instrukcja do ćw nr 4

Ćwiczenie laboratoryjne nr 4 dla e-Rolnictwa (20 i 22 - skrypt).
Oznaczanie aktywności proteolitycznej metodą Ansona na przykładzie
trypsyny.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie
proteolitycznych na przykładzie trypsyny.
metody
oznaczania
aktywności
enzymów
Wprowadzenie
Peptydazy. Peptydazy zwierząt wyższych ze względu na ich lokalizację dzieli się na
enzymy pozakomórkowe i wewnątrzkomórkowe. Pierwsze z nich, czyli enzymy trawienne,
wydzielane są do przewodu pokarmowego, gdzie rozkładają spożywany pokarm białkowy.
Należą do nich: pepsyna, podpuszczka, trypsyna, chymotrypsyna, aminopeptydazy,
karboksypeptydazy i elastaza. Enzymy wewnątrzkomórkowe są to tzw. katepsyny, a ich rola
polega na utrzymywaniu równowagi między poziomem białek i produktów ich hydrolizy
wewnątrz komórki. Peptydazy należą do klasy hydrolaz. Charakteryzują się niską
specyficznością w stosunku do rozkładanego substratu, natomiast wykazują wybiórczość w
stosunku do położenia hydrolizowego wiązania. W związku z tym wyróżnia się
endopeptydazy, rozszczepiające wiązanie wewnątrz łańcucha polipetydowego, oraz
egzopeptydazy, działające na wiązanie peptydowe aminokwasów N-końcowych
(aminopeptydazy) oraz aminokwasów C-końcowych (karboksypeptydazy). Ponadto niektóre
z tych enzymów charakteryzują się specyficznością w stosunku do charakteru reszt
aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie peptydowe. Na przykład pepsyna rozszczepia
te wiązania peptydowe, w których grup aminowych dostarczają aminokwasy aromatyczne i
kwaśne, trypsyna – te wiązania, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny,
chymotrypsyna zaś te wiązania, w których grupy karbonylowe pochodzą z fenyloalaniny,
tryptofanu lub tyrozyny, w mniejszym stopniu z leucyny i metioniny.
Proteinazy obejmują co najmniej 4 podklasy enzymów, które różnią się budową
centrum aktywnego. Wyróżnia się np. enzymy serynowe (z seryną jako głównym
aminokwasem kontaktowym), enzymy zawierające grupy –SH w centrum aktywnym, czy
metaloproteinazy.
Trypsyna. Enzym ten, należący do hydrolaz, podpodklasy proteinaz serynowych, jest
jednym z ważniejszych enzymów trawiennych. Jest wydzielany przez trzustkę w formie
nieaktywnego zymogenu (proenzymu) – trypsynogenu. Proenzym w jelicie cienkim
przekształcany jest w formę enzymatycznie aktywną. Trypsynogen składa się z pojedynczego
łańcucha polipetydowego zawierającego 249 reszt aminokwasowych o znanej sekwencji.
Przekształca się on w formę aktywną z udziałem innej proteinazy – enteropeptydazy
wytworzonej przez śluzówkę jelita cienkiego lub pod działaniem aktywnych cząsteczek
trypsyny (autokataliza). Aktywacja trypsynogenu polega na rozerwaniu wiązania
peptydowego pomiędzy lizyną i izoleucyna oraz odłączeniu niewielkiego peptydu (6–12 reszt
aminokwasowych, zależnie od pochodzenia), który blokuje centrum aktywne enzymu, nie
dopuszczając do kontaktu z substratem (Rys. 1).
1
Rys 1. Proteolityczna aktywacja trypsynogenu.
W centrum aktywnym występują reszty: seryny, histydyny oraz kwasu
asparaginowego jako aminokwasy kontaktowe. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań
peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny (Rys. 2). Jej masa
cząsteczkowa wynosi 23 000 Da, a optimum pH zawiera się w granicach 7–9. Efektem
działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha.
Rys. 2 Działanie trypsyny na białko.
Zasada metody. Szybkość reakcji enzymatycznej katalizowanej przez trypsynę zależy
od rodzaju zastosowanego substratu i metody jej oznaczania. Na ćwiczeniu aktywność
trypsyny będzie oznaczona metodą Ansona, która polega na pomiarze ilości tyrozyny
zawartej w peptydach uwolnionych w trakcie hydrolizy, które nie wytrącają się z 3%
kwasem trichlorooctowym.
Roztwór białka (kazeina) inkubuje się z enzymem w pH 8,6 i temp. 37°C. Oznaczenie
zawartości tyrozyny wykonuje się fotometrycznie przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa
barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny w próbie, jest wynikiem
redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w
środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego głównie przez zawartą w
peptydach tyrozynę.
