Jak zidentyfikować patogen w czasie 15 minut bez

LAMP Applications
JAK ZIDENTYFIKOWAĆ PATOGEN
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
11, email [email protected]
fax +48 0 61 610 39
W CZASIE 15 MINUT
… bez udziału PCR …
czyli LAMP krok po kroku
na przykładzie identyfikacji pierwotniaka
Babesia canis
Przygotowanie izotermalnej mieszaniny reakcyjnej („na stole”)
1x
Isothermal Master MIX
F3 [10µM]
B3 [10 µM]
FIP [10 µM]
BIP [10 µM]
DNA
woda
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10
fax +48 0 61 610 39 11, email [email protected]
1
15 µl
5 µM
5 µM
20 µM
20 µM
2 µl
do 25 µl
25 µl
Amplifikacja DNA w warunkach izotermicznych
(termocykler BioRad model: C1000 Thermal Cycler z modułem CFX96 Real-Time System)
ANNEALING (gradient temperatury)
61 / 63 / 65 / 66 °C – 1 sec
61 / 63 / 65 / 66 °C – 22 sec
90x
Collect data (kanał FAM)
MELT CURVE
66 – 98 °C
Collecting data continuously (0,5 °C / 5 sec)
Zabrania się (bez zgody firmy NOVAZYM Polska) powielania, kopiowania i wykorzystywania do celów prywatnych wszelkich informacji,
zdjęć oraz danych znajdujących się w niniejszym pliku, pod rygorem skierowania sprawy na drogę postępowania sądowego.
1
2
LAMP Applications
WYNIK AMPLIFIKACJI
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
11, email [email protected]
fax +48 0 61 610 39
61 °C
66 °C
65 °C
63 °C
Identyfikacja pierwotniaka Babesia canis
Zdj 1. Wynik amplifikacji sekwencji 18S DNA Babesia canis
w izotermalnej reakcji LAMP w temp. 66 °C przez 35 minut.
W 2% żelu agarozowym rozdzielono po 10 µl produktów reakcji
PCR, gdzie matrycą był:
(K+) – genomowy DNA pierwotniaka Babesia canis;
(K-) – genomowy DNA izolowany z krwi zdrowego psa;
(K H2O) – reakcja kontrolna bez matrycy
M – marker masy DNA.
Zdj. 2. Wynik amplifikacji sekwencji 18S DNA Babesia canis
w izotermalnej reakcji LAMP w gradiencie temperatury amplifikacji
(61 / 63 / 65/ 66 °C).
W 2% żelu agarozowym rozdzielono po 10 µl produktów reakcji PCR, gdzie
matrycą był genomowy DNA Babesia canis.
M – marker masy DNA
Zabrania się (bez zgody firmy NOVAZYM Polska) powielania, kopiowania i wykorzystywania do celów prywatnych wszelkich informacji,
zdjęć oraz danych znajdujących się w niniejszym pliku, pod rygorem skierowania sprawy na drogę postępowania sądowego.
2
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10
fax +48 0 61 610 39 11, email [email protected]
w wyniku amplifikacji DNA z dwoma parami starterów w 15,3 min (40 cykli x 23 sek)
LAMP Applications
na przykładzie identyfikacji wirusów GPV i GCV
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
11, email [email protected]
w jednej reakcji
fax +48 0 61 610 39
Amplifikacja DNA w warunkach izotermicznych
(termocykler Applied Biosystems model: 7500 Fast Real-time PCR System)
wirus GCV
wirus GPV
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10
fax +48 0 61 610 39 11, email [email protected]
3
Identyfikacja wirusów w wyniku amplifikacji DNA z dwoma parami starterów
wirusa GCV w 10 minut (10 cykli x 1 min)
wirusa GPV w 16 minut (16 cykli x 1 min)
Zdj. 3. Wynik amplifikacji wybranych sekwencji DNA wirusów GPV
i GCV w izotermicznej reakcji LAMP.
