armię, z kilku cm³ kultury głównej.
9
Trochę wskazówek dodatkowych dla płynnej kultury:
- Wykonaj starannie odmierzanie. Nie uzyskasz wzrostu lub będzie on słaby jeśli zastosujesz zbyt dużo podłoża.
Gdy masz wątpliwości, zastosuj trochę mniej niż 4%.
- Jeśli obłoczek twojej grzybni jest gruby i nie można go łatwo zassać, zassij co się da, i wstrzyknij z powrotem
w obłoczek. To go dobrze porozrywa.
- By pobrać z moich słoików z jedną dziurką, po prostu przechylałem je na bok, będąc bardzo ostrożnym by nie
wylać niczego przez dziurkę. Igła dochodziła w porządku. Delikatnie nim obracałem i pobierałem do strzykawki
tyle grzybni ile się dało. Im grubsza tym lepsza.
- Ludzie często pytają, "kiedy moja płynna kultura jest gotowa"? No cóż, gotowa jest wtedy gdy chcesz jej użyć!
Jeśli pływa w niej wystarczająco grzybni by pobrać wiązkę do strzykawki, zrób to. Reszta będzie dalej rosnąć aż
wyczerpią się substancje odżywcze. Gdy zdaje się już nie rosnąć, możesz przechować ją w lodówce, gdzie
przetrwa wiele miesięcy (6 lub więcej).
- Gdy pobieram, biorę wacik nasączony alkoholem, i przecieram kawałek taśmy mikroporowej. Następnie
wtykam igłę przez taśmę, i napełniam strzykawkę. Szybko nakładam kapturek na strzykawkę, i szybko
zamieniam rozmoczony kawałek taśmy mikroporowej na świeży. Na pewno możesz skorzystać z dowolnej
liczby, znajdujących się gdzieś tam, fantazyjnych technik na pojemniki na kulturę w płynie, lecz nie będą
prostsze niż otwór z kawałkiem taśmy.
- ETYKIETUJ WSZYSTKO. Oznaczaj daty, odmiany, numer pokolenia, wszystko co uważasz za istotne.
- perfekcyjnie przygotowana płynna kultura z karo lub miodem powinna być niemal krystalicznie czysta.
Dekstroza/słód dadzą żółtawy roztwór. Jeśli twój roztwór karo lub miodu zmienia kolor na żółty, mogłeś go zbyt
długo gotować. Czy postąpiłeś zgodnie z moimi wytycznymi sterylizacyjnymi? Tak czy inaczej, trochę
rozgotowane nadal zadziała, to nie koniec świata. Również, osad z miodu, lub ze słodu/dekstrozy nie zaszkodzi
- jedynie trochę utrudni dostrzeżenie ewentualnych zakażeń. Niektórzy podejmują pewne dość ekstremalne
środki przefiltrowując swe roztwory przed sterylizacją by pozbyć się osadów, zostawiam to dla ciebie.
- Jeśli nie chcesz popękanych słoików, zważ na moją wskazówkę i pozwól im ostygnąć stopniowo i naturalnie.
Szybkie FAQ o klonowaniu:
Pytanie: Dlaczego klonować?
Odpowiedź: Klonowanie zapewnia najwydajniejsze wykorzystanie substratu, najlepsze możliwe plony, a gdy
znalazłeś klona, który ma wymaganą moc, najbardziej spójną moc! Zobacz, przy zaszczepianiu
wielozarodnikowym, kończysz z bardzo wieloma odmianami (każde dikariotyczne połączenie się zarodników
jest praktycznie własną odmianą). Odmiany te czasami rosną obok siebie, a czasami łączą się drugi raz w
procesie zwanym anastomoza. Więc na końcu uzyskujesz obfitość materiałów genetycznych i odmian. Nie
wszystkie one są zdolne do owocnikowania! Myślę o tych odmianach jak o odmianach w stylu "gostek na
kanapie" - skwapliwie zjadają twój pokarm i piją twoją wodę, lecz nigdy nie wytworzą dla ciebie owocników.
