Plakat - Wydział Chemii UW

BIOCZUJNIKI ZAWIERAJĄCE POLIMERY PRZEWODZĄCE
NANOSZONE Z ROZTWORU
Magdalena Jawicz
Praca magisterska wykonana w Pracowni Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej pod kierunkiem dr hab. Agaty Michalskiej - Maksymiuk
Metoda optyczna – spektrofotometria UV- vis
W spektrofotometrii wykorzystywano kropki otrzymane w wyniku naniesienia
zawiesiny polimeru na przezroczystą folię. Na zdeprotonowaną kropkę nakładano
fosfatazę alkaliczną w octanie celulozy. Tak przygotowaną kropkę wkładano do kuwety
zawierającej roztwór buforu o pH alkalicznym Następnie do kuwety, dodawano porcje
roztworu monofluorofosforanu. Rejestrowano widmo po każdym dodatku
monoflurofosforanu (MFP).
zależność absorbancji od stężenia MFP w roztworze
1,15
1,05
F¯ + H2PO4¯
Substratem reakcji enzymatycznej był monofluorofosforan (MFP).
Produkty tej reakcji mogą ulegać reakcjom protolitycznym warunkując pH
roztworu.
A
0,77
0,76
0,9
1,15
-5
-4
-3
1,05
-2
-1
0,75
0
log C MFP
0,74
R2=0,9963
0,73
0,95
0,85
0,75
0,55
340
390
440
490
540
590
640
690
740
790
dl fali [nm]
5e-5M
1e-4M
5e-4M
1e-3M
5e-3M
1e-2M
5e-2M
1e-1M
0,72
Krzywa
1
przedstawia
widma
zarejestrowane dla bioczujnika z fosfatazą
alkaliczną dla zmieniającego się stężenia
monofluorofosforanu
w
roztworze
wodorotlenku wapnia (Ca(OH)2) o
pH~12.
0,71
0,7
0,69
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
aktywność fosfatazy
Zarówno w metodzie elektrochemicznej jak i optycznej badano wpływ rodzaju buforu i jego pH na odpowiedź bioczujnika zawierającego w swej budowie enzym
– fosfatazę alkaliczną. Optymalnym buforem, w którym prowadzono analizę okazał się roztwór wodorotlenku wapnia o pH~12.
W pomiarach, w których oznaczano aktywność fosfatazy alkalicznej wykorzystywano tylko polimer przewodzący – polianilinę, kropki/elektrody bez enzymu.
Metoda elektrochemiczna - potencjometria
W potencjometrii podstawą detekcji była zależność potencjału warstwy polianiliny w obwodzie otwartym od pH roztworu.
Bioczujnik z fosfatazą alkaliczną
Na elektrodach z polianiliny immobilizowano fosfatazę
alkaliczną, podobnie jak na kropkach. Tak przygotowane
elektrody
zanurzano
w
naczynku
pomiarowym
zawierajacym wybrany roztwór buforu.
zależność potencjału od aktywności ALP w roztworze
zależność potencjału od stężenia MFP w roztworze
zależność potencjału od aktywności ALP w roztworze
175
195
170
160
190
150
140
potencjał [mV]
200
potencjał [mV]
potencjal [mV]
Warstwy polianiliny nie modyfikowane enzymem
Uzyskano liniową zależność potencjału
polianiliny od aktywności fosfatazy w
roztworze w zakresie stężeń od 40 do
220U/ml
W
podobny
sposób
jak
w
spektrofotometrii
UV-vis
oznaczano
aktywność
fosfatazy
alkalicznej
w
roztworze.
170
180
185
180
165
160
R2=0,9942
155
150
130
175
145
120
20
170
110
400
2500
900
1400
kanał 1
FPO32- + H2O
550 nm
0,95
1,25
1900
czas [s]
ALP
0,78
1
1,35
0,65
Dla polianiliny występuje zależność barwy od stopnia utlenienia lub
stopnia protonowania. W wyniku tego procesu można zaobserwować barwy
w prawie całym zakresie widma widzialnego, od żółtej, przez zieloną,
niebieską, fioletową, aż do brunatnej. W potencjometrii wykorzystano
zależność potencjału polianiliny od pH. Niezależnie od rodzaju
wykorzystywanej zawiesiny warstwa polianiliny była w formie protonowanej;
otrzymane warstwy na folii miały barwę zieloną. Polimer przewodzący
deprotonowano w roztworze chlorku wapnia (CaCl2) o stężeniu 1M,
otrzymując warstwy o barwie niebieskiej.