W 2% żelu agarozowym rozdzielono po 10 µl produktów reakcji PCR,
w której matrycą był genomowy DNA Babesia canis.
M – marker masy DNA
Zabrania się (bez zgody firmy NOVAZYM Polska) powielania, kopiowania i wykorzystywania do celów prywatnych wszelkich informacji,
zdjęć oraz danych znajdujących się w niniejszym pliku, pod rygorem skierowania sprawy na drogę postępowania sądowego.
3
LAMP Applications
4
Loop-mediated Isothermal AMPlification
Technika LAMP (ang. Loop-mediated Isothermal AMPlification) charakteryzuje się bardzo
Novazym
Polska iul.
Żywokostowa oraz
23, 61-680
Poznań,
tel. +48 0 patogenów
61 610 39 10,
fax +48
0 61 610
39
wysoką
czułością
specyficznością
umożliwia
identyfikację
w bardzo
krótkim
czasie.
11, email [email protected]
Wykorzystując tą zaawansowana technikę molekularną identyfikowane są już między innymi
następujące patogeny:
PIERWOTNIAKI
Babesia canis (choroba: babeszjoza psów)
Eimeria acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. tenella (choroba: kokcydioza kur)
BAKTERIE
Streptococcus equi (choroba: zołzy koni)
Salmonella typhimurium (choroba: salmonelloza świń)
WIRUSY
Parwowirus PGV (choroba: parwowiroza gęsi, choroba Derzy’ego)
Cirkowirus GoCV (choroba: cirkowiroza gęsi)
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10
fax +48 0 61 610 39 11, email [email protected]
Cirkowirus typu II PCV-2 (choroba: cirkowiroza świń).
Polecana literatura tematyczna
1)
Wozniakowski G., Kozdrun W., Samorek-Salamonowicz E. Loop-mediated isothermal amplification for the
detection of goose circovirus. Virology Journal 2012, 9:110
2)
Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM. The development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) method for detection of Babesia spp. infective to sheep and goats in China. J Virol Methods 2008
3)
Chantratita N, Meumann E, Thanwisai A, Limmathurotsakul D, Wuthiekanun V, Wannapasni S, Tumapa S, Day
NP, Peacock SJ Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the
simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Clin Microbiol 2007
4)
Ebbinghaus P, von Samson-Himmelstjerna G.,Krücken J. A rapid and highly reliable field-based LAMP assay of
canine parvovirus. Exp Parasitol 2012
5)
Freifeld AG, Simonsen KA, Booth CS, Zhao X, Whitney SE, Karre T, Iwen PC, Viljoen HJ Development and
clinical verification of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Salmonella species in
suspect infected ducks. J Mol Diagn 2012
6)
Fang X, Chen H, Xu L, Jiang X, Wu W, Kong J. Isothermal Amplification Using a Chemical Heating Device for
Point-of-Care Detection of HIV-1. Lab Chip 2012
7)
Srividya G, Kulshrestha A, Singh R,Salotra P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the
species-specific detection of Eimeria that infect chickens. Parasitol Res 2011
8)
Paraguison RC, Flores EB, Cruz LC. A simple and rapid method for detection of Goose Parvovirus in the field by
loop-mediated isothermal amplification. Biochem Biophys Res Commun 2010
9)
Koizumi N, Nakajima C, Harunari T, Tanikawa T, Tokiwa T, Uchimura E, Furuya T, Mingala CN, Villanueva MA,
Ohnishi M & Suzuki Y. Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Raw Milk with Loop-Mediated Isothermal
Amplification and Chemosensor. J Clin Microbiol 2012
Zabrania się (bez zgody firmy NOVAZYM Polska) powielania, kopiowania i wykorzystywania do celów prywatnych wszelkich informacji,
zdjęć oraz danych znajdujących się w niniejszym pliku, pod rygorem skierowania sprawy na drogę postępowania sądowego.
4