Miarą aktywności otrzymanego na ćwiczeniu preparatu trypsyny będzie liczba µmoli
tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach.
2
Odczynniki
1. 0,1-molowy bufor dietanoloamina-kwas solny o pH 8,6: 0,2-molowy roztwór
dietanoloaminy (19,2 ml) dopełnić wodą do 1 l i doprowadzić pH do 8,6 za pomocą 0,1molowego kwasu solnego (na 50 ml roztworu dietanoloaminy zużywa się ok. 38 ml kwasu
solnego i uzupełnia wodą do 100 ml).
2. 1-proc. roztwór kazeiny o pH 8,6: zmiksować w zlewce 1 g kazeiny w ok. 80 ml
wody, doprowadzić pH do 8,6 za pomocą 1-molowego kwasu solnego i uzupełnić do 100 ml
wodą.
3. Odczynnik Folina (Ciocalteu); przed użyciem odczynnik rozcieńczyć czterokrotnie
wodą.
4. 0,5-molowy wodorotlenek sodowy.
5. 7,5-proc. roztwór kwasu trichlorooctowego (przechowywać w lodówce).
Wykonanie
1. Hydroliza. Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór trypsyny, dopełniony
do kreski 0,01-molowym buforem dietanoloaminowym (1) dobrze wymieszać. Do 3
enzymatycznie czystych probówek odmierzyć po 2,0 ml roztworu kazeiny (2) i umieścić je w
łaźni wodnej w temp. 37°C. Po około 5 min do 2 probówek z kazeiną (próby pełne - P) dodać
1 ml enzymu z kolby miarowej na 10 ml, szybko wymieszać i inkubować w temp. 37°C
dokładnie przez 15 min. Następnie do prób pełnych i materiałowej (M) dodać po 2 ml kwasu
trichlorooctowego (5), a następnie do próby materiałowej 1 ml enzymu z kolby miarowej na
10 ml. Wszystkie próby wymieszać na wytrząsarce i pozostawić przez 30 min w celu
całkowitego wytrącenia osadu białka. Następnie próby przesączyć do czystych probówek
przez sączek z bibuły.
2. Fotometryczne oznaczanie tyrozyny. Aby oznaczyć zawartość tyrozyny w
produktach proteolizy, trzeba do czystych probówek odmierzyć z prób pełnych i materiałowej
po 1 ml klarownego przesączu. Następnie do każdej probówki dodać 2 ml 0,5-molowego
wodorotlenku sodowego (4), po czym 0,6 ml odczynnika Folina (3) i zawartość probówek
natychmiast dobrze wymieszać. Po 10 min odczytać absorbancję poszczególnych prób w
fotometrze przy długości fali 670 nm ustawionym na zero wobec wody.
Obliczenie i interpretacja wyników
Od średniej wartości absorbancji prób pełnych odjąć absorbancję próby materiałowej.
Posługując się różnicą otrzymanej wartości absorbancji, z krzywej wzorcowej odczytać ilość
µmoli tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych przez 1 ml trypsyny w ciągu 15 min
inkubacji z kazeiną. Aktywność enzymu wyrazić w µmolach tyrozyny zawartej w peptydach
uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 min przez 1 ml preparatu trypsyny.
Pytania
1. Jak dzielone są peptydazy ze względu na sposób działania na łańcuch
polipeptydowy?
2. Wymienić kolejno enzymy proteolityczne działające w przewodzie pokarmowym
zwierząt wyższych i krótko je scharakteryzować.
3. Jakiego typu specyficznością charakteryzuje się trypsyna i jakie reszty
aminokwasów wchodzą w skład jej centrum aktywnego?
4. Na czym polega aktywacja trypsynogenu i z udziałem jakich enzymów się odbywa?
5. Jaką metodą oznaczana jest aktywność trypsyny na ćwiczeniu? Omówić jej zasadę.
W jakim celu przygotowywane są próby kontrolne materiałowe, w jaki sposób przerywana
jest reakcja enzymatyczna?
3
6. Wyjaśnić i uzasadnić wynik działania trypsyny na kazeinę przy zastosowaniu
metody Ansona.
7. W jakich jednostkach wyraża się aktywność trypsyny w metodzie stosowanej na
ćwiczeniu?
8. Narysować fragment łańcucha polipeptydowego, z zaznaczonymi wiązaniami
peptydowymi i wskazać miejsce działania trypsyny.
9. Omów zasadę oznaczania trypsyny metodą Ansona. W jakim celu w opisanej
metodzie dodajemy TCA (kwas trichlorooctowy)? Na podanym przykładzie sekwencji
zaznacz miejsca działania trypsyny N-…Ala-Tyr-Lys-Cys-Arg-Val…-C
Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności
lipazy trzustkowej.
Cel ćwiczenia
Poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy z użyciem
śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości katalizowanej reakcji zależnie
od czasu jej trwania.
