Pobierz protokół

Nr kat. EM09, EM11
Wersja zestawu: 1.2014
Zestaw do izolacji RNA z tkanek
zwierzęcych oraz linii komórkowych
EXTRACTME® jest zastrzeżonym
znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09, EM11
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
I.
Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji
całkowitego RNA o wysokiej czystości z 1–30 mg tkanki (świeżej lub mrożonej)
oraz 104 – 107 komórek linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały
zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego
RNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
II.
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
RLys Buffer *
(RNA Tissue Lysis Buffer)
RW1 Buffer (conc.) **
(RNA Wash Buffer 1)
RW2 Buffer
(RNA Wash Buffer 2)
REB
(RNA Elution Buffer)
RNA Homogenizing Columns H
(kolumny homogenizacyjne)
RNA Purification Columns B
(kolumny wiążące)
Bead Beating Tubes***
(probówki z kulkami ceramicznymi)
Collection Tubes (2 ml)
25
100
250
3 IZOLACJE
IZOLACJI
IZOLACJI
IZOLACJI
(DEMO)
EM09-025
EM09-100
EM09-250
EM09-D
17 ml
68 ml
170 ml
2 ml
9 ml
36 ml
90 ml
2 ml ****
29 ml
116 ml
290 ml
3,5 ml
2,5 ml
2 x 5 ml
5 x 5 ml
0,3 ml
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
* Bezpośrednio przed izolacją do RLys Buffer należy dodać 100% ß-merkaptoetanolu
do końcowego stężenia 1%. Trwałość RLys Buffer po dodaniu ß-merkaptoetanolu
wynosi 4 tygodnie w temp. 2–8⁰C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej
partiami, należy przenieść odpowiednią do izolacji ilość RLys Buffer do osobnej
butelki (wolnej od RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol. Po dodaniu ß-merkaptoetanolu
zalecane jest oznaczenie butelki.
3
Przed pierwszym użyciem do RW1 Buffer należy dodać odpowiednią ilość
96–100% etanolu (informacja na etykietach oraz w tabeli na następnej stronie).
**
Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki.
Wchodzą w skład zestawu EXTRACTME TOTAL RNA PLUS (EM11).
***
****
Uwaga: w zestawie DEMO (EM09–D) RW1 Buffer zawiera już etanol.
25
100
250
3 IZOLACJE
IZOLACJI
IZOLACJI
IZOLACJI
(DEMO)
EM09-025
EM09-100
EM09-250
EM09-D
RLys Buffer
17 ml
68 ml
170 ml
2 ml
100% ß-merkaptoetanol
170 µl
680 µl
1,7 ml
20 µl
RW1 Buffer
9 ml
36 ml
90 ml
2 ml
Etanol 96-100%
9 ml
36 ml
90 ml
-
18 ml
72 ml
180 ml
2 ml
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
Całkowita objętość
Bufory RLys, RW1, REB należy przechowywać w temp. +4⁰C.
Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw
zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy.
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
www.dnagdansk.com
etanol 96–100% cz.d.a.