Zmiany pH roztworu zachodziły lokalnie w wyniku reakcji enzymatycznej
fosfatazy alkalicznej. Enzym immobilizowany był w warstwie octanu celulozy
na powierzchni zdeprotonowanej polianiliny.
Fosfataza alkaliczna (ALP) jest enzymem uczestniczącym w hydrolizie
monoestrów kwasu fosforowego. Optimum działania tego enzymu występuje
w zakresie alkalicznym (pH 9-10). Należy do grupy enzymów ważnych w
badaniach klinicznych ze względu na rolę jaką pełni w organizmie.
Fizjologiczna aktywność fosfatazy związana jest z wiekiem i płcią. Wzrost
aktywności ALP obserwuje się u wcześniaków, dzieci w okresie dojrzewania
oraz u kobiet w trzecim trymestrze ciąży. Dorośli – (20-70U/L), noworodki –
(50-165U/L), dzieci – (20-150U/L). Do badań wybrano taki zakres aktywności
enzymu, który odpowiada zawartości fosfatazy alkalicznej w organizmie
człowieka.
zależność absorbancji od aktywności MFP w roztworze
1,1
widma zarejestrowane dla różnych stężeń MFP
A
W badaniach wykorzystano dwa rodzaje dostępnej handlowo zawiesiny
tego polimeru o różnym przewodnictwie. Do pomiarów elektrochemicznych polianilinę o przewodnictwie 200 S/cm - a do spektrofotometrycznych polianilinę o przewodnictwie 1×10-2 S/cm.
Warstwy polianiliny nie modyfikowane enzymem
Dla stałego stężenia monofluorofosforanu możliwe było
śledzenie zmian aktywności fosfatazy alkalicznej w
roztworze. W kuwecie znajdował się roztwór MFP o
stężeniu 1×10-2M oraz roztwór wodorotlenku wapnia o
pH~12. Rejestrowano widmo po każdym dodatku
fosfatazy alkalicznej, uzyskaną zależność absorbancji od
aktywności ALP przedstawia krzywa 2.
Bioczujnik z fosfatazą alkliczną
A
Celem pracy było sprawdzenie możliwości wykorzystania handlowo
dostępnej zawiesiny polimeru przewodzącego - polianiliny do detekcji zmian
pH roztworu będących wynikiem reakcji enzymatycznej. Badania wykonano
przy użyciu dwóch metod: spektrofotometrii UV-vis i potencjometrii.
Podstawą detekcji była zależność widma polianiliny w zakresie widzialnym
oraz potencjału w obwodzie otwartym od pH roztworu. Polianilinę nanoszono
na przezroczystą folię nieprzewodzącą otrzymując odpowiednio kropkę lub
elektrodę plastikową.
W spektrofotometrii podstawą detekcji była zależność widma polianiliny
od pH roztworu.
Wnioski:
kanał 2
2400
3500
4500
czas [s]
kanał 2
5500
6500
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
aktywność fosfatazy
kanał 2
opracowano czułą, szybką metodę wykorzystującą jednorazowy bioczujnik z fosfatazą alkaliczną
i polianiliną umożliwiającą oznaczenie monofluorofosforanu w zakresie stężeń od 5×10-5M do 1×10-1M
zbadano wpływ warunków pomiarów potencjometrycznych i spektrofotometrycznych wykonywanych w celu
detekcji aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) z użyciem monofluorofosforanu (MFP) jako substratu
w zoptymalizowanych warunkach, takich jak; rodzaj buforu, pH i jego stężenie, dla stałego stężenia
monofluorofosforanu możliwe było śledzenie zmian aktywności fosfatazy alkalicznej w zakresie ważnym
klinicznie, zarówno metodą spektrofotometrii UV-vis jak i potencjometrii