Małgorzata B. Gawlik, Elz˙bieta Twardowska, Małgorzata Trawa

BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XL, 2007, 3, str. 279 – 285
Małgorzata B. Gawlik, Elżbieta Twardowska,
Małgorzata Trawa, Maciej Gawlik
WPŁYW KWASU SALICYLOWEGO
NA RÓWNOWAGE˛ PRO-/ANTYOKSYDACYJNA˛
W WARUNKACH WYSOKICH STE˛ŻEŃ GLUKOZY
W KRWINKACH CZERWONYCH CZŁOWIEKA
W BADANIACH IN VITRO
Katedra Toksykologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
Kierownik: prof. dr hab. J. Brandys
W przeprowadzonych badaniach ludzkie erytrocyty inkubowano z buforem zawieraja˛cym glukoze˛ w zakresie ste˛ż. 72,9 – 354,1 mg %. Po upływie 18 godz. oceniano zmiany
równowagi pro-/antyoksydacyjnej mierza˛c poziom powstałego MDA oraz zmiany w aktywności SOD. Dalsza inkubacja zawiesiny krwinek z kwasem salicylowym powodowała
zmiany w aktywności SOD oraz wzrost protekcji krwinek przed dodatkowym czynnikiem
utleniaja˛cym którym w zastosowanym eksperymencie był nadtlenek kumenu. Wysokie
ste˛żenie glukozy hamowało ten efekt.
Hasła kluczowe: hiperglikemia, cukrzyca, krwinki czerwone człowieka, stres
oksydacyjny, kwas salicylowy.
Key words: hyperglycemia, diabetes, human red blood cells, oxidative stress,
salicylic acid.
Cukrzyca należy do grupy chorób metabolicznych powia˛zanych z utrzymuja˛ca˛
sie˛, patologicznie podwyższona˛ hiperglikemia˛, wynikaja˛ca˛ z upośledzenia regulacyjnego wpływu insuliny. Efektem długotrwałej ekspozycji na hiperglikemie˛ jest
stres oksydacyjny (1, 2, 3, 4). Glukoza reaguje z białkami i lipoproteinami na
drodze nieenzymatycznej glikacji oraz ulega autoksydacji, co prowadzi do powstania wolnych rodników. Działanie wolnych rodników jest neutralizowane przez
naturalny system obrony antyoksydacyjnej. System ten złożony jest z wielu
czynników o charakterze enzymatycznym i nieenzymatycznym, które hamuja˛
oksydacje˛ cza˛steczek oraz struktur komórkowych. Jednym z istotnych czynników
bariery antyoksydacyjnej jest miedzio i cynko zależna dysmutaza ponadtlenkowa
(Cu, ZnSOD).
W prewencji i terapii schorzeń naczyń krwionośnych, które wyste˛puja˛ jako
powikłania cukrzycy ma zastosowanie kwas acetylosalicylowy (5, 6). Wykazano,
że powstaja˛cy z niego kwas salicylowy ma zdolność usuwania wolnych rodników
tlenowych i hydroksylowych oraz powoduje hamowanie zależnej od COX generacji
anionorodnika ponadtlenkowego (7). Wpływa także na zwie˛kszenie poziomu
katalazy. Anionorodnik ponadtlenkowy spontanicznie utlenia tlenek azotu wy-
280
M.B. Gawlik i inni
Nr 3
twarzany przez śródbłonek do form nieaktywnych, obniżaja˛c naczyniorozkurczowy
potencjał czynnościowy (5, 8, 9).
Jednak wyniki niektórych badań wskazuja˛ na to, że salicylany nie zmiataja˛,
a biora˛ udział w tworzeniu wolnych rodników (10, 11, 12, 13). Sta˛d w przedstawionej pracy podje˛to próbe˛ oceny własności pro-/antyoksydacyjnych kwasu
salicylowego w modelu in vitro z zastosowaniem krwinki czerwonej człowieka,
narażonej na działanie różnych ste˛żeń glukozy.
Krwinki czerwone ze wzgle˛du na budowe˛ błony komórkowej zbliżona˛ strukturalnie do błon komórek śródbłonka stanowia˛ dogodny model w badaniach efektów
działania wolnych rodników. W błonach krwinek czerwonych wyste˛puja˛ duże
ste˛żenia nienasyconych kwasów tłuszczowych, które pod wpływem czynników
utleniaja˛cych generuja˛ wiele produktów, których obecność świadczy o zaistniałym
stresie oksydacyjnym. Jednym z takich produktów jest łatwo mierzalny dialdehyd
malonowy (MDA). Krwinki czerwone biora˛ również udział w transporcie niektórych leków jak np. kwasu salicylowego (8, 14).