100% ß-merkaptoetanol (ß-ME)
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml) wolne od RNaz
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
(wolne od RNaz)
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5–2 ml (> 11 tys. x g)
worteks
statywy mrożeniowe (temp. <7°C) na probówki 1,5–2 ml lub kuwety
umożliwiające trzymanie probówek w warunkach chłodniczych
4
Nr kat. EM09, EM11
Opcjonalnie
pp nożyczki, skalpel
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
probówki z kulkami ceramicznymi wolne od RNaz (nr kat. HPLM100)
(lub w zestawie EXTRACTME TOTAL RNA PLUS, nr kat. EM11)
homogenizator tkankowy na probówki 2 ml
homogenizator nożowy
termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm
moździerz z gładkim wylewem (50–75 ml) z dopasowanym pistonem
ciekły azot
worteks z przystawką na probówki 2 ml
wirówka na falkony 10–15 ml (linie komórkowe)
woda utleniona 3% lub roztwór podchlorynu sodu <0,5%
IV. ZASADA IZOLACJI
Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA opiera się na zdolności złóż krzemionkowych
do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli
chaotropowych. Procedura oczyszczania RNA składa się z 6 etapów i jest
przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych. Pierwszym
etapem jest homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację połączeń
międzykomórkowych (tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację białek
wysokocząsteczkowych (tkanka mięśniowa, łączna). Następnie homogenat
poddawany jest lizie chemicznej z wykorzystaniem rodanku guanidyny
oraz detergentów. Obecne w materiale tkankowym RNazy inaktywowane
są poprzez zastosowanie wysokiego stężenia rodanku guanidyny oraz
1% ß-merkaptoetanolu. Wirowanie oraz przepuszczenie supernatantu przez
kolumnę homogenizacyjną umożliwia eliminację niezlizowanych fragmentów
tkanki/komórek. Immobilizacja RNA na kolumnie wiążącej następuje dzięki
dodatkowi etanolu. Trzyetapowe przemywanie RNA związanego do złoża
minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów
reakcji enzymatycznych. Oczyszczone RNA eluowane jest ze złoża buforem
o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą wolną od RNaz (pH 7,0–9,0) i jest
gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej,
takich jak RT–PCR, RT–qPCR i Northern blotting.
5
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME TOTAL RNA testowana
jest według opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji
i oczyszczania RNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz
elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego RNA
sprawdzana jest w reakcji qPCR poprzedzonej reakcją odwrotnej transkrypcji.
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
MATERIAŁ WYJŚCIOWY
pp
pp
pp
tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80⁰C): 1–30 mg,
tkanka przechowywana w buforach inaktywujących RNazy: 1–30 mg
linie komórkowe: 104 –107 komórek
WYDAJNOŚĆ IZOLACJI RNA
Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego
podane są w sekcji XIII.
POJEMNOŚĆ ZŁOŻA
ok. 90 µg RNA
CZAS IZOLACJI
pp
pp
pp
16–20 min (po etapie lizy lub w przypadku braku homogenizacji dla linii
komórkowych)
30–60 min w przypadku homogenizacji w ciekłym azocie
30–40 min w przypadku homogenizacji mechanicznej (kulki ceramiczne)
CZYSTOŚĆ RNA
A260/A280 = 1,9-2,1
www.dnagdansk.com
6
Nr kat. EM09, EM11
VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
pp
pp
pp
pp
pp
pp
Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na
potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji
zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem
tkankowym należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych
materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy
bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać
ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi.
W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną
powierzchnię zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem
podchlorynu sodu.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
śladów RNA lub zanieczyszczeń pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Ilość materiału wyjściowego
Jeśli istnieje konieczność izolacji całkowitego RNA z większej ilości materiału
(>30 mg, >107 komórek), należy tak zwiększyć ilość buforu RLys oraz rozdzielić
na większą ilość minikolumn, aby nie przekroczyć maksymalnej wielkości
30 mg tkanki (lub 107 komórek) na minikolumnę. Przekroczenie tej wartości
może spowodować zatkanie się kolumny homogenizacyjnej H lub/i uzyskanie
zanieczyszczonego RNA.
Pobieranie i przechowywanie prób do izolacji RNA
Kluczowym elementem dobrej jakościowo i ilościowo izolacji RNA jest
rygorystyczna procedura pobierania i przechowywania materiału biologicznego.
Materiał po uzyskaniu (pobraniu) należy utrwalić poprzez mrożenie
(-80⁰C lub w ciekłym azocie) lub przechowywać w buforach chroniących
RNA (np. RNAlater ®, Ambion) w temp. -20⁰C. W przypadku większości tkanek
granicznym momentem jest 30 minuta od momentu pobrania, natomiast
w przypadku tkanek bogatych w RNazy (trzustka, wątroba), tkankę należy
natychmiast utrwalić.
7
Najlepsze efekty izolacji RNA z linii komórkowych uzyskuje się ze świeżych
komórek. W przypadku późniejszej pracy, po odwirowaniu należy odrzucić
pożywkę znad osadu komórek i mrozić w temp. -80⁰C lub w ciekłym azocie (LN2).
