Paper in PDF - Wydział Chemii UW

XV KBiIB 2007
Peroksydaza z kapusty i jej zastosowanie w multifunkcjonalnych
biosensorach
1
Anna Belcarz1, Grażyna Ginalska1, Barbara Kowalewska2, Paweł Kulesza2
Katedra i Zakład Biochemii, Akademia Medyczna w Lublinie, ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin,
Polska
2
Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski, ul. Pasteura 1, 02-093 Warszawa, Polska
[email protected]
Streszczenie: Frakcja kationowa peroksydazy (Px-cat) została wyizolowana (obok frakcji anionowej Px-ani)
z homogenatu główek kapusty wiosennej, częściowo oczyszczona (współczynnik oczyszczenia 143,5)
i scharakteryzowana. Optimum działania tej peroksydazy wynosi 6,0, ale w pH obojętnym (7,0) jej aktywność
przekracza 95% wartości maksymalnej. Wykazuje ona również porównywalną wysoką aktywność w temperaturach 2050oC (po 20 min. preinkubacji) i wysoką stabilność podczas 144 godzin przechowywania w temperaturze do 30oC oraz
po 6 tygodniach w 4oC. Próby zastosowania peroksydazy kapuścianej w systemie bioelektrokatalitycznym
z zastosowaniem sieci z nanorurek węglowych wykazały, że system taki wykazuje wysoką aktywność redukcyjną wobec
nadtlenku wodoru, analogicznie do systemu wykorzystującego handlowy preparat peroksydazy chrzanowej. System ten
produkuje linearne, powtarzalne sygnały w odpowiedzi na podawanie kolejnych dawek nadtlenku wodoru i działa
efektywnie przez okres co najmniej tygodnia.
Abstract: Cationic fraction (Px-cat) of peroxidase was isolated (aside of anionic Px-ani fraction) from homogenate of
spring cabbage heads, partially purified (with the coefficient 143.5) and characterized. Optimum pH of this peroxidase
fraction is 6.0, but at neutral (7.0) pH its activity exceeds 95% of the maximum value. This fraction shows comparable
high activities at temperatures 20-50oC (after 20 minutes of preincubation) and high stability during 144 hours of storage
at temperatures up to 30oC and 6 weeks at 4oC. Attempts of cabbage peroxidase application in bioelectrocatalytic system
with carbon nanotubes showed that this system revealed high reductive activity against hydrogen peroxide, analogically
to commercial horseradish peroxidase-based system. The system produces linear, repetitive signals upon consecutive
additions of hydrogen peroxide and works effectively for at least one week.
Słowa kluczowe: stabilność operacyjna peroksydazy, redukcja H2O2, bioelektrody, nanorurki węglowe
1. Wprowadzenie
Peroksydaza, syntetyzowana przez wielu przedstawicieli roślin wyższych, jest enzymem zawierającym
ugrupowanie hemowe i katalizującym reakcję jednoelektrowej oksydacji wielu substratów o charakterze
organicznym i nieorganicznym, z jednoczesnym użyciem nadtlenku wodoru (H2O2) jako akceptora
protonów. Fizjologicznie peroksydazy roślinne biorą udział w procesach elongacji komórek, lignifikacji
i mechanizmach obrony komórkowej; z tego względu są często oznaczane przez biologów jako parametry
metabolizmu komórkowego. Ponadto znane są zastosowania peroksydaz roślinnych w praktyce, na
przykład w konstruowaniu biosensorów (do oznaczania markerów nowotworowych, rutyny itd.) [2, 3],
jako elementy zestawów do oznaczeń immunologicznych [6], do syntez organicznych, biotransformacji
składników organicznych, bioremediacji zanieczyszczonych wód [7]. Do tych celów stosuje się zwykle
peroksydazę izolowaną z korzenia chrzanu w postaci preparatów handlowych. Jednakże poszukiwania
nowych źródeł peroksydazy, o nieco innych, korzystniejszych dla pewnych procesów właściwościach, są
wciąż prowadzone z dużą intensywnością.
