Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi

Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 1 • 51-55
Praca oryginalna • Original Article
Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej
kropli krwi – doniesienie wstępne
Measurement of glycated hemoglobin HbA1c in dried blood spot
– preliminary report
Joanna Urbaniak, Mieczysław Woźniak
Zakład Chemii Klinicznej, Katedra Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu, 50-367 Wrocław, Wybrzeże Pasteura 2
Streszczenie
Celem pracy była ocena możliwości wykorzystania, jako materiału badanego, krwi przechowywanej w postaci suchej kropli
na bibule do oznaczania hemoglobiny glikowanej HbA1c metodą immunoturbidymetryczną oraz ocena stabilności analitu
w suchej kropli krwi. Krew pełną uzyskaną od 47 pacjentów nanoszono na bibułę Whatman 3, suszono i przechowywano przez
24, 72 godziny lub 7 dni. Zawartość HbA1c we krwi pełnej i suchej kropli krwi oznaczano zestawem Horiba ABX Pentra HbA1c
WB przy użyciu analizatora Pentra C200. Stwierdzono wysoką korelację i wysoką zgodność zawartości HbA1c we krwi pełnej
i suchej kropli krwi przechowywanej w temperaturze pokojowej przez 24 godziny (r=0.993 i obciążenie <0,05% Hb) oraz 72
godziny (r=0,992 i obciążenie <0,27% Hb). Pobieranie krwi na bibułę może być alternatywnym sposobem uzyskiwania materiału badanego do oznaczania HbA1c metodą immunoturbidymetryczną.
Summary
The aim of the study was the evaluation of the possibility of using dried blood spot for measurement of HbA1c by immunoturbidimetric method and the assesment of HbA1c stability in dried blood spot. Whole blood was collected from 47 patients
and applied to Whatman 3 filter paper. Blood spots were dried and stored at room temperature for 24, 72 hours and 7 days.
Hemoglobin A1c was measured in whole blood and dried blood using Horiba ABX Pentra HbA1c WB kit and Pentra C200
analyzer. There was a high correlation and good agreement between whole blood and dried blood spot HbA1c results after 24
hours (r=0.993 and bias <0.05% Hb) and 72 hours (r=0.992 and bias <0.27% Hb). Dried blood samples can be used for A1c
measurement by immunoturbidimetric method.
Słowa kluczowe:HbA1c, metoda immunoturbidymetryczna, sucha kropla krwi
Key words:Dried blood spot, HbA1c, immunoturbidimetric method
Wstęp
Zgodnie z aktualnymi wytycznymi praktyki klinicznej oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c wykorzystuje się nie
tylko do kontroli wyrównania metabolicznego w cukrzycy
i oceny ryzyka powstawania przewlekłych powikłań choroby, ale także do jej wykrywania oraz oceny ryzyka rozwoju
cukrzycy u osób z upośledzoną tolerancją glukozy [1]. Jeśli
dostępność oznaczania HbA1c będzie odpowiednio wysoka, rola HbA1c w wykrywaniu cukrzycy będzie rosła, gdyż
wskaźnik ten wykazuje znacznie mniejszą zmienność biologiczną w porównaniu do glikemii. Ponadto badanie można
wykonać w materiale pobranym o dowolnej porze dnia, niezależnie od przyjętego posiłku czy aktywności fizycznej. Nie
bez znaczenia jest również wyższa stabilność tego analitu in
vitro w porównaniu z glukozą [2].
