Genomic Wake-Up Call Samol, Marta

Genomic Wake-Up Call
Samol, Marta
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2015
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Samol, M. (2015). Genomic Wake-Up Call: Activating Silent Biosynthetic Pathways for Novel Metabolites in
Penicillium chrysogenum [Groningen]: University of Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 06-03-2017
Streszczenie
Metabolity wtórne w przeciwieństwie do metabolitów pierwszorz˛edowych nie sa˛
bezpośrednio niezb˛edne do wzrostu i rozwoju organizmu, który je syntetyzuje.
Ich zakres zastosowania rozciaga
˛ si˛e od produkcji ocalajacych
˛
życie leków aż do
wyniszczajacych
˛
toksyn, to przyczyniło si˛e do ich ogromnego znaczenia w ludzkim
społeczeństwie zarówno w świecie medycznym jak i ekonomicznym. Wi˛ekszość
tych drobnoczasteczkowych
˛
molekuł jest syntetyzowanych przez mikroorganizmy,
w szczególności zamieszkujace
˛ gleb˛e bakterie i grzyby. Typowo w ich syntez˛e zaangażowane sa˛ wielofunkcyjne maszynerie Nierybosomowych Syntetaz Peptydowych
(NRPS), Syntaz Poliketydowych (PKS) lub hybryd NRPS/PKS (HPN).
Po odkryciu penicyliny przez Aleksandra Fleminga w 1928 roku, Penicillium chrysogenum jako pierwszy grzyb o strz˛epkowej grzybni został wykorzystany w przemyśle ze wzgl˛edu na właściwość fermentacji antybiotyków β-laktamowych. Wysoki
poziom produkcji penicyliny został osiagni˛
˛ ety poprzez mutagenez˛e losowa˛ a także
poprzez ścisła˛ selekcj˛e szczepów w ramach programu: klasyczne udoskonalania
szczepu (CSI). Wyjaśnienie szlaku biosyntetycznego penicyliny było sprz˛eżone z
gł˛eboka˛ analiza˛ genetyczna˛ i biochemiczna.˛ Ze wzgl˛edu na odpowiednie cechy
fermentacji przemysłowych P. chrysogenum, został wybrany jako idealny organizm
wyjściowy do produkcji pół-syntetycznych β-laktamów. Dodatkowo, P. chrysogenum jest interesujacym
˛
obiektem badań, gdyż jego genom zawiera znaczna˛ liczb˛e
genów należacych
˛
do szlaków wtórnych metabolitów, choć wi˛ekszość jest nie ekspresjonowana w standardowych warunkach hodowli. Dopiero w ostatnich latach
wykazano, że oprócz ACVS [δ-(L-a-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase]
NRPS odpowiedzialnej za syntez˛e penicyliny, P. chrysogenum zawiera 20 PKS, 10
NRPS (łacznie
˛
z 2 HPN).
Podstawowymi funkcjami enzymatycznymi najważniejszych domen tworzacych
˛
moduł sa:˛ adenylacja (A), peptydowy nośnik białek (PCP), kondensacja (C). Syntetaza NRP jest ogólnie złożona z jednego lub wi˛ecej modułów i każdy moduł jest
odpowiedzialny za rozpoznanie (poprzez domen˛e A) pojedynczej czasteczki
˛
takiej
jak aminokwas oraz przekazanie jej na PCP, tego samego modułu, co prowadzi
do wydłużania si˛e peptydowego produktu syntezy. Domena kondensacji (C)
jest odpowiedzialna za formowanie si˛e wiazania
˛
peptydowego (C-N) pomi˛edzy
A
B
216
A
B
Streszczenie
wydłużajacym
˛
si˛e łańcuchem a zaaktywowanym aminokwasem. Natomiast podstawowe funkcje PKS sa˛ realizowane przez domeny: transferaz˛e acylowa˛ (AT), tiolacji
(T) oraz ketosyntaz˛e (KS). Domeny AT sa˛ odpowiedzialne za właczanie
˛
monomerów
malonylu lub metylomalonylo-CoA, domeny KS formuja˛ wiazanie
˛
w˛egiel-w˛egiel
(C-C). Domena acylowy nośnik protein (ACP) jest ekwiwalentem domeny PCP
budujacej
˛ NRPS.