Potencjalnym alternatywnym źródłem peroksydazy do zastosowań praktycznych może być peroksydaza
izolowana z główek kapusty wiosennej (Brassica oloeracea var. capitata). Enzym ten został stosunkowo
słabo poznany. Uwzględniając fakt, że główki kapusty stanowią ogólnodostępne i tanie źródło materiału do
izolacji enzymu, peroksydaza z kapusty mogłaby stanowić atrakcyjną alternatywę dla peroksydazy
chrzanowej. Badania przedstawione w tej pracy skupiają się głównie na określeniu niektórych właściwości
(biochemicznych, optycznych) peroksydazy izolowanej z kapusty i próbach jej zastosowania w systemach
bioelektrochemicznych do redukcji nadtlenku wodoru w środowisku o pH neutralnym.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
XV KBiIB 2007
2. Materiały i metody
2.1. Izolacja i charakterystyka peroksydazy z kapusty
Homogenat z główek kapusty został poddany 2-etapowej precypitacji 40-75% nasyceniem (NH4)2SO4.
Uzyskany precypitat, zawierający całość aktywności peroksydazy z homogenatu, odsolono poprzez dializę
do 5 mM buforu fosforanowego o pH 7,0, a następnie do wody i zliofilizowano (Px-FL). Liofilizat
nanoszono następnie na kolumnę o wymiarach 2,5 x 10 cm wypełnioną DEAE-Sepharozą CL-6B
(Pharmacia, Fine Chemicals), a niezwiązane białka wymywano liniowym gradientem 5 – 250 mM NaCl
w buforze startowym. Frakcje wykazujące aktywność peroksydazy zebrano, odsolono i zliofilizowano.
Aktywność enzymu oznaczano wobec gwajakolu [5]. Jako jednostkę aktywności zdefiniowano taką
aktywność, która w ciągu minuty katalizuje utlenienie 1 µmola gwajakolu w podanych warunkach reakcji.
Specyficzność substratową oznaczano wobec 0,4 mM gwajakolu, 0,17 mM o-dianizydyny, 0,006 mM
ABTS i 5,5 mM pirogallolu.
Optimum pH ustalano, przeprowadzając 1-godzinne inkubacje enzymu w buforze o odpowiednim pH
przed pomiarem standardowym. Optimum temperatury ustalano, przeprowadzając 20-minutowe inkubacje
enzymu w odpowiedniej temperaturze przed pomiarem standardowym. Stabilność peroksydazy wobec
różnych temperatur sprawdzano przy wartościach 20, 25, 30, 40 i 50oC przez 144 godzin i w 4oC przez 6
tygodni.
Widmo absorpcji peroksydazy ustalano dla zakresu UV-Vis (300-700 nm; interwał 1 nm)
2.2. Próby zastosowania peroksydazy z kapusty w systemie biokatalitycznym do redukcji nadtlenku wodoru.
Zastosowany układ był standardowym układem 3-elektrodowym (elektroda platynowa, chlorosrebrowa
i pracująca). Na elektrodę pracującą (szklaną) nanoszono koloidalną zawiesinę nanorurek węglowych
modyfikowanych 0,005 % wodnym roztworem kwasu benzo-4-(pirol-1-il)-owego (PyBA) stabilizowanych
Nafionem. Na tak przygotowaną powierzchnię nanoszono 0,5 ml wodnego roztworu peroksydazy (Px-FL,
Px-cat lub HRP – peroksydazy chrzanowej, Sigma) o aktywności 250 U/ml, pozostawiano na noc do
wysuszenia i przemywano wodą.
3. Rezultaty i dyskusja
3.1. Izolacja i charakterystyka peroksydazy
W trakcie chromatografii preparatu peroksydazy z kapusty (Px-FL), aktywność enzymatyczna
wypłynęła w dwóch frakcjach: głównej kationowej (Px-cat), nie związanej z nośnikiem i pomniejszej
anionowej (Px-ani), przy 0,1 M NaCl. Na tym etapie izolacji współczynniki oczyszczania wynosiły: 143,5
(Px-cat) i 5,5 (Px-ani), a aktywności specyficzne odpowiednio: 1065 i 41 U/mg białka. Procedurę
oczyszczania ograniczono do tych etapów, gdyż dalsze próby skutkowały znaczną utratą aktywności.
