Agnieszka Baranowska-Morek

mgr Agnieszka Baranowska-Morek
Autoreferat rozprawy doktorskiej wykonanej w Zakładzie Ekotoksykologii Instytutu
Biologii Eksperymentalnej Roślin Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego
Detoksykacja ołowiu w ścianach komórkowych korzeni roślin
Promotor: dr hab. Małgorzata Wierzbicka, prof. UW
Recenzenci:
prof. dr hab. Elżbieta Bednarska (Zakład Biologii Komórki, Instytut Biologii
Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu)
prof. dr hab. Władysław Golinowski (Katedra Botaniki, Wydział Rolnictwa i
Biologii, SGGW)
Ołów wymieniany jest jako jeden z pierwiastków o najwyższym stopniu toksyczności
dla środowiska. Mimo działań mających na celu ograniczenia emisji ołowiu z różnych
antropogenicznych źródeł zagrożenie tym pierwiastkiem dla organizmów żywych jest nadal
aktualne. Dzieje się tak ponieważ metal ten należy do pierwiastków o wyjątkowo długiej
trwałości w środowisku. Szacuje się, że okres retencji ołowiu w glebach może wynosić 1505000 lat. Rośliny pobierają ołów ze środowiska chociaż dla ich metabolizmu jest to
pierwiastek balastowy i toksyczny. Badania przedstawione w niniejszej rozprawie dotyczyły
mechanizmów stanowiących obronę przed toksycznym działaniem ołowiu, występujących u
roślin D. carthusianorum (goździk kartuzek). Gatunek ten występuje pospolicie na obszarze
Polski, jest jednocześnie metalofitem - jednym z gatunków dominujących we florze hałdy
cynkowo-ołowiowej w Bolesławiu koło Olkusza. Punktem wyjścia dla przeprowadzonych
badań było wykrycie gromadzenia ołowiu w korzeniach roślin D. carthusianorum w postaci
dużych złogów, o budowie wskazującej na ich krystaliczny charakter (Baranowska-Morek i
Wierzbicka, 2004). Złogi te występowały w ścianach komórkowych merystematycznego
perycyklu. Taki sposób depozycji ołowiu w roślinach nie był do tej pory znany.
Celem niniejszej rozprawy było wyjaśnienie natury gromadzenia krystalicznych
złogów ołowiu w ścianach komórkowych jako przejawu detoksykacji tego metalu na obszarze
komórek korzeni roślin.
Badano rośliny traktowane ołowiem w warunkach laboratoryjnych. Posługiwano się
następującymi metodami: mikroskopia świetlna, mikroskopia elektronowa (TEM) i jej
techniki analityczne (EDX, ESI); immunocytochemia (z wykorzystaniem przeciwciał
monoklonalnych JIM5 i JIM7), absorpcyjna spektroskopia atomowa (AAS), odparowanie
laserowe (LA ICP MS), spektroskopia w obszarze bliskim progu absorpcji promieniowania
rentgenowskiego (XANES).
1
Uzyskano odpowiedzi na następujące pytania:
1. Jakie jest rozmieszczenie złogów ołowiu w korzeniach D. carthusianorum?
Stwierdzono, że obszarem, gdzie rozpoczyna się lub nasila proces formowania
krystalicznych złogów ołowiu jest bazalna część strefy merystematycznej korzenia. Ustalono
jednocześnie, że ta część strefy merystematycznej jest obszarem pokrywającym się z tzw.
strefą TZ (Transition Zone), w której zachodzi reorganizacja wewnętrznej struktury komórek,
związana z przygotowaniem do wzrostu elongacyjnego.
Stosując techniki mikroskopii świetlnej i elektronowej wykazano, że ołów w
komórkach części bazalnej strefy merystematycznej korzeni zdeponowany był głównie w
ścianach komórkowych, w postaci krystalicznych złogów. Złogi te były zlokalizowane w
rozdętych ścianach komórkowych tkanek tworzących walec położony w wewnętrznej części
korzenia, którego powierzchnię zewnętrzną wyznaczały ściany komórkowe pramiękiszu
graniczące z merystematyczną endodermą. W badaniach in vivo, przeprowadzonych przy
użyciu spektroskopii w obszarze bliskim progu absorpcji promieniowania rentgenowskiego
(XANES), wykazano, że w komórkach wewnętrznej części korzenia, gdzie tworzone są
krystaliczne złogi, gromadzone były największe ilości ołowiu. A zatem w tych komórkach
zachodziły główne procesy obronne prowadzące do detoksykacji ołowiu w ścianach
komórkowych.
Przy użyciu metody ASA stwierdzono, że w korzeniach siewek D. carthusianorum
gromadzona była bardzo duża ilość ołowiu – 5800 mg/kg s. m. Stosując metodę odparowania
laserowego (LA ICP MS) wykazano, że największe ilości tego pierwiastka znajdowały się w
części wierzchołkowej korzeni (do 600x więcej niż w pozostałych częściach). Wykazano
również zróżnicowanie strefy merystematycznej korzeni pod względem zawartości ołowiu.
Większe ilości ołowiu występowały w części bazalnej strefy merystematycznej w porównaniu
z częścią apikalną tej strefy.
Stwierdzono, że zarówno u D. carthusianorum jak i innych gatunków z rodzaju
Dianthus:
D.
caryophyllus,
D.
giganteus,
D.
barbatus,
D.
deltoides,
komórki
merystematycznego perycyklu mogą pełnić funkcję bariery ograniczającej transport ołowiu
do pramiazgi z uwagi na zatrzymywanie dużych ilości ołowiu w formie krystalicznych
złogów.