Eliminacja RNaz
RNazy są bardzo aktywnymi enzymami, niewymagającymi kofaktorów
do aktywacji oraz odpornymi na autoklawowanie w temp. 121⁰C przez 15 min.
W celu wykluczenia możliwości degradacji RNA przez RNazy należy zastosować
się do następujących zaleceń:
a. Zawsze stosować jednorazowe rękawiczki lateksowe/winylowe/nitrylowe
podczas pracy. Nie należy dotykać innych rzeczy niż bezpośrednio
związanych z izolacją RNA.
b. Próby na każdym etapie izolacji (w miarę możliwości również wirówka)
powinny zachować temp. 2–8⁰C. Najlepiej korzystać ze statywów
mrożeniowych, ze względu na kontaminację lodu RNazami. Wyizolowane
RNA należy obowiązkowo niezwłocznie wstawić do statywu mrożeniowego.
c. Plastiki zużywalne (tipsy, probówki) należy stosować wolne od RNaz,
lub też autoklawować w temp. 134⁰C przez 18–20 min.
d. Plastiki niezużywalne, szkło, porcelana: moczyć przez noc w roztworze
0,1 N NaOH/0,1% woda DEPC (lub woda wolna od RNaz), a następnie płukać
wodą DEPC lub wodą wolną od RNaz. Szkło i porcelanę (moździerze) w miarę
możliwości prażyć w temp. 150–240⁰C przez 2–4 h, następnie schłodzić
do temp. pokojowej.
e. Za pomocą 3% H2O2 lub <0,5% podchlorynu sodu (lub komercyjnie
dostępnych płynów inaktywujących RNazy) należy przetrzeć: blaty, pipety,
wirówkę (rotor osobno), statywy do probówek. Przed traktowaniem płynami
należy wykonać próbę, czy nie następuje reakcja z materiałami odkażanymi.
Elucja RNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego REB (RNA Elution Buffer) należy dobrać
w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego
poziomu stężenia RNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–50 μl REB przy izolacji
z 2–10 mg tkanki lub <104 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego
do 100 μl w przypadku izolacji z 10–30 mg tkanki lub 10 4 –107 komórek.
Jeśli pożądane jest otrzymanie RNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze,
że obniży to wydajność odzysku RNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie
buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W przypadku pracy z większą ilością materiału (niezalecane ze względu
na możliwość zatkania kolumn), możliwe jest odzyskanie całkowitego
RNA z minikolumny poprzez przeprowadzenie dodatkowej elucji (100 μl).
www.dnagdansk.com
8
Nr kat. EM09, EM11
W tym przypadku należy powtórzyć punkty 16–19 Protokołu izolacji, umieszczając
minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
Bufor elucyjny REB nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać
w niektórych reakcjach enzymatycznych.
Zanieczyszczenie DNA
Każdy materiał biologiczny podlegający izolacji RNA zawiera DNA. Żadna z obecnie
stosowanych metod izolacji RNA nie gwarantuje usunięcia 100% DNA bez
zastosowania metod enzymatycznych (DNaza) po izolacji RNA. Nawet śladowe
zanieczyszczenie DNA (rzędu kilku kopii gDNA na próbę) może spowodować
uzyskanie fałszywie pozytywnych wyników w reakcji qPCR (po etapie odwrotnej
transkrypcji). W celu wyeliminowania tego zagrożenia, proponujemy zastosowanie
komercyjnie dostępnych metod enzymatycznego usuwania DNA po izolacji RNA
(np. termolabilna dsDNaza, nr kat. EN32). W przypadku Eukaryota zalecamy
projektowanie układów qPCR niewrażliwych na zanieczyszczenia DNA (startery
obejmujące sąsiednie egzony lub z intronem >1,5 kpz).
Pienienie buforu RLys
Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może
dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas
etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu
usunięcia piany, probówkę należy wirować 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g).
IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
3.
4.
9
Każdy z odczynników zestawu należy dobrze wymieszać. Nie należy mieszać
zbyt intensywnie RLys Buffer.