Wprowadzenie
Lipazy. Hydrolazy estrów glicerolu, potocznie nazywane lipazami, należą do klasy
hydrolaz, podklasy esteraz. Występują one powszechnie u zwierząt (trzustka, wątroba, ściana
żołądka, jelita), jak również w nasionach i organach wegetatywnych roślin. Enzymy te
zapoczątkowują proces katabolizmu lipidów (tłuszczowców), które są ich naturalnymi
substratami. Rozszczepiają one wiązania estrowe, np. triacyloglicerolu, z przyłączeniem wody
i uwolnieniem kwasu tłuszczowego, zgodnie z reakcją pokazaną dla lipazy trzustkowej (Rys.
3).
triacyloglicerol
2-acyloglicerol + 2 kwas tłuszczowy
Rys. 3. Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy trzustkowej: R1, R2, R3 – reszty kwasów
tłuszczowych.
Lipazy odznaczają się niską specyficznością substratową, gdyż katalizują rozkład
estrów utworzonych przez kwasy tłuszczowe o różnej długości łańcucha, nasycone i
nienasycone, oraz alkohole długo- i krótkołańcuchowe, jedno- lub wielohydroksylowe.
Zależnie od pochodzenia enzymy te różnią się optimum pH działania, np. dla lipazy
trzustkowej wynosi ono około 7, lipazy wątrobowej około 8, a lipaz roślinnych 4,5–5,0.
Lipaza trzustkowa jest najważniejszym enzymem lipolitycznym przewodu
pokarmowego. Działając na triacyloglicerole odszczepia ona kwasy tłuszczowe z pozycji 1 i
3, w wyniku czego powstają monoacyloglicerole (na 2-acyloglicerole działa lipaza ścianki
jelita). Enzym ten łatwiej hydrolizuje acyloglicerole nienasyconych kwasów tłuszczowych niż
nasyconych analogów. Ponieważ triacyloglicerole są nierozpuszczalne w wodzie, więc enzym
działa na granicy faz ester – woda i hydrolizie podlegają tylko zewnętrzne wiązania estrowe.
Powstający produkt – diacyloglicerol – jest już bardziej polarny i skutkiem tego szybkość
4
działania lipazy trzustkowej, mierzona ilością uwolnionych kwasów tłuszczowych w
jednostce czasu, na początku reakcji jest niska i rośnie w miarę zwiększania się stężenia
diacylogliceroli.
Na aktywność lipazy mogą wpływać niektóre związki chemiczne. Na przykład
aktywatorami lipazy trzustkowej są: Ca2+, cyjanek, związki zawierające grupę –SH, a
inhibitorami – ketony, aldehydy oraz związki reagujące z grupami –SH. W przewodzie
pokarmowym aktywność lipazy wzmagają kwasy żółciowe, które obniżając napięcie
powierzchniowe, ułatwiają zemulgowanie lipidów (zwiększenie powierzchni granicznej
między fazą wodną i kuleczkami lipidu).
Badanie aktywności lipaz ma znaczenie diagnostyczne, np. aktywność ich obniża się
w osoczu przy schorzeniach wątroby, awitaminozie A, niektórych nowotworach złośliwych i
cukrzycy. Natomiast wzrasta przy ostrym zapaleniu trzustki i raku trzustki.
Metody oznaczania aktywności lipaz. Większość metod oznaczania aktywności lipaz
oparta jest na alkacymetrycznym oznaczeniu uwolnionych kwasów tłuszczowych w wyniku
działania na estry rozpuszczalne w wodzie, np. tween, lub nierozpuszczalne, np. substraty
naturalne (lipidy). Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych można też oznaczyć np. poprzez
wytworzenie mydeł miedziowych. Związany z mydłem jon miedziowy oznacza się na
podstawie reakcji z dietyloditiokarbaminianem.
Substraty nierozpuszczalne w wodzie powinny znajdować się w postaci
zemulgowanej, tj. silnie rozproszonej. Otrzymanie jednorodnej emulsji i zachowanie jej przez
cały czas działania enzymu na podstawowe znaczenie przy oznaczaniu aktywności lipaz.
Optymalna temperatura działania lipazy trzustkowej wynosi 37°C, a pH ok. 7.
Obydwie te wartości mogą ulegać zmianie zależnie od rodzaju substratu i buforu.
Zasada stosowanej metody. Metoda zastosowana w ćwiczeniu opiera się na pomiarze
ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z lipidów mleka pod działaniem lipazy w temp.
37°C i początkowym pH 7,7, którego wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obniżeniu
w wyniku uwalniania kwasów tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych
oznacza się przez zmiareczkowanie mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem
wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny. W opisanej metodzie uzyskuje się
proporcjonalność między ilością wyciągu trzustkowego, a szybkością reakcji dopiero po 60
minutach inkubacji.