W prezentowanych badaniach in vitro oceniono wpływ glukozy i kwasu
salicylowego na potencjał antyoksydacyjny krwinki czerwonej człowieka, którego
miara˛ była aktywność SOD oraz poziom MDA. Oceniono także podatność na
peroksydacje˛ badanych krwinek eksponowanych na działanie glukozy i kwasu
salicylowego. Zmiana podatności krwinek na utlenianie wywoływane przez utleniacze zewne˛trzne, może być uważana za miare˛ właściwości pro-/antyoksydacyjnych
czynników obecnych w układzie, w tym przypadku kwasu salicylowego w warunkach eksperymentu. W badaniach zastosowano utleniacz, nadtlenek kumenu,
zwia˛zek efektywnie inicjuja˛cy procesy peroksydacji wielonienasyconych kwasów
tłuszczowych błony komórkowej, wynikiem czego jest wzrost powstawania MDA
(15). Proces ten może być zahamowany przez czynniki o charakterze antyoksydacyjnym.
CZE˛ŚĆ DOŚWIADCZALNA
Odczynniki: glukoza, odczynnik Drabkina prod. POCH Gliwice, kwas salicylowy prod. Aldrich,
dialdehyd malonowy prod. Merck, kwas tiobarbiturowy, bufor fosforanowy z chlorkiem sodu (PBS)
prod. Sigma, epinefryna, prod. ICN.
Aparatura: spektrofotometr Genesis 2PC prod. Spectronic, wirówka laboratoryjna MPW-350R prod.
MPW Med. Instruments.
B a d a n i e w p ł y w u g l u k o z y i k w a s u s a l i c y l o w e g o n a a k t y w n o ś ć S O D
i poziom MDA
W badaniach wykorzystano trzykrotnie przemyte sola˛ fizjologiczna˛ ludzkie erytrocyty pochodza˛ce od
zdrowych osób zebrane w jednorodna˛ pule˛. Przygotowano roztwory glukozy w buforze PBS. Ste˛żenie
cukru zmierzono z zastosowaniem spektrofotometrycznej metody o-toluidynowej. Otrzymane roztwory
glukozy mieszano z erytrocytami uzyskuja˛c serie prób o hematokrycie równym 40%. Ste˛żenie heksozy
w buforze nad erytrocytami w 4 seriach prób wynosiło 72,9; 126,2; 280,1 i 354,1 mg %. Imitowały one
kolejno: prawidłowy poziom glukozy w krwi, przekroczona˛ glikemie, oraz poziom wyste˛puja˛cy
w cukrzycy (16). Każda seria składała sie˛ z 15 niezależnych prób.
Wszystkie próby inkubowano przez 18 godz. w temp. 37°C bez doste˛pu światła delikatnie mieszaja˛c.
Po tym czasie 5 prób z każdej serii zawieraja˛cej określone ste˛żenie glukozy wirowano z przyśpieszeniem
1000 × g. W warstwie buforowej oznaczano ste˛żenie glukozy, a w erytrocytach oznaczano poziom MDA
z wykorzystaniem metody spektrofotometrycznej wg Stocks’a (17) i aktywność SOD wg metody opartej
na hamowaniu samoutleniania adrenaliny do adrenochromu (18).
Nr 3
Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna
281
Pozostałe 10 prób z każdej serii zawiesin erytrocytów wirowano z przyśpieszeniem 500 × g i cze˛ść
buforu znad krwinek przenoszono do probówek, w których mieściła sie˛ sucha pozostałość kwasu
salicylowego, jaka została po odparowaniu metanolu z roztworu o odpowiednim ste˛żeniu. Bufor wraz
z kwasem salicylowym powtórnie ła˛czono z krwinkami. W badanych zawiesinach erytrocytów ste˛żenie
kwasu salicylowego wynosiło 30 mg %. Przygotowane zawiesiny krwinek zawieraja˛ce lek inkubowano
przez 10 min. (5 prób z każdej serii) i 30 min. (5 prób z każdej serii). Po tych czasach, zawiesiny
wirowano (1000 × g) i w erytrocytach oznaczano poziom MDA i aktywność SOD.
