cwiczenie 6 - BIOL

CWICZENIE 5
ELEKTROFOREZA KAPILARNA Z DETEKCJĄ UV-VIS.
Elektroforeza polega na przemieszczaniu się obdarzonych ładunkiem cząstek pod
wpływem pola elektrycznego. W kapilarach zjawisku temu towarzyszy elektroosmoza
polegająca na ruchu roztworu elektrolitu (buforu) względem naładowanych ścianek kapilary.
Na skutek obu tych zjawisk cząsteczki przemieszczają się z różnymi szybkościami i w
różnych kierunkach, w wyniku czego następuje ich rozdział pozwalający na analizę ilościową
i jakościową.
Główną częścią składową aparatury do elektroforezy kapilarnej jest wypełniona
buforem kapilara, w której zachodzi rozdział substancji w wyniku różnic w ich
ruchliwościach elektroforetycznych. Końce kapilary zanurzone są w naczynkach
zawierających taki sam bufor, jakim wypełniona jest kapilara. W naczynkach umieszczone są
elektrody (katoda i anoda), dzięki którym doprowadzone jest do końców kapilary wysokie
napięcie z zasilacza. Detektor znajduje się na kapilarze po jej stronie katodowej. Detektor
połączony jest z rejestratorem. Schemat aparatury przedstawiony jest na rysunku 1.
Rys.1.
Schemat aparatury do elektroforezy kapilarnej z detektorem na kapilarze („on – kolumn”)
Celem ćwiczenia jest:
1.Analiza jakościowa dwóch wybranych fenotiazyn na podstawie czasów migracji w polu
elektrycznym
2. Analiza ilościowa wybranych związków na podstawie wysokości pików z zastosowaniem
metody porównania z wzorcem.
ODCZYNNIKI:
- 0,1M kwas cytrynowy
- 1M HCl
- 1M NaOH
- 0,1M NaOH
- Fenotiazyny:
1. 300 ppm perazyna C20H25N3S
2. 500 ppm prochloroperazyna C20H24ClN3S
3. 600 ppm tioproperazyna C22H30N4O2S2
4. 300 ppm promazyna C17H20N2S
5. 400 ppm dietazyna C18H22N3S
6. 400 ppm lewomepromazyna C19H24N2OS
APARATURA:
Aparat do elektroforezy kapilarnej z detekcją UV-VIS składający się z detektora, zasilacza
wysokiego napięcia, modułu do próbkowania oraz komputera.
SPOSÓB WYKONANIA ĆWICZENIA:
1. Przygotowanie układu pomiarowego do rejestracji
Na zasilaczu wysokiego napięcia ustawić potencjał równy 15 kV, a w czasie rejestracji
kontrolować prąd przepływający przez kapilarę. W module do próbkowania w oknie
INJECTION. ustawić 2 sec., w oknie ANALYSIS wstawić 45 min a w oknie WASH-10
min. Okna wybieramy przyciskiem PROGRAM, wartości wybieramy przyciskiem +1,
pozycję wybieramy przyciskiem SELECT każdą zmianę w poszczególnych oknach trzeba
zatwierdzić przyciskiem ENTER.
2. Konfiguracja programu do rejestracji krzywych
Włączyć komputer, wybrać program PC1000, otworzyć okno System Setup, otworzyć Data
Acquisition, poczekać chwilę aż program połączy się z detektorem, następnie otworzyć okno
Sample Queue Wpisać rodzaj próbki nazwisko użytkownika, opis próbki i wcisnąć w
prawym górnym rogu Queue. Zamknąć okno Sample Queue.
3. Przygotowanie kapilary
W celu przygotowania kapilary do pomiarów należy ją wstępnie przepłukać roztworami w
następującej kolejności 1M NaOH, 0,1M NaOH, H2O, 0,1M kwasem cytrynowym, każdym
przez około 10 min . Proszę pamiętać o przekładaniu kapilary do odpowiednich probówek.
Płukanie włączamy przyciskiem WASH powinien być słyszalny charakterystyczny dźwięk
pompy).
4. Rejestracja elektroferogramu roztworów wzorcowych sześciu fenotiazyn:
Przygotować w jednym mililitrze mieszaninę sześciu fenotiazym 100-krotnie rozcieńczając
roztwory wyjściowe. W Data Acquisition w górnym pasku wybrać Inject Sample (oznaczony
►). Do kapilary wstrzyknąć próżniowo mieszaninę fenotiazyn umieszczając koniec kapilary
w odpowiedniej probówce (przycisk VAC. w Module do próbkowania), następnie przełożyć
kapilarę do naczynka z elektrolitem i rozpocząć rejestrację elektroferogramu (przycisk
START w Module do próbkowania). Po ukończeniu rejestracji przepłukać kapilarę H2O,
0,1M NaOH, H2O, 0,1M kwasem cytrynowym.
5. Rejestracja elektroferogramu analizowanego roztworu
Otworzyć okno Sample Queue. Wpisać rodzaj próbki nazwisko użytkownika, opis próbki i
wcisnąć w prawym górnym rogu Queue. Zamknąć okno Sample Queue. W Data
Acquisition w górnym pasku wybrać Inject Sample (►). Do kapilary wstrzyknąć próżniowo
analizowaną próbkę umieszczając koniec kapilary w odpowiedniej probówce, następnie
przełożyć kapilarę do naczynka z elektrolitem i rozpocząć rejestrację elektroferogramu. Grupa
wykonująca eksperyment danego dnia jako ostatnia powinna po ukończeniu rejestracji
przepłukać kapilarę H2O i wymienić butelkę z buforem na butelkę z wodą, a następnie
powtórzyć cykl płukania wodą.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
1. Wyznaczyć czasy migracji dla fenotiazyn z otrzymanych elektroferogramów.
2. Na podstawie czasów migracji określić jakie fenotiazyny znajdowały się w
analizowanej próbce.
3. Metodą porównania z wzorcem wyznaczyć stężenie (w ppm) fenotiazyn w
analizowanej próbce.
Aktualizacja 1 X 2014r.