Prezentacja pracy mgr Marta Michalska 2007

The influence of an altered Prx III-expression
to RINm5F cells
Marta Michalska
Praca magisterska wykonana
W Zakładzie Medycyny Molekularnej
Katedry Biochemii Klinicznej
Akademii Medycznej w Gdańsku
Przy współpracy z
Instytutem Biochemii Medycznej i Biologii Molekularnej
Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie (Niemcy)
Pod opieką
Prof. Dr hab. med. Tadeusza Pawełczyka
Prof. Rer. nat. Reinharda Walthera
Układ pracy
Wstęp i cel pracy
Wyniki
1.
Ekspresja i supresja Peroksyredoksyny III w stabilnie transfekowanej
linii komórkowej RINm5F
2.
Indukcyjna syntaza tlenku azotu (iNOS)
3.
Polimeraza poli(ADP-rybozy) (PARP)
4.
Mitochondrialny potencjał przezbłonowy (∆ψm)
5.
Produkcja i sekrecja insuliny
Wnioski
Cukrzyca typ 1
Atak autoimmunologiczny
Stres oksydacyjny
Uszkodzenia mitochondrialne
→ Destrukcja komórek β trzustki
Antyoksydacyjny system obronny
SOD: Dysmutaza
ponadtlenkowa
Gpx: Peroksydaza
glutationowa
GR: Reduktaza
glutationowa
Prx: Peroksyredoksyna
TrxR: Reduktaza
tioredoksyny
Peroksyredoksyny
Tiol-zaleŜna peroksydaza
red.
ROOH
SH
SH
ox.
NADPH+H+
SH
SH
Peroksyredoksyna
S
Tioredoksyna
Reduktaza
tioredoksyny
SH SH
S
ROH+H2O
S
S
S
S
ox.
NADP+
red.
Funkcje fizjologiczne:
Antyoksydacyjna → Ochrona przed stresem oksydacyjnym
Transdukcja sygnału
Proliferacja komórek, apoptoza
Peroksyredoksyny
N-terminalna Cysteina: antyoksydacyjna funkcja enzymu
C-terminalna Cysteina: Regeneracja, Dimeryzacja
Podział:
Redoxaktywne Cys
SH
1. typowe 2 Cys-Prxs:
Prx 5
SH
3. 1 Cys-Prxs:
SH
Prx 1, 2, 3, 4
SH
2. atypowe 2 Cys-Prxs:
Konserwatywne Cys
Prx 6
Lokalizacja: Cytoplazma, Mitochondria, Peroksysomy
SH
Peroksyredoksyna III (Prx III)
Człowiek
AOP-1
antioxidant protein 1
Mysz
MER5
murine erythroleukemia-related cDNA
Szczur
Prx III
peroxiredoxin III
Cele pracy
Cytokiny
H2O2
ALL, STZ
iNOS
FADD
RFT
Caspase 8/10
∆ψ
Cyto c
PrxIII
Apaf-1
Caspase 9
Caspase 3
Caspase 7
Spadek produkcji i sekrecji
insuliny
Apoptoza
PARP
Indukcyjna ekspresja i supresja PeroksyredoksynyIII w stabilnie transfekowanej
linii komórek RINm5Fsens/antysens
W stabilnie transfekowanej linii RINm5F PeroksyredoksynaIII ulega nadekspresji
bądź supresji
RT-PCR
Rys.1 Tet-On-System w stabilnie transfekowanej linii komórek
RINm5F-PrxIIIsens/antysens
Western blot
Rys.2 Stabilnie transfekowana linia komórek RINm5F
traktowana 4 dni +/- doxycykliną, a) 1 µg RNA wykorzystano do
metody RT-PCR, b) 50 µg białka wykorzystano do metody
Western blot dla pokazania ekspresji peroksyredoksyny III,
przeciwciało przeciw PrxIII w rozcieńczeniu 1:1000
Tylko w obecności doksycykliny, transkrypcja genu peroksyredoksyny ulega
aktywacji
PeroksyredoksynaIII redukuje indukcję syntazy tlenku azotu (iNOS)
*
Rys.3 Indukcja syntazy tlenku azotu w stabilnie transfekowanej linii
komórek RINm5F-PrxIIIsens/antysens po 24h od zastosowania cytokin,
100U/ml TNFα, 50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ, 50 µg białka wykorzystano w
metodzie Western blot, rozcieńczenie przeciwciał 1:10000 dla detekcji
iNOS, 1:1000 dla detekcji GAPDH, mix oznacza kombinację cytokin TNFα,
IL1β, IFNγ
#
Rys.4 Analiza statystyczna indukcji iNOS w stabilnie transfekowanej
linii komórek RINm5F po zastosowaniu cytokin, wyniki są średnimi z
trzech niezaleŜnych eksperymentów +/- SE, *) p=0,0010, #) p=0,0023, mix
oznacza kombinację cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
PeroksyredoksynaIII chroni przed rozpadem polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)
±
*
Rys.5 Rozpad PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek
RINm5F-PrxIIIsens/antysens po 24h od zastosowania cytokin, 100U/ml
TNFα, 50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ, 50 µg białka wykorzystano w
metodzie Western blot, rozcieńczenie przeciwciał 1:1000 dla detekcji
PARP, 1:1000 dla detekcji GAPDH, mix oznacza kombinację cytokin
TNFα, IL1β, IFNγ
#
Rys.6 Analiza statystyczna rozpadu PARP w stabilnie
