Metody przechowywania i utrwalania bioproduktów

METODY PRZECHOWYWANIA
I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW
SUSZENIE – PODSTAWY
TEORETYCZNE CZ.1
Opracował: dr S. Wierzba
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej
Uniwersytetu Opolskiego
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Suszenie mikroorganizmów i produktów ich biosyntezy – złożony proces, w którym
przenoszenie masy i ciepła uzależnione jest od:
• właściwości struktury układów (mikroorganizm, produkt biosyntezy, fermentacji)‫‏‬
• przemian fizykochemicznych i biologicznych towarzyszących procesowi suszenia
Anabioza – stan okresowego, odwracalnego zatrzymania funkcji życiowych organizmu
(obniżenia aktywności życiowej).
Funkcje życiowe reguluje:
• temperatura
• wilgotność
Aktywność wody (Aw)
0,75 – 0,85 (mikroorganizmy)‫‏‬
W trakcie suszenie organizm traci wodę wolną (aktywna biologicznie)‫‏‬
Anabioza – obecność tylko wody
związanej w postaci uwodnionych
otoczek polarnych grup substancji
stanowiących szkielet żelu
protoplazmy.
Woda związana:
• nie rozpuszczają się w niej
substancje znajdujące w
przestrzeniach wolnych struktury
żelowej – zatrzymanie funkcji
biochemicznych
• niszczy lub uszkadza cienkie błony
biologiczne (poniżej 1mm)‫‏‬
Rola wody w układach
biologicznych :
• łatwość tworzenia połączeń i
porządkowania struktur
• stabilizacja konformacji białek
• rozpuszczalnik biopolimerów
• ważna rola w tworzeniu
biomembran
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Odporność fizjologiczna (biologiczna) – związana z procesami adaptacyjnymi
Odporność fizyczna (strukturalna) – związana z budową poszczególnych
mikroorganizmów
Suszenie (odwodnienie) powoduje:
• usunięcie środowiska, w którym przebiegają reakcje biochemiczne
• zmiany strukturalne na poziomie biopolimerów, membran, organów, komórek (istotnie
zmieniając odporności mikroorganizmów na działanie czynników zewnętrznych: pH,
temperatura, ciśnienie, lepkość, promieniowanie itd.)‫‏‬
Przyczyny zamierania mikroorganizmów:
• naruszenie błony komórkowej,
• denaturacja termiczna białek
• naruszenie stabilności transportu substancji rozpuszczalnych w wodzie
• wzrost lepkości środowiska
Wzrost odporności mikroorganizmów na odwodnienie jest możliwy poprzez:
• określenie optymalnych warunków odwadniania i przechowywania preparatów
mikrobiologicznych
• doskonalenie szczepów – podwyższenie odporności kultur odwadnianych
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Wpływ różnych czynników na odporność suszonych mikroorganizmów
Wilgotność – wpływ jej końcowej zawartości na jakość produktów należy rozpatrywać
oddzielnie dla:
• produktów syntezy mikrobiologicznej – ich jakość maleje wraz ze wzrostem wilgoci
(końcowa zawartość nie wyższa niż 8-10%)‫‏‬
• mikroorganizmów – odporność na suszenie uzależniona od:
• rodzaju mikroorganizmu (E. coli – 37%, Streptococcus pneumonia – 18%)‫‏‬
• warunków hodowli (dobór odpowiedniej substancji ochronnej)‫‏‬
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Wilgotność końcowa – parametr decydujący o zachowaniu zdolności życiowych
mikroorganizmów podczas suszenie i przechowywania
Przykłady odporności termicznej mikroorganizmów:
• przetrwalniki, cysty – okresowe „odgradzanie” się układu od otoczenie otoczką
• komórki wegetatywne – zmiana parametrów fizjologicznych i biochemicznych
• drożdże, grzyby – zdolność do zatrzymywania wody swobodnej
• tworzenie symbioz (bakterie Actynomycetes + wodorosty)‫‏‬
• korzystny wpływ na stan błon komórkowych:
• jonów magnezu, potasu, wapnia , trehaloza (drożdże)‫‏‬
• kationy metali dwuwartościowych, kwas dwupikolinowy (Bacillus)‫‏‬
• immobilizacja komórek na nośnikach (wzrost stabilności komórek)‫‏‬
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Temperatura – odporność termiczna – termostabilność – ważna dla określenia
optymalnych warunków temperaturowych procesu suszenia, zależy od:
• składu i temperatury podłoża hodowlanego (sacharoza, glukoza, białka sprzyjają
termostabilności)‫‏‬
• pH (maksymalna dla większości komórek w przedziale 6-7)‫‏‬
• wieku kultury
• składu chemicznego komórek
• sposobu prowadzenia hodowli (fermentacji)‫‏‬
Podstawowym parametrem decydującym o termostabilności jest zawartość i postać wody
znajdującej się w komórkach (aktywność wody - Aw):
• przetrwalniki – woda związana / komórki wegetatywne – woda swobodna
• wraz ze zmniejszeniem Aw wzrasta termostabilność komórek
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Krzywe kinetyczne inaktywacji cieplnej
mikroorganizmów – pozwalają określić