Należy upewnić się czy do RW1 Buffer został dodany etanol. Jeśli nie,
należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na
etykietach oraz w tabeli w sekcji II).
Bezpośrednio przed izolacją RNA do RLys Buffer należy dodać
100% ß-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 1%. Trwałość
RLys Buffer po dodaniu ß-ME wynosi 4 tygodnie w temp. 2–8⁰C.
Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy przenieść
odpowiednią do izolacji ilość RLys Buffer do osobnej butelki (wolnej od
RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol.
W przypadku wytrącenia osadu w buforach RLys lub RW1, butelkę
z roztworem należy ogrzać do temp. 37°C (RW1 Buffer) lub temp. 50°C
(RLys Buffer) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając
co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
5.
Przygotować statyw mrożeniowy, odpowiednie plastiki wolne od RNaz
oraz pozostałe elementy stanowiska do pracy z RNA.
6.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
X.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA
Ilość: 1–30 mg
Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie
Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji
Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze
fragmenty. W zależności od stopnia fragmentacji oraz rodzaju tkanki, przejść
do wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do pkt. 1 Protokołu
izolacji (sekcja XI).
Ciekły azot (LN2)
1. Zamrożoną w LN2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym
moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie
rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć.
2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 600 μl RLys
Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku,
zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 600 μl RLys Buffer
i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml),
nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki.
Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego
1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl RLys Buffer, homogenizować
ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora.
2. Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą
3.
www.dnagdansk.com
500 μl RLys Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
10
Nr kat. EM09, EM11
Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych
(polecamy zestaw EXTRACTME TOTAL RNA PLUS, nr kat. EM11, w skład którego
wchodzą dodatkowo probówki z kulkami - Bead Beating Tubes)
1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 200 μl RLys Buffer
i przenieść pociętą tkankę.
2. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez
30 s przy 5–6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności.
W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki
spowodowanej pienieniem buforu, probówkę zwirować przez 2 min przy
10 tys. rpm (11 tys. x g).
W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić
korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy
maksymalnych obrotach.
3. Dodać 400 μl RLys Buffer i wymieszać przez pipetowanie.
4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
B. LINIE KOMÓRKOWE
Ilość: 10 4 –107 komórek
Materiał: świeże lub mrożone (-80°C lub -196°C) linie komórek adherentnych
lub zawiesinowych.
1.
2.
3.
4.
11
Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37°C lub RT. Komórki w pożywce lub
PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm
(ok. 3 tys. x g). Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się
zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy
1 ml zimnego PBS.
Dodać 600 μl RLys Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie
30 s, a następnie pipetowanie.
Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty)
i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~107)
mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w RLys Buffer. Należy wtedy
rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką ≥1000 ml
lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet.
Całość przenieść do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2 ml).
Dodać 600 μl RLys Buffer. Worteksować przez 60 s.
W przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez 1-2 min przy
10 tys. rpm (11 tys. x g). Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi.Wirować
2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g).
2. S upernatant (≥600 μl) przenieść do minikolumny
homogenizacyjnej H umieszczonej w probówce odbierającej
(2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g).
Zachować przesącz.
W przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy
ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając końcówkę
pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu
kulkami) i delikatnie pobrać supernatant. Resztki tkanki powinny być widoczne
na jednej ze ścianek lub na dnie probówki.
W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części
minikolumny, należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy prędkości
≥14 tys. rpm (≥ 21 tys. x g). Jeśli to nie pomaga, prawdopodobnie materiał
nie uległ poprawnej homogenizacji lub trawienie było zbyt krótkie lub
wyjściowego materiału tkankowego było zbyt dużo.
3. Do przesączu dodać 600 μl 96-100% etanolu. Wymieszać
przez pipetowanie lub worteksowanie 5 s.
4. Przenieść do minikolumny wiążącej B umieszczonej w probówce
odbierającej (2 ml). 5. Wirować 1 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). 6. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej.