Rozdział 1 opisuje bardziej szczegółowo obecny wglad
˛ w strukturalna˛ organizacj˛e
oraz enzymologi˛e syntetaz oraz syntaz (NRPS, PKS oraz NRPS/PKS) odpowiedzialnych za produkcj˛e wtórnych metabolitów w grzybach. Geny kodujace
˛ te wielofunkcyjne enzymy sa˛ cz˛esto nieekspresjonowane, dlatego ich produkty sa˛ trudne do
zidentyfikowania w mediach hodowlanych używanych w laboratoriach. Przeglad
˛
ostatnio opisanych strategii, które okazały si˛e skuteczne w aktywacji tych cichych
klasterów genowych sa˛ zaprezentowane w rozdziale 1. Ostatnimi laty rosnaca
˛
liczba zsekwencjonowanych genomów różnych grzybów przyczyniła si˛e do rozwoju wygodnych algorytmów bioinformatycznych umożliwiajacych
˛
identyfikacj˛e
genów oraz ich potencjalnych produktów odpowiadajacym
˛
metabolitom wtórnym.
Znaczacy
˛ post˛ep dotyczy również biologii molekularnej, gdzie usprawniono wiele
narz˛edzi inżynierii genetycznej. Metabolity wtórne kodowane przez klastery genów
sa˛ kontrolowane przez złożone powiazania
˛
regulacyjne na wielu poziomach. Manipulacja specyficznym dla danego klasteru lub działajacym
˛
globalnie białkiem regulatorowym może indukować biosyntez˛e produktów z nieznanych dotad
˛ szlaków.
Zaktywowanie produkcji metabolitów można osiagn
˛ ać
˛ również poprzez modyfikacj˛e chromatyny regulujac
˛ jej stan upakowania. Poprzez zmian˛e jej struktury ciche klastery genów zostaja˛ zaktywowane. Jednak najbardziej obiecujacym
˛
podejściem okazuje si˛e poznanie naturalnego środowiska wyst˛epowania grzybów strz˛epkowych. Zidentyfikowanie fizjologicznych i ekologicznych warunków kształtuja˛
cych ich nisze a także wyst˛epujacej
˛ tam komunikacji mi˛edzygatunkowej przyczynia si˛e do poznania bogactwa nieodkrytych dotad
˛ bioaktywnych zwiazków
˛
organicznych.
Szczepy przemysłowe P. chrysogenum stwarzaja˛ nowa˛ oparta˛ na komórce platform˛e
dla biosyntezy peptydów i ich pochodnych. Różne aspekty inżynierii wzmocniły
produkcj˛e metabolitów wtórnych, słabo lub nieekspresjonowanych w warunkach
standardowych. W rozdziale 2 regulator plejotropowy wtórnego metabolizmu w
grzybach strz˛epkowych - LaeA, który stanowi człon kompleksu velvet został nadekspresjonowany oraz zinaktywowany w szczepach przemysłowych P. chrysogenum.
Został zanalizowany profil transkrypcji genów kodujacych
˛
20 PKS oraz 11 NRPS
(w tym 2 HPN). Właczenie
˛
dodatkowych kopii genu laeA miało jedynie niewielki
wpływ na produkcj˛e β-laktamów, natomiast znacznie zmieniło transkrypcj˛e oraz
formowanie si˛e produktów innych szlaków biosyntetycznych. LaeA jest konstytutywnym białkiem jadrowym
˛
zawierajacym
˛
domen˛e metylotransferazy niezb˛edna˛ dla
jego funkcji. W rozdziale 3 omówiono zidentyfikowane w P. chrysogenum domnie-
Streszczenie
217
mane metylotransferazy o wysokiej homologii do metylotransferazy w białku LaeA
i nazwano je LaeA-like methyltransferases (Llm). Pojedyńczy oraz podwójny mutant został skonstruowany by oszacować rol˛e dwóch wysoko ekspresjonowanych
LaeA-like methyltransferases PcLlm7 oraz PcLlm3. Zaskutkowało to aktywacja˛ transkrypcji cichego genu pks11. Ekspresja pks11 była silnie zwi˛ekszona w podwójnym
mutancie delecyjnym, sugerujac,
˛ że obydwa enzymy działaja˛ jako negatywne regulatory wtórnego metabolizmu w P. chrysogenum. Aktywność tych PcLlms mogła
wzrastać w ramach programu klasyczne udoskonalania szczepu (CSI), poprzez
który osiagni˛
˛ eto zwi˛ekszana˛ produkcj˛e penicyliny, jednocześnie wyciszajac
˛ niektóre z pozostałych szlaków biosyntetycznych. Jednak w hodowlach tych szczepów
delecyjnych nie znaleziono żadnych nowych metabolitów. Przypuszczalnie jest
to wynikiem mutacji w genie pks11, która sprawiła, że enzym jest niefunkcyjny.