temperaturę procesu suszenia i sposób
dostarczania ciepła
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Kinetyka inaktywacji bakterii Propionobacterium acnis
•
•
•
•
•
1-50°C
2-53°C
3-55°C
4-60°C
5-65°C
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Kinetyka inaktywacji wirusa pryszczycy
• 1-60°C
• 2-70°C
• 3-80°C
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Kinetyka inaktywacji przetrwalników Bacillus stearothermophillus
F7954 w wodzie destylowanej
•
•
•
•
•
1-105°C
2-108°C
3-110°C
4-116°C
5-121°C
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Kinetyka inaktywacji bakteriofagów T4
•
•
•
•
•
•
1-50°C
2-55°C
3-60°C
4-65°C
5-70°C
6-75°C
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Działanie mechaniczne:
• korzystny wpływ:
• napowietrzanie,
• przyspieszenie procesów wymiany między komórka a otoczeniem)‫‏‬
• niekorzystny:
• denaturacja białek
• wytrząsanie z rozproszonymi ziarnami ciał stałego (piasek, kwarc): uszkodzenie,
dezintegracja komórek
Dezintegracja
mechaniczna
niekorzystnie wpływa na
jakość suchych
preparatów
bakteryjnych, ale jest
korzystna i celowa w
otrzymywaniu produktów
biosyntezy
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Adsorpcja – zależy od właściwości substancji adsorbowanej i rozpuszczalnika, oraz od
struktury adsorbentu:
• ujemny wpływ na przeżywalność – węgiel aktywny, metale
• pozytywny wpływa na suszenie, filtrację, zatężanie i przechowywanie:
• adsorbenty mineralne (filtry porcelanowe, szklane, azbestowe, zeolity)‫‏‬
• pochodzenia roślinnego (otręby pszenne, ziarna zbóż, skrobia, mąka)‫‏‬
Przykłady stosowania sorbentów:
• metoda przechowywania kultur na stałych nośnikach – grzyby, promieniowce,
• hodowla mikroorganizmów na stałych substratach
• Salmonella enteritidis – podłoże z ziarnami zbóż
- podłoże bez dodatków
45-500C – 20-30 minut
45-500C – 0,5-1 minuta
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
pH środowiska – dla większości optymalne w zakresie 6-7, odchylenia od tej wartości
powodują uszkodzenia bariery osmotycznej (błony komórkowej):
• wyjątek Mycobacterium – utrzymują aktywność w przedziale pH 1-13
Szczególne znaczenie pH podczas suszenia rozpryskowego, gdyż wpływa na lepkość
roztworu.
Od lepkości zależy stopień rozpylenia w suszarce, intensywność wymiany ciepła i masa
kropli.
Napięcie powierzchniowe – jego zmiany wpływają na przebieg procesów fizjologicznych
mikroorganizmów:
• zmiana intensywności przemian, wzrostu, podziału komórek
• zmiana struktury i właściwości błon komórkowych (rozerwanie)‫‏‬
Krytyczna wartość napięcia powierzchniowego – 35-50 x10-3 N/m
Ciśnienie:
• mechaniczne – bez większego wpływu na przeżywalność – duża odporność
• gazów rozpuszczonych – skład atmosfery w suszarce istotnie wpływa na przeżywalność,
zwłaszcza ciśnienie CO2, O2
• osmotyczne – istotny wpływa (dehydratacja komórek)‫‏‬
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Właściwości fizyczne suszonych obiektów pochodzenia mikrobiologicznego –
decydujące o odporności fizycznej (strukturalnej)‫‏‬
Termostabilność (odporność cieplna) - określa wrażliwość (podatność)
mikroorganizmów, lub produktów ich syntezy na działanie podwyższonej temperatury w
określonym czasie.
Do określania tremostabilności wykorzystuje się metodę kapilarną.
Termogramy – zależności graficzne temperatury i czasu ogrzewania, z których można
odczytać przeżywalność mikroorganizmów lub aktywność produktów biosyntezy
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Termostabilność antybiotyków
• bacytracyna
gryzyna
• czas ogrzewania [s] : 1-5; 2-15; 3-30; 4-60; 5-300; 6-900; 7-1800
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Termostabilność wegetatwnych form bakterii
Rhizobium pisum
Azotobacter chroococcum
• czas ogrzewania [s] :
•
1-5; 2-15 ; 3-30; 4-60; 5-90; 6-180; 1-5; 2-30 ; 3-60; 4-300
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Termostabilność przetrwalników bakterii
• Bacillus thuringiensis
• czas ogrzewania [s] : 1-15; 2-30 ; 3-30; 4-60; 5-300; 6-900
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Zależność stałej szybkości reakcji inaktywacji cieplnej od temperatury:
• formy wegetatywne – (45-500C) – wąski zakres temperatur inaktywacji 10-15 K
• przetrwalniki – (90-1000C) – wyższa termostabilność, szerszy zakres temperatur
SUSZENIE – PODSTAWY TEORETYCZNE CZ1
Wpływ temperatury na szybkość reakcji inaktywacji można opisać równaniem
Arheniusa
k = A×e
Dla t £ 60
szybkość
inaktywacji jest stała
Dla t > 60 szybkość
ulega zmniejszeniu
- Ea / RT
gdzie:
A – stała
Ea - energia inaktywacji [kJ/mol]