Jednym ze sposobów zwiększenia dostępności oznaczania
HbA1c było opracowanie wielu metod typu Point-of-Care,
które pozwalają oznaczyć zawartość HbA1c we krwi włośniczkowej w miejscu lub czasie o ograniczonej możliwości
wykorzystania usług laboratorium. W chwili obecnej jednak
zdecydowana większość z opracowanych dotąd systemów nie spełnia wymagań jakości analitycznej [3]. Dlatego
w ostatnich latach powraca pomysł oznaczania HbA1c we
krwi włośniczkowej pobranej na bibułę, który już w latach
90 XX wieku miał swoich zwolenników [4, 5]. Suchą kroplę
krwi (dried blood spot, DBS) można bowiem przesłać w wygodny sposób do laboratorium, gdzie oznaczenie może być
wykonane metodą o sprawdzonej jakości analitycznej. DBS
wykorzystuje się od wielu lat w badaniach przesiewowych
noworodków, więc odpowiednio wystandaryzowane zestawy
do pobierania krwi są powszechnie dostępne [6]. Udowodniono, że DBS są odpowiednim materiałem do oznaczania
51
Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi – doniesienie wstępne
wielu substancji, m.in. aminokwasów, hormonów i ich metabolitów, witaminy D3 oraz wielu leków, a łatwość transportu
materiału w takiej formie ułatwia centralizację badań [7].
Opublikowane dotychczas prace wskazują, że DBS może być
alternatywnym materiałem badanym w przypadku oznaczania HbA1c metodą HPLC [4, 8], Tina-quant II na analizatorze
Modular P firmy Roche [8, 9, 10, 11] lub Aggape Diagnostics
(Indie) na analizatorze CX9 firmy Beckman [12]. Co ważne,
ponad 80% pacjentów uczestniczących we wstępnych badaniach uznało, że samodzielne pobieranie DBS w domu
w celu oznaczania HbA1c powinno zostać wprowadzone do
praktyki klinicznej. Pozwala bowiem wykluczyć konieczność
dodatkowej wizyty w ośrodku zdrowia, gdyż pacjent może
odebrać wynik badania w dniu wizyty kontrolnej u lekarza,
co stanowi ułatwienie dla osób o ograniczonej sprawności
lub mieszkających w małych miejscowościach [10].
W piśmiennictwie brak informacji na temat zastosowania
innej niż Tina-quant II metody immunoturbidymetrycznej,
stosowanej w polskich laboratoriach, do oznaczania hemoglobiny glikowanej w DBS. Istnieją również rozbieżności w ocenie stabilności HbA1c w czasie przechowywania
materiału. Dlatego podjęliśmy próbę oceny możliwości wykorzystania suchej kropli krwi do oznaczania HbA1c zestawem odczynników firmy Horiba ABX oraz ocenę stabilności
HbA1c w DBS w temperaturze pokojowej.
Materiał i metody
W badaniach wykorzystano 47 losowo wybranych próbek
krwi żylnej wersenianowej pochodzących od 47 pacjentów,
u których oznaczano stężenie HbA1c w ramach badań kontrolnych w Centralnym Laboratorium Analitycznym Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego nr 1 we Wrocławiu. Pełną krew przechowywano przed badaniem do
6 godzin w temperaturze pokojowej.
HbA1c oznaczano z wykorzystaniem zestawu odczynników Horiba ABX Pentra HbA1c WB oraz analizatora Pentra
C200. Zgodnie z instrukcją producenta oznaczenie wykonywano w hemolizacie krwi przygotowanym przez zmieszanie
10 µl krwi pełnej i 500 µl odczynnika lizującego (ABX Pentra
WB Hemolysis Reagent). Po wymieszaniu i 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej hemolizat umieszczano
w rotorze próbkowym aparatu i przeprowadzano analizę.
Równolegle nanoszono 20 µl każdej próbki krwi pełnej (po
3 krople) na paski bibuły chromatograficznej Whatman 3MM
i po wysuszeniu przechowywano przez 24, 72 godziny lub
7 dni w temperaturze pokojowej w papierowych kopertach.
W odpowiednim czasie suchą kroplę wycinano z bibuły przy
użyciu nożyczek do papieru, cięto ją na 3 części, umieszczano w probówce Eppendorfa i dodawano 500 µl odczynnika
lizującego (ABX Pentra WB Hemolysis Reagent). Po 15 minutach delikatnie mieszano próbkę i przenoszono hemolizat do naczynka próbkowego analizatora i przeprowadzano
analizę.