W przeciwieństwie do białka jadrowego
˛
LaeA, Llm sa˛ obecne w cytoplazmie i
wykazuja˛ znaczace
˛ oddziaływanie na metabolity wtórne jednak w sposób odwrotny
niż LaeA.
Wpływ deacetylazy histonów na formowanie si˛e metabolitów wtórnych został
opisany w rozdziale 4. Reorganizacja chromatyny jest zależna od aktywności
deacetylazy histonów a jednocześnie antagonistycznego odwracalnego działania acetylotransferazy histonów (HAT). Oddziaływanie DNA-histon czyni geny
niedost˛epne dla transkrypcji, gdyż zaburza przyłaczanie
˛
czynników transkrypcyjnych niezb˛ednych w ekspresji genów. Deacetylazy histonów (HDAC) odgrywaja˛ rol˛e w represji transkrypcji. Deacetylaza histonów HdaA wykazuje szerokie
spektrum aktywności regulatorowej wobec klasterów genów kodujacych
˛
wtórne
metabolity w P. chrysogenum, chociaż wyłacznie
˛
reguluje geny leżace
˛ na tym samym
chromosomie, odpowiadajacemu
˛
tutaj: contig 21. Usuni˛ecie ortologu deacetylazy
histonów klasy 2 hda1 Saccharomyces ceravisiae zaktywowało cichy klaster genów zawierajacy
˛ dwie syntazy poliketydowe (pks12, pks13), które wykazuja˛ wysoka˛ homologi˛e do szlaku biosyntetycznego citrinin w Monascus purpureus. Żółta toksyna "citrinin" została już wcześniej wyizolowana z gatunków Penicillium spp., jednakże
dotychczas nie opisano jej w P. chrysogenum. Podobny całkowity klaster z dwoma
przeciwnie zorientowanymi genami PKS został znaleziony w Trichoderma reesei,
produkujacym
˛
sorbicyliny (sorbicillins). Zaangażowanie tego ekspresjonowanego
klasteru w ∆hdaA w produkcj˛e "sorbicillins" lub "citrinin" może być tylko do końca
poznane po skorygowaniu tych dwóch mutacji punktowych w sekwencji kodujacej
˛
dwóch genów PKS, centralnych dla tego klasteru. Metabolit o nieznanym pochodzeniu został wykryty w zarodnikujacym
˛
medium R-agar przez HPLC. Pi˛eć genów
wtórnych metabolitów w ∆hdaA okazało si˛e negatywnie regulowanych na poziomie
transkrypcyjnym, przy czym klaster biosyntetyczny "chrysogine" obniżył produkcj˛e
"chrysogine" o 40%. Jednak biosyntetyczny szlak DHN-melaniny cz˛eściowo zklasterowany w genomie P. chrysogenum okazał si˛e najbardziej ewidentnym przykładem
regulacji poprzez HdaA. Zwiazany
˛
z tym klasterem PKS17: mutant nadekspresji
A
B
218
A
B
Streszczenie
wykazał zwi˛ekszona˛ produkcj˛e żółtego naphtho-γ-pyrone do medium, w przeciwieństwie do mutanta delecyjnego ∆pks17, gdzie kolor był nieobecny. Odporność na
stres oksydacyjny oraz integralność powierzchni zarodników znajduja˛ si˛e również
pod kontrola˛ epigenetycznej aktywności deacetylazy histonów, co zwiazane
˛
jest z
brakiem formowania pigmentu, gdzie obniżona jest ekspresja pks17.