B a d a n i e p o d a t n o ś c i e r y t r o c y t ó w p o i n k u b a c j i z g l u k o z a˛ i k w a s e m
s a l i c y l o w y m n a p e r o k s y d a c j e˛ l i p i d ó w i n d u k o w a n a˛ n a d t l e n k i e m
kumenu
Kolejne, niezależnie przygotowane zawiesiny krwinek w identyczny sposób jak opisano powyżej
(poddane przez 18 godz. działaniu glukozy w różnych ste˛żeniach, do których naste˛pnie dodano kwas
salicylowy o ste˛ż. 30 mg % i inkubowano przez kolejne 10 i 30 min.) wirowano (1000 × g), odrzucano
bufor i krwinki przemywano trzykrotnie sola˛ fizjologiczna˛. Z uzyskanych erytrocytów przygotowywano
ich 10% zawiesine˛ w buforze PBS. Do każdej zawiesiny w celu inicjacji peroksydacji lipidów błony
erytrocytów dodawano 25 μl nadtlenek kumenu (66 mM) i inkubowano przez 1 godz. w temp. 25°C.
W zawiesinie erytrocytów oznaczano poziom MDA przed i po ekspozycji na zastosowany utleniacz.
O c e n a s t a t y s t y c z n a w y n i k ó w
Porównania pomie˛dzy badanymi próbami wykonano z zastosowaniem testu t odpowiednio dla prób
zależnych i niezależnych z wykorzystaniem programu komputerowego STATISTICA.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Hiperglikemia to stan, w którym ste˛żenie glukozy ulega podwyższeniu głównie wskutek upośledzenia
regulacyjnego wpływu insuliny. Przekroczenie ste˛żenia glukozy w osoczu na czczo powyżej 6,1
mmol/dm3 (110 mg/dl) aż do osia˛gnie˛cia wartości 7,0 mmol/dm3 (126 mg/dl) określany jest mianem
hiperglikemii. W przedstawionym badaniu krwinki poddane były działaniu glukozy o ste˛żeniu
prawidłowym (72,9 mg %) o ste˛żeniu imituja˛cym przekroczona˛ glikemie˛ (126,2 mg %) i o znacznym
przekroczeniu imituja˛cym poziom wyste˛puja˛cy w cukrzycy (280,1 i 354,1 mg %).
Po 18 godz. inkubacji krwinek w roztworach glukozy obserwowano hemolize˛ (mierzona˛ poziomem
hemoglobiny metoda˛ Drabkina w buforze nad krwinkami) nie przekraczaja˛ca˛ 5%. Nie stwierdzono
istotnych statystycznie różnic w poziomie hemolizy pomie˛dzy badanymi seriami.
Krwinki czerwone zawieszone w buforze zawieraja˛cym glukoze˛ w zakresie ste˛żeń od 72,9 do 354,1
mg % w okresie 18 godz. inkubacji zużywały cukier, którego poziom w tym czasie obniżył sie˛ o ok. 50%
(ryc. 1).
Ryc. 1. Ste˛żenie glukozy w buforze przed i po 18-godzinnej inkubacji z krwinkami.
Fig. 1. The level of glucose in the buffer before and after 18-h incubation with erythrocytes.
282
M.B. Gawlik i inni
Nr 3
Przedstawione poniżej wyniki z oznaczeń ste˛żenia MDA i aktywności SOD przypisano do odpowiednich wyjściowych ste˛żeń glukozy jakie były w buforze przed rozpocze˛ciem inkubacji.
Pod wpływem 18 godz. oddziaływania glukozy, także na poziomie prawidłowej glikemii, w krwinkach czerwonych stwierdzono podwyższony poziom peroksydacji lipidów, czego wynikiem jest istotny
wzrost poziomu MDA, w porównaniu do oznaczanego w chwili rozpocze˛cia inkubacji. Poziom tego
markera jest podobny, niezależny od ste˛żenia glukozy w badanych zawiesinach (ryc. 2).
Ryc. 2. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na powstawanie MDA w zawiesinie krwinek.
Fig. 2. Effect of glucose and salicylic acid on MDA formation in the red blood cells suspension.
Kwas salicylowy, główny metabolit kwasu acetylosalicylowego powstaja˛cy na drodze jego hydrolizy,
wia˛że sie˛ z albuminami osocza i działa w obre˛bie tkanek do których zostanie przetransportowany.
Wyniki badań in vitro wskazuja˛, że substancja ta szybko przenika do krwinek czerwonych i stan
równowagi osia˛gany jest w czasie 1 – 5 min. (14). W środowisku buforu, po osia˛gnie˛ciu stanu
równowagi kwas salicylowy mniej wie˛cej równomiernie rozmieszcza sie˛ pomie˛dzy bufor i krwinki.
