Wykłady - ATRINBIOTECH

Zastosowanie
chromatografii cieczowej
w biotechnologii środowiskowej
Projekt wspó
współfinansowany przez Unię
Unię Europejską
Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społ
Społecznego
Literatura:
1. R. Rosset, H. Kołodziejczyk; Współczesna chromatografia cieczowa,
ćwiczenia i zadania., PWN W-wa 2001r.
2. J.J. Kirkland; Współczesna chromatografia cieczowa., PWN W-wa
1976 r.
3. B. Walczak, J. Śliwiok; Wysokosprawna chromatografia cieczowa.,
Skrypt UŚ Katowice 1989 r.
4. W. Szczepaniak; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN
W-wa 1996 r.
5. J. Minczewski, Z. Marczewski; Chemia analityczna, tom III., PWN
W-wa 1986 r.
6. G. W. Ewing; Metody instrumentalne w analizie chemicznej., PWN
W-wa 1980 r.
7. Z. Witkiewicz; Podstawy chromatografii., WNT W-wa 2005 r.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Chromatografia
z greckiego:
chromatos = barwa + grapho = pisze
technika analityczna lub preparatywna słuŜąca
do rozdzielania lub badania składu mieszanin
związków chemicznych.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
W zaleŜności od rodzaju eluentu czyli substancji w której
rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróŜnia się
następujące techniki chromatograficzne:
• chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły
rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników
• chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz
(zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot)
• chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz
w stanie nadkrytycznym
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Eluent - czynnik wymywający, jest to płyn (gaz lub ciecz),
który pełni funkcję czynnika przenoszącego analizowaną
mieszaninę przez złoŜe, na którym następuje jej rozdział na
poszczególne związki.
Eluentami są zwykle związki chemiczne o niskiej masie
cząsteczkowej, które nie reagują ze złoŜem i przechodzą
przez to złoŜe przy jak najmniejszych oporach przepływu. W
chromatografii cieczowej eluentem jest rozpuszczalnik lub
mieszanina rozpuszczalników. Do najczęściej stosowanych
eluentów ciekłych zalicza się:
aceton, acetonitryl, chlorek metylenu, chloroform, etanol,
THF, toluen, woda - *(o czystości LC)
Eluat - roztwór zawierający substancje wymyte.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia
roztworu
badanej
mieszaniny
przez
specjalnie
spreparowaną fazę rozdzielczą (złoŜe), zwaną teŜ fazą
stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące
zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na
substancje przepływające. Podczas przepływu eluentu
(fazy ruchomej)
ruchomej przez fazę rozdzielczą następuje proces
wymywania zaadsorbowanych substancji. Intensywność
tego procesu jest róŜna dla poszczególnych składników
mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie
dłuŜej, a inne krócej, dzięki czemu moŜe następować ich
separacja.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Chromatografia cieczowa - rodzaj chemicznej techniki
analitycznej - chromatografia, w której eluentem jest ciecz,
zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą kaŜdej chromatografii
cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na
poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie
roztworu tej mieszaniny przez stałe lub Ŝelowe złoŜa, co w
pewnym sensie przypomina filtrację. Na skutek oddziaływań
międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi
mieszaninę a złoŜem jedne z nich przechodzą przez złoŜe
szybciej a inne wolniej.
HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography –
wysokosprawna chromatografia cieczowa) – to technika
analityczna stosowana do badania czystości, oczyszczania i
identyfikacji substancji chemicznych stosowana równieŜ jako
preparatywna,
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Kolumny z odpowiednim wypełnieniem:
• Ŝel krzemionkowy lub jego modyfikację
polarnymi grupami (faza normalna, NP)
• Ŝel
krzemionkowy
modyfikowany
grupami o niskiej polarności (faza
odwrócona, RP), najczęściej grupami
oktadecylowymi, C18
• wypełnienia polimerowe – bardzo
odporne chemicznie, umoŜliwiają prace
w całym zakresie pH, ale ustępują jak na
razie
moŜliwościom
rozdzielczym
wypełnień
opartych
na
Ŝelu
krzemionkowym
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Aparaty HPLC składają się zwykle z:
zbiornika na eluenty, bufory, itp.,
automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone
w eluentach
zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany
skład,
pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w
układzie.
iniektora umoŜliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez
rozszczelnienia układu (autosampler)
odpowiednich filtrów, prekolumny, która usuwa z eluenta
zanieczyszczenie mechaniczne.
kolumny z odpowiednim wypełnieniem,
termostatu kolumn,
detektora – którym moŜe być spektrofotometr UV-VIS lub
fluorescencyjny, spektrometr mas (MS),
zbiornika na zuŜyty eluent,
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
METODY ROZDZIELCZE W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Chromatografia normalnej fazy
faza stacjonarna jest zazwyczaj bardzo polarna (np. Ŝel
krzemionkowy), a faza mobilna jest niepolarna (np.
n-heksan, tetrahydrofuran). Rozdzielane substancje im
bardziej są polarne tym silniej oddziałują z polarnym
nośnikiem.