Aktywność Px-cat stanowiła około 97% całkowitej aktywności enzymatycznej liofilizatu Px-FL, a Px-ani –
tylko około 3%. Optimum pH obu frakcji peroksydazy wynosiło 6,0, ale forma Px-cat wykazywała
również bardzo wysoką aktywność w pH neutralnym (pH 7,0) – 95% wartości maksymalnej. Z kolei forma
Px-ani wykazała dużą tolerancję wobec pH kwaśnych – w pH 3 jej aktywność wynosi 60% wartości
maksymalnej, podczas gdy w tym samym pH forma Px-cat jest prawie inaktywowana (Rys. 1). Aktywność
frakcji Px-cat pozostaje na podobnym poziomie około 100% w zakresie 20-50oC, a w 60oC ulega ona po 20
minutach kompletnej inaktywacji. Frakcja Px-ani wykazuje optimum w temperaturze 35-50oC (około
150% aktywności), a w 60oC pozostaje aktywna w około 25%. Inkubacja enzymów w temperaturze 25oC
i 30oC przez 144 godziny wykazała, że obie frakcje pozostają w tych warunkach w pełni aktywne.
Inkubacja w temperaturach 40oC i 50oC powoduje po 144 godzinach utratę aktywności Px-cat odpowiednio
o 55 i 90%, a Px-ani odpowiednio o 25 i 30%. Wyniki te wskazują, że peroksydaza frakcji Px-cat jest
bardziej aktywna w pH neutralnym, a Px-ani - w pH kwaśnym i bardziej odporna na działanie wysokich
temperatur. Natomiast obie formy nie tracą aktywności podczas 6 tygodni przechowywania ich wodnych
roztworów w temperaturze 4oC.
Badanie specyficzności substratowej wykazało, że najlepszym substratem dla Px-cat jest pirogallol, a dla
Px-ani – o-dianizydyna.
Badanie widma absorpcji pozwoliło określić, że Px-cat wykazuje maksima absorpcji przy 404 nm w
zakresie UV, a przy 498 nm i 644 nm w świetle widzialnym (Rys. 2). Wynik ten potwierdza, że Px-cat jest
białkiem o charakterze porfirynowym. Px-ani wykazuje minimalny szczyt absorpcji tylko w UV przy około
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
XV KBiIB 2007
405 nm (Rys. 2, insert), co sugeruje, że jest to frakcja zbyt mało oczyszczona, aby wykazywać własności
absorpcji światła charakterystyczne dla porfiryn.
Px-cat
100
80
60
40
20
0
Px-ani
% activity
10
8
6
Px-cat
4
2
Px-ani
pH
Rys. 1. Wpływ pH na aktywność frakcji peroksydazy z kapusty.
Rys. 2. Widmo absorpcji frakcji Px-cat peroksydazy z kapusty (300-700 nm). W insercie - analogiczne widmo dla
frakcji Px-ani.
3.2. Próby zastosowania peroksydazy z kapusty w systemie biokatalitycznym do redukcji nadtlenku wodoru
Do prób zastosowania peroksydazy w elektrodach wybrano frakcję Px-cat, gdyż wykazywała znacznie
większy stopień oczyszczenia i aktywność specyficzną niż frakcja Px-ani, a ponadto jako jedyna
wykazywała widmo adsorpcji charakterystyczne dla białek porfirynowych.
Zastosowanie nanorurek węglowych w systemie biokatalitycznym miało na celu ulepszyć dystrybucję
ładunków (związaną z transferem elektronów) do miejsc katalitycznych unieruchomionej peroksydazy.
Użycie PyBA do modyfikacji nanorurek pozwoliło zakładać, że nanoszona na elektrody peroksydaza
mogła być przyłączana za pomocą wiązań kowalencyjnych lub oddziaływań jonowych do grup
karboksylowych kwasy benzopirolowego [4].