Dodanie kwasu salicylowego w ste˛żeniu terapeutycznym do zawiesiny krwinek poddanych 18 godz.
działaniu glukozy o normalnym i wysokim ste˛żeniu glukozy nie wpłyne˛ło znacza˛co na poziom MDA
przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji (ryc. 2).
Zwie˛kszenie aktywności SOD jest jednym z mechanizmów przeciwutleniaja˛cego działania kwasu
salicylowego i jego pochodnych (5, 6). Uzyskane wyniki w przedstawionych badaniach własnych
dotycza˛ce aktywności SOD w krwinkach poddanych działaniu glukozy moga˛ świadczyć, że enzym ten
odgrywa istotna˛ role˛ w ochronie erytrocytów poddanych działaniu glukozy (4, 19). Aktywność tego
enzymu istotnie zmniejszyła sie˛ w zawiesinach krwinek zawieraja˛cych glukoze˛ w zakresie ste˛ż. od 126,2
do 280,1 mg % w porównaniu zarówno do aktywności enzymu w tej samej zawiesinie krwinek przed
rozpocze˛ciem inkubacji jak i w stosunku do zawiesiny z prawidłowym ste˛żeniem glukozy. Najwyższe
badane ste˛żenie glukozy 354,1 mg % spowodowało istotny spadek aktywności SOD w porównaniu do
aktywności enzymu w tej samej zawiesinie krwinek, ale w przeciwieństwie do pozostałych grup
z podwyższonym ste˛żeniem glukozy spowodowało wzrost w stosunku do zawiesiny z prawidłowym
ste˛żeniem glukozy (ryc. 3).
W erytrocytach poddanych 18 godz. działaniu glukozy w zakresie ste˛żeń od 72,9 do 126,2 mg % oraz
kwasu salicylowego o ste˛ż. 30 mg % przez kolejne 10 min. doszło do znamiennego wzrostu aktywności
SOD w stosunku do erytrocytów, na które oddziaływała tylko glukoza. Dłuższa 30 min. inkubacja
Nr 3
Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna
283
Ryc. 3. Wpływ glukozy i kwasu salicylowego na aktywność SOD w krwinkach czerwonych.
Fig. 3. Effect of glucose and salicylic acid on SOD activity in red blood cells.
krwinek z kwasem salicylowym spowodowała, że aktywność SOD istotnie zmalała w porównaniu do
oznaczanej po 10 min. inkubacji.
W zawiesinie erytrocytów narażonych na 18 godz. oddziaływanie glukozy w ste˛żeniu pocza˛tkowym
280,1 mg % i poddanej przez kolejne 10 i 30 min. inkubacji z kwasem salicylowym stwierdzono istotny
wzrost aktywności SOD w porównaniu do zawiesiny narażonej tylko na działanie glukozy. Inkubacja
z kwasem salicylowym krwinek narażonych na wysokie ste˛żenie glukozy 354,1 mg % nie spowodowała
znacza˛cych zmian w aktywności SOD w stosunku do krwinek narażonych tylko na działanie glukozy.
Obserwowane zmiany w aktywności SOD moga˛ świadczyć o tym, że kwas salicylowy wpływa na
bariere˛ antyoksydacyjna komórki w zakresie zmian potencjału enzymatycznego w zależności od ste˛żenia
glukozy. Wzrost aktywności SOD w stosunku do erytrocytów narażonych na niższe ste˛żenia glukozy
wskazuje na wyraźna˛ poprawe˛ potencjału obronnego komórki pod wpływem kwasu salicylowego.
W warunkach eksperymentu zmiana ta nie miała charakteru trwałego. Po dłuższym czasie inkubacji
zanotowano spadek aktywności enzymu. Wyższe ste˛żenia glukozy moga˛ tłumić ochronny efekt
działania SOD.
W zastosowanym ste˛żeniu i reżimie czasowym ekspozycji, kwas salicylowy nie podwyższył
znamiennie poziomu MDA w stosunku do zawiesin krwinek z glukoza˛ bez wzgle˛du na jej ste˛żenie.
Świadczy to, że nie wykazuje on w zaistniałych warunkach właściwości prooksydacyjnych. Biora˛c pod
uwage˛ stosunkowo krótki czas oddziaływania leku na erytrocyty trudno odnieść te wynik do badań
wskazuja˛cych na brak działania antyoksydacyjnego albo wre˛cz prooksydacyjnego kwasu (10).