Ze wzgl˛edu na swoje właściwości metabolity wtórne znalazły swoje zastosowanie
w wielu procesach fizjologicznych, niestety, sa˛ tylko produkowane w ściśle
określonych warunkach środowiska zdefiniowanych przez np.: czynniki chemiczne
tj.: reaktywne formy tlenu, warunki beztlenowe, pH, dost˛epność aminokwasów,
w˛egla, azotu lub brak dost˛epu do substancji odżywczych. Aby nada˛żyć ze zmieniajac
˛ a˛ si˛e dost˛epnościa˛ żelaza P. chrysogenum wykształcił system przyswajania żelaza
oparty na sideroforach, który został opisany w rozdziale 5. Wszystkie trzy typy
sideroforów (koprogeny, fusarininy oraz ferrichromy) produkowane przez grzyby
strz˛epkowe zostały zidentyfikowane w P. chrysogenum. Dodatkowo odkryto nowe,
przypuszczalnie siderofory o właściwościach kompleksujacych
˛
żelazo. Wszystkie
te siderofory sa˛ syntetyzowane przez trzy NRPS zależne szlaki biosyntetyczne
nazwane "Penicillium siderophore synthetases" (Pss): PssA, PssB, oraz PssC. PssA
jest enzymem składajacym
˛
si˛e ATCTC domen zbudowanym z 1900 aminokwasów,
jest kodowany przez gen Pc16g03850 (i) PssA jest odpowiedzialny za produkcj˛e koprogenu a także innych sideroforów hydroksamowych należacych
˛
do typu koprogenów. Delecja pssA oraz nast˛epujace
˛ profilowanie metabolitów wykazały utrat˛e
kwasu dimerumowego, koprogenu, koprogenu B oraz N-acetyl-fusarininy. Analiza mutanta delecyjnego AtcA (acetyltransferase of coprogen; Pc16g03890) wykazała
zwiazek
˛
tego enzymu z konwersja˛ koprogenu B do koprogenu. Podczas gdy rodzin˛e
koprogenów buduja˛ jednostki trans-fusarininy, rodzin˛e fusarinin sideroforów hydroksamowych buduja˛ jednostki cis-fusarinin. (ii) Biosynteza fusarinin (fusarininy
C, B oraz A) wymaga PssB. Ta NRP syntetaza o długości 2076 aminokwasów, składajaca
˛ si˛e ATCTC domen katalitycznych jest kodowana przez gen Pc22g20400. Obydwa szczepy mutantów ∆pssA oraz ∆pssB wykazały znaczne osłabienie wzrostu,
podczas hodowli w obecności zewn˛etrznego chelatora żelaza bathophenantroline
disulfide (BPS). Tego nie zaobserwowano dla szczepu delecyjnego trzeciego enzymu
PssC. (iii) Biosynteza trzeciego typu sideroforów hydroksamowych - ferichromów została przypisana do PssC. Na podstawie organizacji domen ATCATCTCATCTCT
składajacych
˛
si˛e na syntetaz˛e o długości 5267 aminokwasów wykazano produkcj˛e
ferrichromu, co potwierdzono poprzez delecj˛e genu. Geny pss sa˛ mocno ekspresjonowane w środowisku ubogim w żelazo oraz wykazuja˛ współregulacj˛e z innymi genami w klasterze. Bioinformatyczne analizy wykazały obecność ortologów
NRPS oraz ich klasterów w innych grzybach strz˛epkowych. Został również zbadany
zwiazek
˛
mi˛edzy biosynteza˛ penicyliny a sideroforami. Rezultatem niskiego st˛eżenia
żelaza była aktywacja biosyntezy sideroforów, obniżajac
˛ znacznie produkcj˛e penicyliny. Jednakże, efekt wywołany delecja˛ któregokolwiek z pss genów na produkcj˛e
Streszczenie
219
penicyliny okazał si˛e mało znaczacy.
˛
Analizowano również funkcj˛e dwóch potencjalnych "Penicillium siderophore transporters" (PstA and PstB), należacych
˛
do Siderophore-iron transporters (sit) podrodziny Major Facilitator Superfamily (MFS), które prawdopodobnie biora˛ udział
w opartym na sideroforach wychwycie żelaza.