2. Jakie są właściwości krystalicznych złogów ołowiu?
Podczas obserwacji w świetle spolaryzowanym stwierdzono, że złogi ołowiu są
optycznie czynne, a zatem mają krystaliczną strukturę. Określono, że pierwsze krystaliczne
złogi ołowiu w komórkach korzeni D. carthusianorum powstawały już po 2 h inkubacji, a ich
2
liczba i wielkość zwiększały się wraz ze wzrostem dawki ołowiu. Krystaliczne złogi ołowiu
miały wielkość 0,25-3 µm (maksymalnie 7,7 µm), szacunkowa liczba złogów w komórce
wynosiła 4-60 (maksymalnie 120). Za pomocą analitycznych technik mikroskopii
elektronowej - ESI i EDX wykazano, że ołów w krystalicznych złogach był zdeponowany
wraz z siarką i fosforem.
3. Czy depozycja ołowiu w formie krystalicznych złogów jest powszechna w świecie
roślin?
Posługując się metodami mikroskopii świetlnej i elektronowej wykryto krystaliczne
złogi ołowiu w korzeniach: Dianthus carthusianorum, D. barbatus, D. chinensis, D. deltoides,
D. superbus, D. caryophyllus, D. giganteus, Silene vulgaris, Gypsophila elegans, Nicotiana
tabacum, Zea mays, Phaseolus vulgaris, Tagetes patulus, Cucumis sativus, Biscutella
laevigata oraz Arabidopsis arenosa.
Zatem detoksykacja ołowiu w postaci krystalicznych złogów w rozdętych ścianach
komórkowych jest powszechna w świecie roślin.
4. Jaki jest mechanizm powstawania krystalicznych złogów ołowiu?
Badano mechanizm (Fig. 1) tworzenia krystalicznych złogów ołowiu przy użyciu
inhibitora egzocytozy BFA oraz z zastosowaniem metod immunocytochemicznych.
Wykazano, że tworzenie krystalicznych złogów ołowiu w ścianach komórkowych było
uwarunkowane egzocytozą. Za pośrednictwem egzocytozy zachodził transport ołowiu do
ścian komórkowych oraz rozbudowa ściany komórkowej wokół krystalicznego złogu.
Procesom wyrzucania ołowiu do ściany komórkowej towarzyszyło zwiększenie ilości
celulozy oraz pektyn o wysokim stopniu estryfikacji (znakowanych przeciwciałem JIM7).
Zaproponowano
następujący
mechanizm
detoksykacji
ołowiu
warunkowany
egzocytozą - Fig. 1:
•
przedostawanie się jonów ołowiu do komórek – Fig. 1, etap 1
Zgodnie
z
danymi
literaturowymi,
najprawdopodobniej
istnieją
trzy
drogi
przedostawania się ołowiu do komórek położonych w wewnętrznej części korzenia. Pierwsza
– za pośrednictwem transporterów białkowych zlokalizowanych w błonie komórkowej, druga
– poprzez endocytozę i trzecia - przez plazmodesmy.
W odpowiedzi na obecność toksycznego metalu w cytoplazmie uruchamiany jest
następujący mechanizm:
•
zamykanie ołowiu w strukturach błonowych – Fig. 1, etap 2
Świadczą o tym elektronowo gęste depozyty ołowiu w komórkach korzeni siewek D.
carthusianorum obserwowane na terenie diktiosomów oraz w cysternach ER. Obecność
3
ołowiu w tych strukturach może wskazywać również na egzocytarny transport ołowiu na
drodze z ER do cystern diktiosomów.
•
budowa krystalicznego złogu w ścianie komórkowej, warunkowana egzocytozą –
Fig. 1, etap 3
Świadczą o tym badania z użyciem inhibitora BFA. Przebieg tego etapu może być
następujący: do wybranych miejsc w ścianie komórkowej kierowane są pęcherzyki
diktiosomalne zawierające złogi ołowiu a także pęcherzyki z materiałem budulcowym ściany
komórkowej – zwłaszcza z pektynami o wysokim stopniu estryfikacji. W miejscach depozycji
ołowiu w ścianie komórkowej zwiększone jest również odkładanie celulozy. Następuje
stopniowa krystalizacja związku/ związków ołowiu i wzrost krystalicznego złogu w ścianie
komórkowej.
•
budowa krystalicznego złogu w ścianie komórkowej sąsiadującej komórki – Fig.
1, etap 4
Aby w ścianie komórkowej doszło do wytworzenia w pełni ukształtowanego dużego
złogu, egzocytarne usuwanie ołowiu towarzyszące odkładaniu elementów budulcowych
ściany komórkowej musi zachodzić równocześnie w dwóch sąsiadujących komórkach.
Świadczy o tym symetryczny układ złogów w ścianach komórkowych. Płaszczyznę symetrii
dla złogu stanowi wówczas blaszka środkowa, od której symetrycznie, w głąb cytoplazmy
obu komórek rozchodzą się uwypuklenia ściany komórkowej, otaczające krystaliczny złóg
ołowiu.
Podsumowując – w niniejszej rozprawie doktorskiej wykazano, że u wielu gatunków
roślin proces aktywnej eliminacji ołowiu z cytoplazmy do ścian komórkowych w strefie
merystematycznej korzenia odgrywa ważną rolę w gromadzeniu i detoksykacji ołowiu. Proces
ten przyczynia się do unieruchamiania ołowiu na terenie korzeni roślin. W wyniku tego
procesu dochodzi do włączania ołowiu w obieg biologiczny.
W pracy wykazano po raz pierwszy, że bazalna część strefy merystematycznej
korzenia posiada nadspodziewanie duże możliwości detoksykacji ołowiu w ścianach
komórkowych. Ten obszar korzenia odpowiada tzw. strefie TZ (Transition Zone), pełniącej
istotną rolę w odpowiedzi na bodźce stresowe u roślin.
4
5