Interesuja˛cy jest wynik badań, który może potwierdzać, że funkcjonowanie w erytrocytach mechanizmów antyoksydacyjnych uaktywnionych przez działanie glukozy i kwasu salicylowego po usunie˛ciu
tych czynników ze środowiska krwinek, zostawia ślad w postaci zwie˛kszonej odporności komórek na
działanie dodatkowego czynnika utleniaja˛cego jakim był nadtlenek kumenu (ryc. 4). Punkt odniesienia
284
M.B. Gawlik i inni
Nr 3
w tych badaniach stanowił układ składaja˛cy sie˛ z zawiesiny erytrocytów w buforze z fizjologicznym
ste˛żeniem glukozy poddany działaniu nadtlenku kumenu. Ilość powstaja˛cego w tym układzie MDA
przyje˛to za wartość 1. Ste˛żenie glukozy 126,2 i 280,1 mg % nie spowodowało zwie˛kszenia podatności na
oksydowalność błon erytrocytów w porównaniu do erytrocytów poddanych działaniu glukozy o ste˛żeniu
72,9 mg %. Dopiero ste˛żenie glukozy o wartości 354,1 mg % istotnie zmniejszyło odporność na
działanie nadtlenku kumenu.
Ryc. 4. Podatność na peroksydacje˛ lipidów pod wpływem nadtlenku kumenu krwinek czerwonych
narażonych uprzednio na działanie glukozy i kwasu salicylowego.
Fig. 4. Susceptibility of glucose- and salicylic acid-preexposed erythocytes to cumene
peroxide-induced lipid peroxidation.
Działanie utleniaja˛ce nadtlenku kumenu w stosunku do badanych erytrocytów poddanych 18 godz.
działaniu glukozy w zakresie ste˛ż. 72,9 – 280,1 mg % zostało istotnie obniżone, jeżeli na krwinki
dodatkowo oddziaływał kwas salicylowy w ste˛ż. 30 mg % przez okres 30 min. Krótsza 10 min.
inkubacja z kwasem salicylowym wpłyne˛ła protekcyjnie na krwinki znajduja˛ce sie˛ w otoczeniu glukozy
w ste˛ż. 126,2 i 280,1 mg %, a nie zadziałała protekcyjnie na zawiesine˛ z prawidłowym ste˛żeniem
glukozy.
Działanie antyoksydacyjne kwasu salicylowego w stosunku do erytrocytów narażonych na działanie
utleniaja˛ce nadtlenku kumenu nie miało znaczenia w przypadku erytrocytów narażonych na glukoze˛
o ste˛ż. 354,1 mg %.
W pewnym przybliżeniu możemy stwierdzić, że zawiesiny krwinek z glukoza˛, które wykazały
zwie˛kszenie aktywności SOD pod wpływem kwasu salicylowego sa˛ również mniej podatne na inicjacje˛
peroksydacji za pośrednictwem nadtlenku kumenu.
Wobec istnienia różnic w obserwowanych efektach, zarówno dla różnych ste˛żeń glukozy jak i czasu
narażenia na kwas salicylowy, wydaje sie˛ interesuja˛ce zbadanie kinetyki zmian markerów stresu
oksydacyjnego, co może mieć znaczenie praktyczne w leczeniu osób z cukrzyca˛.
Nr 3
Kwas salicylowy a równowaga pro/antyoksydacyjna
285
M.B. G a w l i k
THE IN VITRO EFFECTS OF SALICYLIC ACID ON PRO-/ANTIOXIDATIVE BALANCE
IN HUMAN RED BLOOD CELLS AT HIGH GLUCOSE CONCENTRATIONS
Summary
In vitro effects of glucose and salicylic acid on the antioxidant system in human red blood cells were
studied. The suspensions of erythrocytes in phosphate-buffered saline containing glucose at 72.9; 126.2;
280.1 and 354.1 mg % were incubated at 37°C for 18 hours. After that, 30 mg% salicylic acid was added
to each sample and then the samples were incubated for a further 10 and 30 min. The levels of MDA and
the activity of SOD were measured before and after the incubation. Samples of erythrocytes after
incubation with glucose and salicylic acid prepared as described above were oxidized with cumene
hydroperoxide for 1 hour. Erythrocyte susceptibility to peroxidation was assessed by the determination
of MDA level and SOD activity. The results suggest that salicylic acid does not change the level of MDA
in erythrocyte suspensions exposed to glucose within the studied concentration range. The activity of
SOD in these suspensions depended on the concentration of glucose and the time of incubation with
salicylic acid. Susceptibility to lipid peroxidation of red blood cells exposed to glucose dropped under
the influence of salicylic acid within the glucose concentration range of 126.2-280.1 mg%.