Poprzez sklonowanie właściwego grzyba, mamy do czynienia z pojedynczą wyizolowaną odmianą, która się już
sprawdziła jako zdolna do owocnikowania. Kolejną korzyścią z klonowania są ładne równomierne pinsety. Gdy
masz do czynienia ze wszystkimi wymieszanymi odmianami zaszczepiania wielozarodnikowego, niektóre części
twojego substratu będą gotowe do pinowania przed innymi. Z klonami, wszystkie będą gotowe niemal w tym
samym czasie, skutkując równomiernymi, spójnymi pinsetami, i bardziej określonymi rzutami.
Pytanie: Jeśli sklonuję duży owocnik, czy wynikłe owocniki wyhodowane z niego będą duże?
Odpowiedź: Może! Jeśli masz identyczne bliźnięta u ludzi i jedno będzie jeść tylko cheeseburgery i grać cały
dzień na Nintendo, podczas gdy drugie będzie mieć zrównoważoną dietę, i regularnie ćwiczyło, czy będą miały
ten sam rozmiar i formę? Oczywiście nie. Istnieje oczywiście genetyczna predyspozycja, duży owocnik posiada
naturalnie genetykę potrzebną do wytworzenia dużych owocników - lecz warunki muszą być odpowiednie. Jego
natura ORAZ wyżywienie. Wyżywienie jest bardzo, bardzo ważne, więc zadbaj o swoje dzieci.
Pytanie: Jeśli sklonuję mutanta, czy wynikłe owocniki będą mutantami?
Odpowiedź: Ponownie, może! Zależy od tego, dlaczego nastąpiła mutacja. Jeśli był problem genetyczny, który
spowodował mutację, wówczas z pewnością zostanie przeniesiony. Możesz nie skończyć z dokładnie tymi
samymi mutacjami, lecz skończysz z jakimiś fajnymi owocnikami. Jeśli mutacja nastąpiła ponieważ owocnik
wszedł w kontakt ze szkodliwym związkiem chemicznym podczas rozwoju, to nie zostanie przeniesiona rezultatem może być równie dobrze zdrowy klon. Ponownie natura kontra wyżywienie. Stosując ludzką
analogię, jeśli sklonowałem osobę z 6 palcami (tak, to się zdarza), powstały klon urodzi się z 6 palcami. Jeśli
sklonuję człowieka, który złamał nogę, dziecko nie urodzi się oczywiście ze złamaną nogą! Rozumiesz?
10
Pytanie: Skąd powinienem pobrać biopsję?
Odpowiedź: Przekonałem się, że najlepiej z okolicy podstawy trzonu. Nie potrafię powiedzieć dlaczego, nie
wiem, wynika to jedynie z mojego doświadczenia.
Pytanie: Jaką dojrzałość powinien mieć grzyb przed klonowaniem?
Odpowiedź: Gdy pęknie zasnówka, lub tuż przed tym. Jeśli zaczyna zarodnikować, zrzuci zarodniki na trzon.
Prawdopodobnie przez to zarodniki dostaną się do twojej biopsji, i zgadnij co - nie będzie to już klon! Chcemy
uniknąć zarodników.
To na razie wszystko, jeśli ktokolwiek ma jakieś pomysły odnośnie powyższego małego mini FAQ o klonowaniu,
niech pyta, a odpowiem na tyle na ile wiem (lub może inni przywtórują i pomogą). Jedyny sposób w jaki
mógłbym to jakoś uprościć to przyjść do twojego domu i zrobić to za ciebie - lecz jeśli nie masz cycków, i nie
zamierzasz opłacić kosztów podróży, tak się nie stanie. Dzięki za czytanie i powodzenia.
[ tłumaczenie: cjuchu ]
11

klonowanie w płynnej kulturze z biopsją

Transkrypt

Podobne dokumenty

Nilfisk SCRUBTEC 130 E

Nilfisk MC 2C

Basen kryty i jacuzzi

NIDERLADZKI 2011

ZESTAW SZTUĆCY EM STELTON

Powstał nowy portal „równośd.info” gromadzący zbiory

uprawa na kukurydzy