Ćwiczenie 7: Fizjologia i metabolizm mikroorganizmów cz.2. Szereg

Ćwiczenie 7: Fizjologia i metabolizm mikroorganizmów cz.2. Szereg
biochemiczny.
I.Testy paskowe API. Identyfikacja bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.
1.Charakterystyka testów API, demonstracja gotowego przeprowadzonego testu,
wyjaśnienie zasad odczytywania wyników.
2. Przygotowanie testu API.
Studenci pracują w 2 grupach.
II. Przykładowe podłoża tradycyjnego szeregu Enterobacteriaceae .
1. Podłoże Kliglera (DEMONSTRACJA). Inne podłoża szeregów biochemicznych
(półpłynne z mannitolem, z laktozą, z fenyloalaniną, Simmonsa, z żelatyną, z
malonianem sodowym).
III. Właściwości biochemiczne bakterii.
1. Wytwarzanie enzymów proteolitycznych - hydroliza kazeiny przez bakterie
Ocenić, które z poniższych gatunków bakterii, posiadają zdolność hydrolizy kazeiny
(podłoże stałe, tzw. agar mleczny):
• Bacillus cereus
• Pseudomonas fluorescens
• Escherichia coli
2. Wytwarzanie enzymów proteolitycznych - rozkład żelatyny.
Studenci mają do dyspozycji probówki z podłożem żelatynowym na które dzień wcześniej
wysiano (posiew kłuty) bakterie następujących gatunków:
• Bacillus subtilis,
• Proteus vulgaris,
• Escherichia coli,
• Serratia marcescens
oraz probówkę kontrolną nie zaszczepioną
Ocenić który z wymienionych gatunków posiada zdolność rozkładu żelatyny.
3. Wytwarzanie amylazy przez bakterie.
Studenci maja do dyspozycji dwie płytki z podłożem zawierającym skrobię, na które
wcześniej wysiano następujące bakterie:
• Bacillus subtilis
• Escherichia coli
Na powierzchnię płytek nakropić płyn Lugola. Zabarwienie podłoża będzie zależało od
rodzaju obecnych w nim cukrów:
• mono- i disacharydów – brak zabarwienia
• dekstryn – kolor brązowy
• skrobi – kolor fioletowo-czarny
Określić, który z badanych gatunków bakterii posiada zdolność hydrolizy skrobi.
4. Test na wykrywanie oksydazy cytochromowej - enzymu łańcucha oddechowego .
Przygotować dwa paski bibuły filtracyjnej, każdy z nich nasycić paroma kroplami
odczynnika do wykrywania oksydazy cytochromowej. Nanieść jałowym tipsem niewielką
ilość hodowli Pseudomonas aeruginosa lub E. coli pobranej z płytki. Zaobserwować
zabarwienie.
Odczynniki: 1-α-naftol (1% r-r w C2H5OH 96 %), 2 - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny (1% r-ó w
wodzie). Oznaczenie można wykonać dodając odczynniki do zawiesiny bakterii w wodzie lub poprzez
naniesienie bakterii z hodowli stałej na krążek bibuły wysycony odczynnikami. W obecności oksydazy z
dodawanych odczynników powstaje błękit indofenolu, co objawia się wystąpieniem intensywnie
niebieskiego zabarwienia w ciągu 30s - 2 min.
5. Test na obecność katalazy.
Na szkiełko podstawowe nanieść niewielką ilość hodowli E. coli oraz Pseudomonas
aeruginosa. Następnie nakropić 1-2 krople wody utlenionej. Obserwować uwalnianie się
pęcherzyków tlenu.
IV. Barwniki wytwarzane przez bakterie.
1. Ekstrakcja barwnika (Pseudomonas aeruginosa).
Do hodowli płynnej Pseudomonas aeruginosa dodać po 1-2 ml chloroformu. Probówki
silnie wstrząsnąć i odstawić na kilka minut.
2. Obserwacja kolonii bakterii wytwarzających barwniki (DEMONSTRACJA).
______________________________________________________________________________
Zagadnienia teoretyczne.
W jakim celu bada się właściwości biochemiczne bakterii? Jakie właściwości bakterii bada się na podłożach:
MacConkey'a i Chapmana. Co to są i do czego służą testy API? Charakterystyka Enterobacteriacae ze
szczególnym uwzględnieniem E. coli (cechy biochemiczne: fermentacja cukrów - glukozy i laktozy,
wytwarzanie CO2 i H2 , wytwarzanie H2S-redukcja tiosiarczanu, wytwarzanie ureazy-rozkład mocznika,
wytwarzanie indolu-obecność tryptofanazy). Ektoenzymy. Enzymy bakteryjne (proteazy, amylazy…). W
jakim rodzaju oddychania uczestniczy oksydaza cytochromowa? Bakterie oksydazododatnie. Barwniki
bakteryjne.