PIŚMIENNICTWO
1. Baynes J.W., Thorpe S.R.: Role of oxidative stress in diabetic complications. Diabetes, 1999; 48:
1-9. – 2. Tohoku J.: Lipid peroxidation and resistance to oxidation in patients with type 2 Diabetes
Mellitus. J. Exp. Med., 2004; 203: 211-8. – 3. Piconi L., Quagliaro L., Ceriello A.: Oxidative stress in
diabetes. Clin. Chem. Lab. Med., 2003; 41: 1144-49. – 4. Sushil K.J.: Hyperglycemia can cause
membrane lipid peroxidation and osmotic fragility in human red blood cells. J. Biol. Chem., 1989; 264:
21340-43. – 5. American Diabetas Association. Aspirin therapy in diabetes. Diabetes Care 2003; 26:
87-88. – 6. Czyż M., Watała C.: Aspiryna-molekularne mechanizmy działania kwasu acetylosalicylowego w organizmie. Poste˛py Hig. Med. Dośw., 2005; 59: 105-13. – 7. Ghiseli A., Laurenti O., De Mattia
G., Maiani G., Ferro-Luzzi A.: Salicylate hydroxylation as an early marker of in vivo oxidative stress in
diabetic patients, Free Radic. Biol. Med., 1992; 13: 621-626. – 8. Awtry E.H., Loscalzo J.: Aspirin.
Circulation, 2000; 101: 1206-18. – 9. Blatter-Garin M.C., Kalix B., De Pree S., James R.W.: Aspirin use
is associated with higher serum concentrations of the anti-oxidant enzyme, paraoxonase-1. Diabetologia,
2003; 46: 593-594. – 10. Durak I., Karaayvaz M., Çimen M.Y.B., Avci A., Çimen Ö.B., Büyükloçak S.,
Őztürk H.S., Özbek H., Kaçmaz M.: Aspirin impairs antioxidant system and causes peroxidation in
human erythrocytes and guinea pig myocardial tissue. Hum. Exp. Toxico,. 2001; 20: 34-37.
11. Kirkova M., Ivancheva E., Russanov E.: In vitro effects of aspirin on malondialdehyde formation
and on activity of antioxidant and some metal-containg enzymes. Comp. Biochem. Physiol. Pharmacol.
Toxicol., 1994; 108: 145-52. – 12. Pihan G., Regillo C., Szabo S.: Free radicals and lipid peroxidation in
ethanol or aspirin induced gastric mucosal injury. Dig. Dis. Sci., 1987; 32: 1395-401. – 13. Orhan H.,
Sahin G.: In vitro effects of NSAIDS and paracetamol on oxidative stress-related parameters of human
erythrocytes. Exp. Toxicol. Pathol., 2001; 53: 133-40. – 14. Ohsako M., Matsumoto Y., Goto S.:
Transport of aspirin and its metabolites through human erythrocyte membrane. Biol. Pharm. Bull., 1993;
16: 154-57. – 15. van den Berg J.J.M., Op den Kamp J.A.F., Lubin B.H., Roelofsen B., Kuypers F.A.:
Kinetics and site specifity of hydroperoxide- induced oxidative damage in red blood cells, Free Radical
Biol. Med., 1992; 12: 487-498. – 16. American Diabetas Association. Diagnosis and classification of
diabetes mellitus. Diabetes Care 2005; 28: 37-42. – 17. Stocks J., Offerman E.C., Modell C.B., Dormand
T.L.: The susceptibility to autoxidation of human red cell lipids in health and disease. Br. J. Haemat.,
1972; 23: 713-25. – 18. Misra H.P., Fridovich I.: The role of superoxide anion in the autoxidation of
epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J. Biol. Chem., 1972; 247: 3170-75. – 19.
Kotake M., Shinohara R., Kato K., Hayakawa N., Hayashi R., Uchimura K., Makino M., Nagata M.,
Kakizawa H., Nakagawa H., Nagasaka A., Itoh M.: Reduction of activity, but no decrease in
concentration of erythrocyte Cu,Zn-superoxide dismutase by hyperglycaemia in diabetic patients. Diab.
Med., 1998; 15: 668-71.
Adres: 30-688 Kraków, ul. Medyczna 9.