Odczynniki
1. 12-proc. słodka śmietanka homogenizowana zobojętniona 1-molowym
wodorotlenkiem potasowym z dodatkiem 1 ml toluenu na 100 ml śmietanki (śmietankę o
wyższej zawartości tłuszczu rozcieńczyć wodą).
2. 0,7-molowy bufor fosforanowy o pH 7,7.
3. 96-proc. etanol (może być skażony, np. metanolem, acetonem) lub metanol.
Uwaga! Środek trujący!
4. 0,5-proc. fenoloftaleina w 70-proc. etanolu.
5. 0,05-molowy mianowany roztwór wodorotlenku potasowego.
6. Wyciąg z trzustki wieprzowej; 30 g odtłuszczonej trzustki homogenizować przez
ok. 5 min (z przerwami, aby uniknąć nagrzania się roztworu) ze 100 ml wody i uzupełnić
wodą do 1l; homogenat przesączyć przez podwójną warstwę gazy, wirować przy
4000 obr./min przez 10 min i przesączyć przez sączek z waty.
Wykonanie
Próbę otrzymaną do zbadania w kolbce miarowej uzupełnić wodą do kreski i
wymieszać. Do 6 probówek odmierzyć po 2,5 ml śmietanki (1) i po 1 ml buforu (2),
wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp 37°C w celu preinkubacji. Po 5 min do
5
wszystkich probówek dodać kolejno po 0,5 ml wyciągu lipazy (6), zanotować czas i
wymieszać. Po 20 min od dodania enzymu do 2 probówek w łaźni dodać po 5 ml etanolu (3)
– przerwanie reakcji enzymatycznej, wyjąć probówki z łaźni, następnie przelać do
kolb stożkowych na 100ml, dodać kilka kropli fenoloftaleiny (4) i uwolnione kwasy
tłuszczowe odmiareczkować wodorotlenkiem potasowym (5) do trwałego różowego
zabarwienia (wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej intensywności).
Następnie dwie próby zmiareczkować (postępując jak wyżej) po 40 min, a ostatnie dwie – po
60 min od dodania enzymu.
Aby określić kwasowość składników mieszaniny inkubacyjnej wykonać próbę
kontrolną. W tym celu odmierzyć kolejno do dwóch kolb stożkowych po 2,5 ml śmietanki (1),
1 ml buforu (2), 5 ml etanolu (3), kilka kropli fenoloftaleiny (4), 0,5 ml próby do zbadania (6)
i zmiareczkować (jak wyżej) wodorotlenkiem potasowym (5).
Opracowanie wyników
Od średniej wartości uzyskanej w wyniku miareczkowania prób pełnych po 60 min
inkubacji odjąć wartość próby kontrolnej i różnicę w ml wodorotlenku potasowego podać
prowadzącemu ćwiczenia. Aktywność lipazy wyrazić w µmolach kwasów tłuszczowych
uwolnionych w ciągu 1 min przez enzym z 1 g trzustki (1 ml 0,05-molowego wodorotlenku
potasowego = 50 µmoli kwasu tłuszczowego).
Obliczyć liczbę mmoli uwolnionych kwasów tłuszczowych w 20-minutowych
przedziałach czasu, tj. 0–20, 20–40 i 40–60 min. Sporządzić wykres przedstawiający
zależność szybkości reakcji hydrolizy tłuszczu od czasu, odkładając na osi rzędnych mmole
kwasów tłuszczowych, a na osi odciętych czas w minutach. Na podstawie otrzymanych
wyników wnioskować o szybkości hydrolizy lipoidów w badanych przedziałach czasu.
Pytania
1. Scharakteryzować hydrolazy estrów glicerolu pod względem funkcji, sposobu
działania i specyficzności. Jakie wymagania muszą spełniać substraty wykorzystywane do
oznaczania aktywności lipaz?
2. Przedstawić sposób działania lipazy na 1-palmitoilo-2-stearoilo-3palmitoleiloglicerol. Dlaczego szybkość uwalniania kwasów tłuszczowych z tłuszczu mleka
jest niższa na początku reakcji?
3. Podać zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania lipazy. Dlaczego do
mieszaniny inkubacyjnej dodaje się bufor o wysokim stężeniu?
4. 30 g trzustki wieprzowej po homogenizacji rozcieńczono do 1000 ml, pobrano 5 ml
i rozcieńczono do 25 ml. Do oznaczenia aktywności lipazy pobrano 1 ml wyciągu i
inkubowano z substratem 60 min. Średnia wartość odmiareczkowania próby pełnej wynosiła
21,5 ml, a próby materiałowej 4,5 ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego. Obliczyć
aktywność lipazy w mmolach kwasu tłuszczowego na 1 g trzustki i 1 min.
6