Zestaw ABX Pentra HbA1c WB zawiera odczynniki do wykonania dwu niezależnych oznaczeń: hemoglobiny całkowitej
metodą kolorymetryczną i frakcji HbA1c metodą immunoturbidymetryczną. Oznaczenie hemoglobiny całkowitej opiera
się na konwersji wszystkich form hemoglobiny w hematynę
zasadową w zasadowym roztworze detergentu niejonowego. Natężenie barwy roztworu jest wprost proporcjonalne do
stężenia hemoglobiny. W metodzie immunoturbidymetrycznej oznaczania HbA1c wykorzystuje się agregację cząstek
lateksu opłaszczonych monoklonalnymi przeciwciałami
przeciwko HbA1c po dodaniu syntetycznego polimeru zawierającego wiele kopii immunoreaktywnej HbA1c. Tworzenie kompleksów powoduje wzrost absorbancji zawiesiny.
Pod dodaniu próbki badanej aglutynacja odczynników testowych jest hamowana w stopniu zależnym od stężenia HbA1c
w badanym materiale. Odsetkowa zawartość HbA1c jest obliczana jako stosunek HbA1c do hemoglobiny całkowitej.
Oznaczenie HbA1c we krwi pełnej i w BDS przechowywanej przez 24 godziny wykonano we wszystkich 47 próbkach.
Część próbek BDS badano dodatkowo po 72 godzinach (24)
lub po 7 dniach (20).
Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu statystycznego MedCalc wersja 11.6.1.0. Do oceny zgodności
wyników pomiarów w dwu materiałach wykorzystano analizę
regresji Passinga i Babloka, współczynnik korelacji liniowej
obliczono metodą Pearsona, do porównania wyników wykorzystano test t dla prób powiązanych. Przyjęto poziom istotności różnic 0,05.
Wyniki
Wyniki porównania zawartości HbA1c w hemolizacie krwi
pełnej i w hemolizacie z suchej kropli krwi przedstawiono
w tabeli I i na rycinie 1. W tabeli II zestawiono średnie różnice wyników w dwóch materiałach badanych obliczone
z równania regresji dla 3 istotnych klinicznie punktów decyzyjnych: 5,7%, 6,5% i 7,0%. Zawartość HbA1c z przedziału
5,7-6,4% uważana jest za czynnik ryzyka rozwoju cukrzycy
u pacjentów bez objawów choroby, wartość ≥6,5% upoważnia do rozpoznania cukrzycy, wartość ≤7,0% uważana jest
Tabela I.
Analiza zależności pomiędzy zawartością HbA1c we krwi pełnej (metoda odniesienia) i suchej kropli krwi przechowywanej przez 24 godziny,
72 godziny i 7 dni.
Czas przechowywania
Liczba próbek
Równanie regresji
Passinga i Babloka
r Pearsona
24 godziny
47
y = 0,0686 + 0,9966 x
0,993
+ 0,06
+ 1,1%
72 godziny
24
y = 0,3111 + 0,9934 x
0,992
+ 0,28
+ 4,3%
7 dni
20
y = -0,1681 + 1,1061 x
0,982
+ 0,48
+ 7,9%
52
Średnie obciążenie
Rycina 1.
Graficzne przedstawienie zależności pomiędzy zawartością HbA1c (%) oznaczoną we krwi pełnej (metoda odniesienia) i w kropli krwi suszonej przez 24 godziny (47 próbek), 72 godziny (24 próbki) i 7 dni (20 próbek). Wykresy A, C, E - prosta regresji (linia ciągła) wraz z 95% przedziałem ufności (linia przerywana). Wykresy B, D, F - analiza różnic Blanda i Altmana, zaznaczono średnią (mean) różnicę wyników dwóch
metod (linia ciągła) wraz z 95% przedziałem ufności (linie przerywane).
za optymalny poziom HbA1c w kontroli metabolicznej cukrzycy [1].