Reprezentatywny woltametr wykazał, że zarówno nieoczyszczona peroksydaza z kapusty (Px-FL), jak
i Px-cat wykazują podobne reaktywności elektrokatalityczne redukcji nadtlenku wodoru jak handlowa
peroksydaza (Rys. 3). Ponieważ redukcja H2O2 w neutralnym środowisku wymaga obecności protonów do
powstania cząsteczek wody, można zaobserwować lokalną alkalizację ośrodka reakcji na powierzchni
elektrody; w tym celu stosowany system zawierał 0,1 M KCl w 0,01 M buforze cytrynianowym o pH 6.0.
Badanie wpływu dodawania kolejnych porcji H2O2 do układu bioelektrokatalitycznego zawierającego Pxcat pozwoliło określić, że modyfikowana elektroda reaguje szybko i produkuje stały sygnał w czasie
mniejszym niż 2-3 sekundy. System ten działa w zakresie stężenia nadtlenku wodoru do 0,6 mM, powyżej
którego występuje efekt częściowego nasycenia i odpowiedzi prądowe zaczynają wzrastać w sposób
nielinearny (Rys. 4). Hybrydowy film bioelektrokatalityczny jest bardzo stabilny i w trakcie powtarzanych
pomiarów nie obserwuje się znaczących różnic w okresie co najmniej tygodnia.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
XV KBiIB 2007
Rys. 3. Woltametryczne odpowiedzi redukcji H2O2 (5 mM) na elektrodzie szklanej modyfikowanej oczyszczona
peroksydazą kationową z kapusty (Px-cat), nieoczyszczoną peroksydazą z kapusty (Px-FL) i peroksydazą chrzanową.
Elektrolit: 0,1 M KCl w 0,01 M buforze cytrynianowym pH 6,0. Tempo skanowania: 5 mV/s. Tło odnosi się do systemu
zawierającego Px-cat bez H2O2 (środowisko pozbawione tlenu poprzez napowietrzanie argonem).
Rys. 4. Amperometryczne odpowiedzi na sukcesywne dodawanie H2O2 do ośrodka układu (0,1 M KCl w 0,01 M buforze
cytrynianowym pH 6,0; elektroda szklana z Px-cat immobilizowanej na nanorurkach węglowych modyfikowanych przez
PyBA), przy potencjale –0,1 V (A). Zależność prądu amperometrycznego od stężenia H2O2 (B).
4. Literatura
[1] Derwińska K., Miecznikowski K., Koncki R., Kulesza P. J., Głąb S., Malik M. A., Application of
Prussian Blue Based Composite Film with Functionalized Organic Polymer to Construction of
Enzymatic Glucose Biosensor. Electroanalysis, 15, 1843-1849, 2003
[2] de Oliveira I. R. W. Z., Fernandes S. C., Vieira I. C., Development of a biosensor based on gilo
peroxidase immobilized on chitosan chemically crosslinked with epichlorohydrin for determination of
rutin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 366-372, 2006
[3] Du D., Xu X., Wang S., Zhang A., Reagentless amperometric carbohydrate antigen 19-9
immunosensor based on direct electrochemistry of immobilized horseradish peroxidase. Talanta, 71,
1257-1262, 2007
[4] Koncki R., Wolfbeis O.S., Composite Films of Prussian Blue and N-Substituted Polypyrroles:
Fabrication and Application to Optical Determination of pH. Analytical Chemistry 70, 2544-2550,
1998
[5] Łobarzewski J., Brzyska M., Wojcik A., The influence of metal ions on the soluble and immobilized
cytoplasmic cabbage peroxidase activity and its kinetics. Journal of Molecular Catalysis 59, 373-383,
1990
[6] Tiirola T., Jaakkola A., Bloigu A., Paldanius M., Sinisalo J., Nieminen M.S., Silvennoinen-Kassinen
S., Saikku P., Jauhiainen M., Leinonen M., Novel enzyme immunoassay utilizing lipopolysaccharidebinding protein as a capture molecule for the measurement of chlamydial lipopolysaccharide in serum.
Diagnostic Microbiology of Infectious Disease, 54, 7-12, 2006
[7] Veitch N.C., Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry, 65, 249259, 2004
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com