transfekowanej linii komórek RINm5F po zastosowaniu cytokin,
wyniki są średnimi z trzech niezaleŜnych eksperymentów +/- SE,
*) p<0,00010, #) p=0,131, ±) p=0,0315, mix oznacza kombinację cytokin
TNFα, IL1β, IFNγ
Peroksyredoksyna III chroni przed rozpadem PARP
#
*
Rys.7 Rozpad PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek
RINm5F-PrxIIIsens/antysens po24h od zastosowania substancji
diabetogennych i nadtlenku wodoru, 4mM ALL, 4mM STZ, 0,3% H2O2,
50 µg białka wykorzystano w metodzie Western blot, rozcieńczenie
przeciwciał 1:1000 dla detekcji PARP, 1:1000 dla detekcji GAPDH
Rys.8 Analiza statystyczna rozpadu PARP w stabilnie transfekowanej
linii komórek RINm5F po zastosowaniu STZ, wyniki są średnimi z trzech
niezaleŜnych eksperymentów +/- SE, *) p=0,0499, #) p=0,0602
Mitochondrialny potencjał przezbłonowy (∆ψm)
Komórki z niskim potencjałem ∆ψ
Mitochondrialny potencjał przezbłonowy (∆ψm)
RINm5F
Prx III sens
Prx III antysens
Rys.9 Efekt STZ na mitochondrialny potencjał przezbłonowy w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F, analiza
została wykonana po 48h od zastosowania 4mM STZ, wykorzystano fluorochrom DIOC do określenia ∆ψ przy uŜyciu cytometrii
przepływowej, M1 określa granicę pomiędzy komórkami zdrowymi a obumarłymi
Produkcja insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F
PeroksyredoksynaIII chroni komórki β przed śmiercią i tym samym polepsza
produkcję insuliny
a)
b)
Rys.10 Efekt cytokin, H2O2, STZ na ekspresję insuliny w stabilnie
transfekowanej linii komórkowej RINm5F-PrxIIIsens/antysens, 5 µg RNA
wykorzystano w metodzie Nothern blot, cytokiny (100U/mlTNFα,
50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ), 0,3% H2O2, 4mM STZ po 24 h
a) komórki RINm5F-PrxIIIsens, b) komórki RINm5F-PrxIIIantysens
Rys.11 Analiza statystyczna przedstawiająca produkcję insuliny
w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F-PrxIIIsens/antysens,
wyniki są średnimi z trzech niezaleŜnych pomiarów +/- SE, mix oznacza
połączenie cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
Sekrecja insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F
Stres oksydacyjny przewaŜa w linii komórkowej RINm5F z supresją peroksyredoksynyIII,
podczas gdy nadekspresja tego enzymu chroni tylko przed nadtlenkiem wodoru
Rys.12 Analiza statystyczna przedstawiająca sekrecję insuliny w stabilnie transfekowanej
linii komórkowej RINm5F-PrxIIIsens/antysens przy uŜyciu metody radioimmunologicznej (RIA),
wyniki są średnimi z trzech niezaleŜnych pomiarów +/- SE, *) p=0,0490, mix oznacza połączenie
cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
Wnioski
Enzym Peroksyredoksyna III odgrywa waŜną rolę podczas stresu
oksydacyjnego jako zmiatacz wolnych rodników, chroniąc komórki β przed
śmiercią i apoptozą
Nadekspresja peroksyredoksyny III hamuje działanie cytokin (TNFα, IL1β,
INFγ), diabetogennych substancji (alloxan, streptocotyny) oraz wolnych
rodników
Nadekspresja tego enzymu chroni takŜe przed aktywacją indukcyjnej syntazy
tlenku azotu (iNOS), rozpadem polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), utrzymuje
mitochondrialy potencjał przezbłonowy (∆ψm), a tym samym zabezpiecza przed
apoptozą
Peroksyredoksyna III poprawia produkcję i sekrecję insuliny
Podziękowania
Szczególne wyrazy wdzięczności naleŜą się promotorom mojej pracy, Prof. Dr
hab. Tadeuszowi Pawełczykowi oraz Prof. Rer. Nat. Reinhardowi Waltherowi za
opiekę i pomoc w trakcie pisania pracy magisterskiej
Dziękuję pracownikom Katedry i Zakładu Medycyny Molekularnej Akademii
Medycznej w Gdańsku, jak i pracownikom Instytutu Biochemii Medycznej i
Biologii Molekularnej Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie za pomoc
i ciepłe przyjęcie
Podziękowania dla pracowników Katedry Farmakologii oraz Katedry Onkologii i
Hematologii Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie za wskazówki
podczas pracy w laboratorium