Przyjęto całkowity błąd dopuszczalny oznaczania HbA1c
7%. Wartość ta, proponowana przez College of American
Pathologists (CAP) w sprawdzianach biegłości w roku 2011,
odpowiada różnicy około 0,5% Hb, którą wielu lekarzy uważa za istotną klinicznie (http://www.westgard.com/qualityhba1c-2011.htm, dostęp 25.09.2011).
Zawartość hemoglobiny glikowanej oznaczona w hemolizacie z suchej kropli krwi po 24 godzinach nie różniła się
istotnie (p=0,1180) od zawartości w hemolizacie świeżej krwi
pełnej. Średnia różnica wyników oznaczeń w dwóch materiałach była niższa od całkowitego błędu dopuszczalnego
w całym zakresie wartości oznaczanych. Przechowywanie
suchej kropli krwi w temperaturze pokojowej przez 72 godziny
lub dłużej powodowało istotne zwiększenie poziomu HbA1c
53
Oznaczanie hemoglobiny glikowanej HbA1c w suchej kropli krwi – doniesienie wstępne
(p<0,0001), a zależność ta występowała w całym zakresie
oznaczanych wartości. Różnice obserwowane po 72 godzinach można uznać za nieistotne klinicznie, natomiast różnice
wyników uzyskiwane po 7 dniach przechowywania BDS są
wyższe od przyjętego błędu dopuszczalnego (tabela II).
Tabela II.
Różnica zawartości HbA1c we krwi pełnej i suchej kropli krwi w
punktach istotnych decyzyjnie w odniesieniu do całkowitego błędu
dopuszczalnego.
Czas
5,7%
6,5%
7,0%
24 godziny
0,05
0,05
0,04
72 godziny
0,27
0,27
0,26
7 dni
0,44
0,52
0,57
TEA (7%)
0,40
0,46
0,49
Dyskusja
Materiałem do oznaczania hemoglobiny glikowanej jest
krew pełna żylna pobierana na EDTA lub heparynę (materiał
trwały do 7 dni w temperaturze +4oC) lub krew włośniczkowa
pobierana do specjalnych heparynizowanych kapilar i probówek, zawierających odczynnik hemolizujący/stabilizujący
(materiał trwały do 14 dni) [2]. Na podstawie opublikowanych dotychczas badań wydaje się, że materiałem alternatywnym może być kropla krwi wysuszona na bibule (DBS),
którą pacjent może samodzielnie pobrać w domu i przesłać
do badania np. listownie [4, 5, 8, 9, 10, 11, 12]. W przedstawionej pracy ocenialiśmy możliwość wykonywania oznaczeń
HbA1c w DBS z wykorzystaniem zestawu odczynnikowego
ABX Pentra HbA1c WB i analizatora Pentra C200, a także stabilność analitu w DBS przechowywanej w warunkach
zbliżonych do transportu przesyłką pocztową.
W dostępnych pracach do pobierania krwi włośniczkowej wykorzystywano bibułę Whatman 1 [9], Whatman 3 [12], Whatman 903 [10], Ahlstrom 226 [11] lub zestaw HbA1c via Post
[4]. W niektórych pracach nie podano zastosowanego nośnika
[8], więc uznaliśmy, że rodzaj bibuły ma znaczenie drugorzędne i wykorzystaliśmy bibułę Whatman 3, ciętą z rolki na paski
(rycina 2). W praktyce klinicznej zdecydowanie lepsze byłyby
standaryzowane zestawy wykorzystywane w badaniach przesiewowych noworodków (Whatman 903), w których zaznaczony jest obszar, na który należy nanieść krew.
Ważna jest natomiast wielkość kropli krwi, czas elucji i stosunek krwi do objętości odczynnika lizującego. Przedłużanie
Rycina 2.