7. Do minikolumny dodać 650 μl RW1 Buffer i wirować 1 min
przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
8. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
www.dnagdansk.com
12
Nr kat. EM09, EM11
9. Do minikolumny dodać 650 μl RW2 Buffer i wirować 30 s
przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
11. Do minikolumny dodać 500 μl RW2 Buffer i wirować 30 s
przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
12. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
13. Wirować 1-2 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych
reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne
jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji.
14. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
15. Nanieść 50-100 μl buforu elucyjnego REB centralnie na złoże
w minikolumnie.
Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie
20-200 µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji
VIII. Szczególne zalecenia i uwagi.
16. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min.
17. Wirować 2 min przy 8-10 tys. rpm (7-11 tys. x g).
18. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane RNA umieścić
w statywie mrożeniowym. Wyizolowane RNA przechowywać
w temp. -80°C lub -20°C do czasu dalszych analiz.
13
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji RNA.
Tkanka źle przechowywana lub
utrwalona – degradacja RNA.
Przechowywać tkankę w -80°C nie dłużej
niż rok. W przypadku stosowania buforu
utrwalającego do przechowywania tkanek,
upewnić się, że jest on dobrej jakości, a warunki
przechowywania odpowiednie.
Zbyt mała ilość
materiału wyjściowego.
Zwiększyć ilość materiału wyjściowego.
Tkanka
nieprawidłowo rozdrobniona.
Upewnić się, że tkanka została odpowiednio
zhomogenizowana w RLys Buffer. Tkankę
należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze
fragmenty, a następnie dobrać odpowiednią
metodę homogenizacji.
Zatkana minikolumna.
Patrz „Zatkana minikolumna H lub B”.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Niskie stężenie RNA.
Zbyt duża objętość
buforu elucyjnego.
Zmniejszyć objętość buforu elucyjnego REB do
20-50 μl.
Zatkana minikolumna
H lub B.
Materiał niewystarczająco
rozdrobniony.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Przeniesienie osadu
komórkowego na kolumnę H.
Ostrożnie przenieść supernatant bez naruszania
resztek komórek (osadu).
Przeładowanie
minikolumny H lub B.
Nie przekraczać zalecanej ilości
materiału wyjściowego.
Tkanka zbyt stara.
Używać tkanek świeżych lub
odpowiednio utrwalonych.
Tkanka kilkukrotnie rozmrażana.
Unikać cykli zamrażanie-rozmrażanie.
RNA fizycznie zdegradowane/
zbyt gwałtowna homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Zbyt duża ilość materiału
wyjściowego.
Zmniejszyć ilość materiału wyjściowego. Opcjonalne
trawienie DNazą po izolacji RNA.
Niewłaściwa
homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA.
Zdegradowane RNA.
Kontaminacja DNA.
www.dnagdansk.com
14
Nr kat. EM09, EM11
XIII. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO
MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO MATERIAŁ
Masa/ilość
V elucji
Stężenie RNA
A 260/A 280
Ilość RNA
Linie komórkowe
HCT116
107
100 μl
947,2 ng/μl
2,09
94,72 μg
Linie komórkowe
HCT116
104
100 μl
328,3 ng/μl
2,03
32,83 μg
Nerka
30 mg
100 μl
923,6 ng/μl
2,07
92,36 μg
Nerka
10 mg
100 μl
319,3 ng/μl
1,88
31,93 μg
Rak nerki
30 mg
100 μl
534,6 ng/μl
2,04
53,46 μg
Rak nerki
15 mg
100 μl
467,9 ng/μl
1,91
46,79 μg
Jelito grube
10 mg
100 μl
168,8 ng/μl
2,14
16,88 μg
Rak jelita grubego
30 mg
100 μl
603,7 ng/μl
2,06
60,37 μg
XIV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
RLys BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H312, H315, H319, P273, P280,
P305+P351+P338, P302+P352
RW1 BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H312, H332, P273, P302+P352
RW2 BUFFER
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336, P210, P233, P305+P338
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu.
H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może
wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala
od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie
wzbronione. P233 Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. P273 Unikać
uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/
ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ
DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe,
jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P302 + P352 W PRZYPADKU
DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem.
www.dnagdansk.com