Chromatografia odwróconej fazy
faza stacjonarna jest zazwyczaj niepolarna, hydrofobowa, a
faza mobilna jest polarna (np. mieszanina wody i metanolu).
Rozdzielane substancje im mniej są polarne tym silniej
oddziałują z niepolarnym nośnikiem.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Detekcja
W wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosuje się
detektory o działaniu ciągłym (przepływowe), charakteryzujące
się duŜą czułością i małą objętością komórki pomiarowej.
Najczęściej w metodzie chromatografii cieczowej wykorzystuje
się;
• detektor absorpcji w nadfiolecie (UV-Vis),
• refraktometr róŜnicowy,
• detektor adsorpcyjny mikrokalorymetryczny,
• detektor fluorometryczny,
• detektor polarograficzny,
• detektor konduktometryczny.
• detektor masowy (MS)
Dobry układem detekcyjnym jest połączenie dwóch
detektorów.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Wypełnienia kolumn w HPLC
Fazy stacjonarne (adsorbenty)
Rozdział w HPLC opera się na oddziaływaniu powierzchniowym,
które silnie zaleŜy od natury chemicznej centrów adsorpcyjnych.
Nowoczesne adsorbenty stosowane w HPLC są małymi cząstkami o
bardzo rozwiniętej powierzchni.
W HPLC stosuje się praktycznie dwa typy wypełnień:
- wypełnienia powierzchniowo porowate i wypełnienia mikroporowate
w całej masie (o małej średnicy ziaren).
- rozmiar cząstek 3 - 10 µm
- rozmiary porów: 70 - 300 Å;
- powierzchnia: 50 to 250 m2/g
- rodzaje centrów aktywnych:
• odwrócona faza (C8, C18, -fenyl),
• normalna faza: (-OH, -NH2),
• jonity (NH4+), (-COO-)
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Schemat przekroju
ziarna nośnika:
a) ziarno z
powierzchniową
warstwą adsorpcyjną
(składa się z
nieprzenikliwego
rdzenia oraz
powierzchniowej
warstwy adsorpcyjnej),
b) ziarno porowate w
całej masie.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Czasem retencji tR . nazywa
się czas. jaki upływa między
zadozowaniem
próbki
a
pojawieniem się maksimum
piku
rozpatrywanego
składnika próbki.
Składnik nie zatrzymywany
przez
fazę
stacjonarną
pojawia się w wycieku po
czasie
tM.
nazywanym
czasem retencji substancji
nie
zatrzymywanej
(lub
zerowym czasem retencji).
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Współczynnik retencji k jest to stosunek ilości substancji w fazie
stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej. Jeśli cS i cM
oznaczają, odpowiednio, równowagowe stęŜenia substancji w fazach
stacjonarnej i ruchomej, a VS i VM są objętościami tych faz w
kolumnie, to:
c SV S
VS
k=
=K
c MVM
VM
Wielkość K = cS/cM nazywana jest stałą podziału substancji między
dwie fazy. Czas retencji związany jest ze współczynnikiem retencji
podstawową zaleŜnością w chromatografii
tR = tM(1+k)
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Współczynnik rozdzielenia
Współczynnik rozdzielenia jest miarą rozdzielenia pików dwóch
substancji:
K 2 k2 tR2 − t M
α=
=
=
K 1 k 1 t R1 − t M
Sprawność kolumny chromatograficznej, od której zaleŜy rozdzielenie
pików, mierzy się dla kaŜdej substancji liczbą półek teoretycznych, N, w
kolumnie. Po przebyciu przez próbkę pewnej drogi w kolumnie rozkład jej
stęŜenia w wycieku ma kształt krzywej Gaussa. Odchylenie standardowe
tego piku, σ (wyraŜone w jednostkach czasu), powiązane jest z liczbą
półek zaleŜnością:
2
t
σ2 = R
N
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
W przypadku piku gaussowskiego jego szerokość, w na określonej
wysokości jest związana z kwadratem odchylenia standardowego
(wariancją) zaleŜnością
2
w = a ⋅σ
2
w której współczynnik proporcjonalności a zaleŜy od wysokości, na jakiej
mierzone jest w. Przez połączenie obu powyŜszych zaleŜności otrzymuje się
 tR 
N = a 
w
2
Wartości tR i w powinny być mierzone na chromatogramie i wyraŜane w
tych samych jednostkach - czasu lub długości.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
 tR 
N = a 
w
2
PowyŜsze równanie stanowi podstawę wielu metod obliczania liczby
półek.