Sucha kropla krwi na bibule Whatman 3. Średnica kropli około
10 mm. Kropla nr 58 wycięta do analizy.
elucji powoduje zaniżanie HbA1c z powodu jej degradacji
[10]. Do elucji w metodach immunoturbidymetrycznych używa się obecnie tego samego odczynnika, który służy do hemolizy krwi pełnej. W metodzie HPLC konieczne może być
dodanie do hemolizatu cysteiny, aby zapobiec tworzeniu
HbA3, która interferuje w oznaczeniu glikohemogobiny tą
metodą [4]. W dotychczasowych badaniach wykorzystywano fragmenty bibuły o średnicy 3-12 mm, objętość odczynnika lizującego 250-1000 µl, a elucję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 minut [12], 1 godzinę [10] lub
3 godziny [11] lub w temperaturze 4oC przez 24 godziny [4].
W naszych badaniach zwiększyliśmy objętość krwi (lizie
poddawana była cała sucha kropla 20 µl) i skróciliśmy czas
elucji do 15 minut, dzięki czemu przygotowanie hemolizatu
odbywało się porównywalnie do krwi pełnej. Gdy zawartość
HbA1c była wyższa od liniowości metody eluat rozcieńczano
odczynnikiem do lizy i oznaczenie powtarzano. Z przeprowadzonych przez nas doświadczeń wstępnych wynika, że
oznaczenie można wykonać z kropli krwi o mniejszej objętości zmniejszając proporcjonalnie objętość buforu do lizy lub
przedłużając czas elucji.
Największą uwagę przywiązuje się do stabilności HbA1c
w DBS, która ma decydujące znaczenie dla przydatności
tego materiału w codziennej praktyce. Wszyscy autorzy
wskazują na wzrost HbA1c w czasie przechowywania DBS,
co również obserwowaliśmy w naszych badaniach. Na maksymalny dopuszczalny czas przechowywania/transportu
mają wpływ m.in. temperatura, dostęp powietrza i światła
słonecznego. Zalecany czas przechowywania wynosi według różnych autorów: w temperaturze pokojowej 5-7dni [4],
do 9 dni [11], do 10 dni [9]; w temperaturze +4oC co najmniej 9 dni [11], 10 dni [4] lub 15 dni [12], w temperaturze
-70oC kilkanaście miesięcy [4]. Czas przechowywania można przedłużyć umieszczając DBS w torebkach foliowych
z pochłaniaczem wilgoci ograniczających dopływ powietrza
Tabela III.
Przegląd wyników badań zależności pomiędzy zawartością HbA1c oznaczoną we krwi pełnej i suchej kropli krwi metodami immunoturbidymetrycznymi.
54
Metoda
Liczba próbek
Równanie regresji
Współczynnik korelacji
Tina-quant II Roche
115
y = 0,81 + 0,85 x
0,985
Średnie obciążenie
Lit.
Tina-quant II Roche
58
y = 1,4 + 0,95 x
0,889
Tina-quant II Roche
93
y = -0,092 + 1,006 x
0,980
-0,011
Tina-quant II Roche
73
y = 0,189 + 0,984 x
0,996
+ 0,080
11
Agappe Diagnostics
30
y = 0,0018 + 0,9886 x
0,986
- 0,067
12
8
9
10
(do 1 miesiąca) i dodatkowo w niższej temperaturze (do
3 miesięcy) [8]. Nasze badania przeprowadzaliśmy w okresie letnim, temperatura w ciągu dnia przekraczała w niektóre
dni 30oC, w nocy nie spadała poniżej 20oC. Próbki były przechowywane w papierowej kopercie i nie były zabezpieczane
w żaden dodatkowy sposób. W takich warunkach HbA1c
była stabilna co najmniej 3 doby. Obserwowany przez nas
krótszy czas stabilności HbA1c w DBS wynika jednak nie
tyle z niedostatecznego zabezpieczenia próbki, co z przyjęcia, za CAP, ostrzejszego niż inni autorzy kryterium jakości. Gdybyśmy bowiem przyjęli, akceptowane powszechnie,
kryteria NGSP (różnica bezwzględna ≤0,75% Hb, przy 6,5%
Hb błąd całkowity bliski 12%) moglibyśmy uznać, że BDS
można przechowywać nawet 7 dni. W naszym odczuciu kryteria formułowane przez CAP (błąd całkowity 7%, różnica
bezwględna przy 6,5% Hb ≤0,45% Hb) lepiej spełniają oczekiwania klinicystów.