Dodatkowo w rozdziale 6
poczyniono perspektywiczne analizy dotyczace
˛ dwóch transporterów sideroforów
prawdopodobnie należacych
˛
do rodziny "ABC multidrug transporters", nazwanych
tutaj "Penicillium siderophore multidrug transporter": PsmA and PsmB. Resultatem usuni˛ecia ich genów był brak kilku sideroforów w hodowli. Dlatego zaproponowano udział tych transporterów w wydzielaniu sideroforów. Dalsze badania
- z użyciem znacznika izotopowego - sa˛ konieczne by potwierdzić ich funkcj˛e. Zaobserwowano również interesujac
˛ a˛ zmian˛e barwy na niebieska˛ w hodowli mutanta
∆psmA. Przypuszczalnie, funkcja PsmA jest powiazana
˛
z homeostaza˛ jonów miedzi.
Genom P. chrysogenum koduje trzy NRPS oraz dwie HPN, które pozostaja˛ nieekspresjonowane w standardowych warunkach fermentacji. Rozmiar ich genów
przekracza 22.13 kbp, co wia˛że si˛e z technicznym wyzwaniem dla inżynierii genetycznej lub ekspresja˛ tych genów w innym organizmie heterologicznego gospodarza.
Powstawanie produktu na podstawie nadekspresji pojedyńczego genu biosyntetycznego wtórnych metabolitów zostało już potwierdzone. W rozdziale 7 rozpatrzono ta˛ możliwość używajac
˛ nadekspresjonowanych szczepów P. chrysogenum,
otrzymanych poprzez wprowadzenie silnego PpcbC promotora przed słabo lub
nieekspresjonowanymi nrps/hpns genami. Aby analizy były wiarygodne każdy gen
został również znokautowany, dajac
˛ odpowiednia˛ kontrol˛e. Ten sposób inżynierii
genetycznej ułatwiła obecność szlaku "non-homologous end joining" w szczepie
wyjściowym. Nadekspresja kodujacych
˛
NRPS oraz HPN genów dała odpowiedni
poziom transkyptów a także pojawiły si˛e nowe zwiazki
˛
organiczne wykazane w
profilu metabolitów. Niestety struktury tych nowo zidentyfikowanych czasteczek
˛
kwestionuja˛ ich bezpośrednie pochodzenie ze NRPS/HPN szlaków biosyntezy. Co
wi˛ecej, zaobserwowano zmiany produkcji już poznanych metabolitów. Dlatego dalsze badania sa˛ konieczne by zidentyfikować produkty syntezy tych NRPS/HPN.
Szczepy wykorzystane w powyższych badaniach maja˛ pochodzenie przemysłowe,
gdzie były poddawane kilkakrotnym działaniom programu CSI, właczaj
˛
ac
˛ mutagenez˛e. W szczepie modelowym klaster penicyliny został usuni˛ety by ułatwić detekcj˛e pozostałych produktów. CSI zmienił znacznie sieć powiaza
˛ ń regulacyjnych
poprawiajac
˛ jednocześnie produkcj˛e β-lactamów. Jako efekt uboczny tego procesu,
cz˛eść pozostałych szlaków metabolicznych pozostało wyciszonych. Pod tym wzgl˛edem, szczepy przemysłowe P. chrysogenum okazały si˛e nie koniecznie idealne dla
funkcjonalnej analizy szlaków wtórnych metabolitów, raczej wcześniejsze, szczepy
nieprzemysłowe, mogłyby stanowić lepsze źródło nowych zwiazków
˛
organicznych.
A
B
A
Analizy bioinformatyczne
-2000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
0
0.00 - 32.00
Identyfikacja klasterów genowych
1.18
DS17690
DS54555
2.87
1.72
1.22
4.32
6.54
10.84
MS/MS
6.47
9.82
14.40
13.43
11.36
15.37
Analizy chemoinformatyczne
Selekcja szczepów
DS54465
18.51
20.64
Figure A.5: Uproszczony przeglad
˛ poszukiwania leków opartych na wtórnych metabolitach.
Badania bioaktywności
Przeszukiwanie genomu
Pc16g13930
u A U
B
Pc21g10790
Pc13g14330
Fenotyp
Penicillium
chrysogenum
Ekspresja klasteru genów
bodźce
środowiskowe
inżynieria
genetyczna
epigenetyka
220
Streszczenie