W dwu najczęściej stosowanych metodach wykorzystuje się
szerokość piku przy podstawie, wb, zdefiniowaną jako część
podstawy piku odciętą przez styczne wykreślone w punktach
przegięcia po obu stronach piku (wb = 4σ) , oraz szerokość piku w
połowie wysokości (wh = 2,36σ)
 tR
N = 16
 wb
2

 tR
 = 5,54

 wh



2
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Wskaźnik sprawności
Wskaźnik sprawności to iloczyn liczby półek przypadających na
jednostkę czasu i liczby półek przypadających na jednostkę ciśnienia:
2
N
IP =
t R ⋅ ∆P
Jeśli ciśnienie wyraŜone jest w barach, a czas analizy w sekundach,
to wskaźnik ten wynosi 103 - 105 w przypadku kolumn dobrze
napełnionych i uŜywanych we właściwych warunkach.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
TECHNIKA SPE – Solid Phase Extraction
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE - ang. solid-phase extraction)
jest jedną z najprostszych a zarazem jedną z najbardziej
efektywnych i uniwersalnych metod chromatografii a zarazem
sposobem na wydzielenie/zatęŜenie substancji badanej.
Wykorzystywane w metodzie SPE kolumienki jednorazowego
uŜytku z odpowiednim wypełnieniem są wygodne w
stosowaniu i łatwe do utylizacji. W zaleŜności od rodzaju
badanej substancji dobiera się stosowne wypełnienie
kolumienek i odpowiednie czynniki wymywające.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Aparat próŜniowy do techniki SPE
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Kolumienki SPE
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
ZASTOSOWANIE
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Nowoczesny chromatograf cieczowy charakteryzuje się
wysoka sprawnością, dobrą rozdzielczością, duŜą
szybkością procesu. Te korzystne parametry współczesnej
chromatografii cieczowej (HPLC) osiągnięto dzięki
instrumentacji metody i wprowadzeniu nowych faz
stacjonarnych.
Współczesna
HPLC,
wprowadzona
w 1960 r. okazała się najbardziej pręŜnie rozwijającą się
techniką
chromatograficzną
i
znalazła
szerokie
zastosowanie w analizie preparatów farmaceutycznych,
analizie biochemicznej, klinicznej i środowiskowej.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Oznaczanie śladowych ilości substancji
chemicznych dodawanych jako konserwanty
do produktów spoŜywczych lub kosmetyków
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
W Głównym Instytucie Górnictwa opracowana została
nowoczesna metoda oznaczania wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (WWA) w glebach z terenów
rolniczych
zlokalizowanych
w
pobliŜu
zakładów
przemysłowych z wykorzystaniem techniki HPLC. Metodyka
wykorzystuje metodę technikę szybkiej ekstrakcji i
zatęŜania z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE)
oraz techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
* SPE – solid phase extraction
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Stosując chromatografię cieczową, w próbkach masła
oznaczono jakościowo oraz ilościowo tokoferole(T) i
tokotrienole
(T3),
charakterystyczne
dla
tłuszczów
roślinnych. W przebadanych, losowo zakupionych w handlu
detalicznym, kostkach masła Ekstra, Śmietankowego i
Osełkowego stwierdzono, Ŝe 33% przebadanych próbek
było produkowanych z dodatkiem tłuszczu roślinnego, o
czym świadczy obecność tokoferoli, a w szczególności
tokotrienoli, które występują jedynie w tłuszczu palmowym
lub kokosowym.
Cyt: śYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 3 (58), 47 – 56
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Udział procentowy tych homologów w sumarycznej zawartości T i T3
kształtował się na poziomie od 40 do 82%. Taka ilość oznaczonych
tokochromanoli świadczy o róŜnym dodatku tłuszczu roślinnego do
tłuszczu mlecznego i wskazuje na obecność na polskim rynku
nierzetelnych producentów, którzy deklarują tylko zawartość tłuszczu
mlecznego (82 lub 73,5%) na opakowaniach masła.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Zastosowanie HPLC do wykrywanie fałszerstw.
Problem fałszywego czeku:
Po skasowaniu czeku opiewającego na 1100 $, jego
wystawca oświadczył, Ŝe wypisał czek jedynie na 100 $.
Czek z podejrzeniem fałszerstwa został przekazany do
analizy do Instytutu Kryminalistyki w celu dokonania
ekspertyzy. Istotną rzeczą dla ekspertów jest, by nie
uszkodzić dokumentu, który moŜe się okazać niezbędny w
postępowaniu sądowym. W tym więc przypadku pobrana do
analizy próbka materiału musi być minimalna.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
techniką umoŜliwiającą rozwiązanie tego problemu.
jest
Analizę wykonujemy w następujący sposób:
za pomocą mikrodziurkarki pobieramy krąŜki dokumentu o
średnicy od 0,8 do 1,0 mm. Tusz ekstrahujemy organicznym
rozpuszczalnikiem (np. metanolem) z krąŜków w kapilarze
szklanej. Następnie otrzymany ekstrakt nastrzykujemy
na
kolumnę
chromatografu
cieczowego
(HPLC)
i wykonujemy analizę.
Otrzymujemy chromatogram tuszu pierwszej i drugiej jedynki z czeku
uzyskując skład chemiczny próbek. Składnikami tuszu pierwszej
(dopisanej) jedynki są chlorek tetrametylopararozaniliniowy, fiolet
krystaliczny i fiolet metylowy. Tusz drugiej jedynki zawiera wyraźnie mniej
fioletu krystalicznego niŜ fioletu metylowego i błękit Wiktorii.
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜ
wyŜsze i nauka”
nauka”