Ocena korelacji i zgodności wyników HbA1c uzyskanych we
krwi pełnej i suchej kropli krwi zestawem ABX Pentra HbA1c
WB w pełni potwierdza obserwacje autorów, którzy oznaczali HbA1c metodą Tina-quant II lub metodą HPLC (tabela
III). Uzyskane przez nas wyniki wskazują, że w przypadku
oznaczania HbA1c metodą immunoturbidymetryczną sucha
kropla krwi przechowywana do 3 dni w temperaturze pokojowej może być materiałem alternatywnym do krwi pełnej
w sytuacjach ograniczonego dostępu do usług laboratorium
lub trudności w pobraniu krwi żylnej.
9. Anjali, Geethanjali FS, Kumar RS, et al. Accuracy of filter paper
method for measuring glycated hemoglobin. J Assoc Physicians
India 2007; 55: 115-9.
10. Fokkema MR, Bakker AJ, de Boer F, et al. ��������������
HbA1c measurements from dried blood spots: validation and patient satisfaction. Clin Chem Lab Med 2009; 47: 1259-1264.
11. Jones TG, Warber KD, Roberts BD. Analysis of hemoglobin A1c
from dried blood spot samples with the Tina-quant II immunoturbidimetric method. J Diabetes Sci Technol 2010; 4: 244-249.
12. Lakshmy R, Gupta R. Measurement of glycated hemoglobin
A1c from dried blood by turbidimetric immunoassay. J Diabetes
Sci Technol 2009; 3: 1203-1206.
Zaakceptowano do publikacji 26.10.2011
Adres do korespondencji:
dr n. farm. Joanna Urbaniak
Zakład Chemii Klinicznej
Katedra Analityki Medycznej
Akademia Medyczna we Wrocławiu
50-367 Wrocław, Wybrzeże Pasteura 2
Tel. (71) 7841115, faks (71) 7840054
email: [email protected]
Podziękowania
Autorzy pracy składają podziękowania firmie Horiba ABX
Sp. z o.o. za nieodpłatne udostępnienie analizatora Pentra
C200 oraz odczynników i materiałów niezbędnych do przeprowadzenia badań.
Piśmiennictwo
1. Executive Summary: Standards of medical care in diabetes-2011. Current criteria for the diagnosis of diabetes. Diabetes
Care 2011; 34 Suppl 1: S4-S10.
2. Bryśkiewicz ME, Majkowska L. Czy hemoglobina glikowana
(HbA1c) stanie się standardem w diagnostyce cukrzycy? Pol
Merk Lek 2011; XXX: 150-154.
3. Lenters-Westra E, Slingerland RJ. Six of eight hemoglobin A1c
point-of-care instruments do not meet the general accepted analytical performance criteria. Clin Chem 2010; 56: 44-52.
4. Jeppsson JO, Jerntorp P, Almër LO, et al. Capillary blood on
filter paper for determination of HbA1c by ion exchange chromatography. Diabetes Care 1996;19: 142-5.
5. Voss EM, Cembrowski GS, Clasen BL, et al. Evaluation
������������������
of capillary collection system for HbA1c specimens. Diabetes Care
1992; 15: 700-701.
6. UK Newborn Screening Programme Center. Revised guideline
for newborn blood spot sampling. September 2011. http://newbornbloodspot.screening.nhs.uk/guidelines (dostęp 26 września
2011).
7. Li W, Tse FLS. Dried blood spot sampling in combination with
LC-MS/MS for quantitative analysis of small molecules. Biomed
Chromatogr 2010; 24: 49-65.
8. Buxton OM, Malarick K, Wang W, et al. Changes in dried blood
spot Hb A1c with varied postcollection conditions. Clin Chem
2009; 55: 1034-10.
55