docWpływ stopnia uFosForylowania bakteryjnych endotoksyn na ich
download 
Reklamacja Transkrypt
Wpływ stopnia uFosForylowania bakteryjnych endotoksyn na ich
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 7PYWSTOPNIAUFOSFORYLOWANIABAKTERYJNYCHENDOTOKSYN NAICHAKTYWNOu¿BIOLOGICZN 4HEINFLUENCEOFPHOSPHORYLATIONDEGREEOFBACTERIALENDOTOXINS ONTHEIRBIOLOGICALACTIVITY *OLANTA,ODOWSKA$OROTA*ASEK$ANIEL7OLNY,UDMIA7ÃGLARZ:OFIA$ZIEREWICZ +ATEDRAI:AKAD"IOCHEMII+ATEDRAI:AKAD"IOFARMACJI 7YDZIA&ARMACEUTYCZNYgLSKA!KADEMIA-EDYCZNA 3OSNOWIECUL.ARCYZÌW +IEROWNIK+ATEDRYI:AKADU"IOCHEMIIPROFDRHAB,UDMIA7ÃGLARZ +IEROWNIK+ATEDRYI:AKADU"IOFARMACJIPROFDRHAB:OFIA$ZIEREWICZ Streszczenie Lipopolisacharyd (LPS), zwany endotoksyną bakteryjną, jest głównym czynnikiem wywołującym zakażenia bakteriami Gram-ujemnymi. Ten składnik zewnętrznej błony bakteryjnej posiada trzy regiony o odmiennych funkcjach biologicznych: część O-swoistą, rdzeń oligosacharydowy oraz lipid A. Za aktywność biologiczną odpowiedzialny jest komponent lipidowy, którego skład i budowa przestrzenna decyduje o aktywności biologicznej endotoksyny. Jednym z istotnych dla właściwości biologicznych LPS aspektów strukturalnych jest stopień ufosforylowana lipidu A, wpływa bowiem na rozpuszczalność endotoksyny w układach wodnych oraz przyłączenie jej do białka wiążącego LPS (LBP, ang. LPS binding potein) i transportującego ją do fosfolipidowej błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu. Mniejszy stopień podstawienia lipidu A grupami fosforanowymi warunkuje mniejszą aktywność endotoksyczną, przejawiającą się np. zahamowaniem indukcji cytokin oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS na komórkach ludzkich. Brak podstawników fosforanowych w lipidzie A zmniejsza również uporządkowanie reszt acylowych, co w efekcie modyfikuje właściwości biologiczne endotoksyny. Grupy fosforanowe mogą także występować w regionie heptozowym i Kdo oligosacharydu rdzeniowego. Działają one jak sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy i heptozylotransferazy. Ponadto z fosforanami mogą łączyć się kationy Mg2+ i Ca2+ warunkując strukturalną i funkcjonalną integralność błony zewnętrznej. Abstract Lipopolysaccharide, also called endotoxin, is a major pathogenic factor of Gram-negative bacteria. This bacterial outer membrane component consists of three regions: antigen-O, oligosaccharide core and lipid A, which differ in chemical structure and biological activity. Lipid A is essential for the endotoxic effects of Gram-negative bacteria and its composition and structural features determine biological activities of LPS complexes. The degree of lipid A phosphorylation is one of the crucial features responsible for the bioactivity of this region, affecting on solubility of endotoxin in water and its attachment to LPS binding protein (LPB), which transport endotoxin to cell membrane of infected macroorganisms. The decrease of endotoxic activity, manifested by decreased secretion cytokines and reduced affinity to human cell LPS receptors, is correlated with the lower degree of phosphorylation. The lack of phosphate groups in lipid A also influences three-dimensional arrangement of acylic substituents which modifies biological properties of endotoxins. Phosphate groups may also be attached to heptoses and Kdo in the core region of LPS. They function as inhibiting or inducing signals for heptosyltransferases and Kdo-transferases. Moreover, Mg2+ and Ca2+ kations may join phosphate groups, thus affecting structural and functional integrity of the outer membrane. Key words: lipopolysaccharide, lipid A, phosphates, biological activity Słowa kluczowe: lipopolisacharyd, lipid A, fosforany, aktywność biologiczna &ARM0RZEGL.AUK '|ª-J®RylR Lipopolisacharyd (LPS) jest jednym z najważniejszych składników strukturalnych zewnętrznej błony bakterii Gram -ujemnych. Uczestniczy bowiem w procesie komunikowania tych mikroorganizmów ze środowiskiem zewnętrznym [1]. Wpływa także na prawidłowe funkcjonowanie oraz przeżywalność komórek bakteryjnych chroniąc je przed działaniem kwasów żółciowych zainfekowanego makroorganizmu i hydrofobowych antybiotyków [2]. Ten heteropolimer, składający się z trzech połączonych kowalencyjnie komponentów strukturalnych: części O-swoistej, oligosacharydu rdzeniowego i lipidu A, odpowiedzialny jest za chorobotwórczość bakterii Gram-ujemnych. Stymuluje leukocyty i komórki śródbłonka, co powoduje uwolnienie licznych cytokin i mediatorów stanu zapalnego, m.in. interleukin (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10), czynnika martwicy nowotworu (TNFα), produktów metabolizmu kwasu arachidonowego (prostaglandyny, leukotrieny), czynnika aktywującego płytki krwi, wolnych rodników tlenowych, nadtlenku wodoru i tlenku azotu [3-5]. Dla podkreślenia jego działań negatywnych nazwano go endotoksyną bakteryjną. Na aktywność biologiczną LPS wpływ ma przede wszystkim struktura chemiczna lipidu A, m. in. jego stopień ufosforylowania. Jednak grupy fosforanowe mogą też często występować w wewnętrznej części oligosacharydu rdzeniowego [6,7]. Nie można jednak wykluczyć podstawienia nimi reszt cukrowych w antygenie O [8]. Najczęstsze miejsca podstawienia fosforanami struktury LPS przedstawiono na ryc. 1. +-qR¸y|²É-p ¬ªy|²Al7l|q|alA®yRo ql||ql-Ai-¬J¥|JoRa| ¥p ¥¬ AiRulA®yRo Za wzorzec całkowitej aktywności biologicznej uznano lipid A wyizolowany z bakterii Escherichia coli. Jego szkielet cukrowy stanowi disacharyd D-glukozoaminylowy (GlcpN-β(1→6)-GlcpN) podstawiony dwiema grupami fosforanowymi. Jedna związana jest estrowo w pozycji 4’ Ryc. 1. Budowa chemiczna lipopolisacharydu [5] Fig. 1 Chemical structure of lipopolysaccharide [5] (GlcNII) na końcu nieredukującym, a druga α-glikozydowo w pozycji 1 (GlcNI) końca redukującego. Do tego disacharydu przyłączone są cztery reszty acylowe w pozycjach 2, 3, 2’, 3’ oraz dwie kolejne będące podstawnikami kwasów tłuszczowych znajdujących się w pozycjach 2’ i 3’ GlcNII [5,9]. Jest to więc difosforylowany heksaacyl lipid A o asymetrycznym rozmieszczeniu kwasów tłuszczowych (ryc. 2). Bardzo podobną strukturą charakteryzuje się lipid A rodzaju Pectinatus, który także wykazuje pełną aktywność endotoksyczną [10]. Badania mające na celu ustalenie struktury chemicznej LPS syntetyzowanego przez różne bakterie Gram-ujemne, dowiodły, że odstępstwa od tej „wzorcowej” budowy wpływają na obniżenie aktywności biologicznej [11-14]. Pełną aktywność toksyczną wykazuje lipid A zawierający disacharyd heksozoaminylowy podstawiony asymetrycznie sześcioma resztami acylowymi [15,16]. Jest on 100-krotnie bardziej aktywny niż cząsteczka o pięciu lub siedmiu resztach acylowych (ryc. 2). LPS zawierający heksaacylowany lipid A jest łatwiej wiązany przez makrofagi niż endotoksyna o dwóch lub czterech resztach acylowych. Lipidowy komponent LPS podstawiony czterema kwasami tłuszczowymi jest prawie nieaktywny biologicznie, a deacylowany nie wykazuje żadnej aktywności w obronie przed leukocytami [3,5,17]. Na aktywność biologiczną lipidu A wpływ ma również asymetria podstawienia kwasami tłuszczowymi szkieletu cukrowego. Bakterie, których grupy acylowe w lipidzie A ułożone są symetrycznie, np. Chromobacterium violaceum, Neisseria meningitidis wykazują dużo mniejszą toksyczność niż struktury z niesymetrycznym rozmieszczeniem tych podstawników [2,17]. 't¬ª |yl-¥\|\|¬q|ª-yl-qllJ¥ y-oRa|-p ¬ªy|²É7l|q|alA®yÔ O właściwościach biologicznych lipidu A stanowi nie tylko liczba, rodzaj oraz rozmieszczenie kwasów tłuszczowych, ale także ilość reszt fosforanowych. Holst i wsp. [11] twierdzą, że podstawniki fosforanowe szkieletu cukrowego COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Ryc. 2. Wpływ modyfikacji strukturalnych hydrofobowej składowej lipidu A na aktywność biologiczną bakteryjnych endotoksyn na przykładzie zmian strukturalnych w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu A w odniesieniu do jego kompletnej struktury [5,20] Fig. 2 The influence of structural modifications of hydrophobic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified by E. coli lipid A structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole structure lipidu A mogą pośrednio wpływać na rozpuszczalność LPS w układach wodnych, zwiększając tym samym jego toksyczność. Również Cox i wsp. [18] stwierdzili korelację między stopniem ufosforylowania lipidu A a jego aktywnością biologiczną. Nie tylko LPS bakterii E. coli [15], który uznaje się za „wzorcowy”, lecz także jego mutant K12, który jest odporny na peptydowy antybiotyk polimyksynę B, wykazuje dużą aktywność. Prawdopodobnie wiąże się to z występowaniem w lipidzie A tych drobnoustrojów znacznych ilości fosfoetanoloaminy. W lipidzie A Campylobacter jejuni zidentyfikowano aż trzy różne disacharydy heksozoaminylowe o dość niepospolitych strukturach. Jednak w każdym z nich zostały zachowane dwa podstawniki fosforanowe. Mimo różnic strukturalnych aktywność lipidu A tego patogenu jest porównywalna z aktywnością „wzorcowego” LPS. Wykazuje on w organizmie gospodarza letalność, pirogenność i lokalną nekrozę skórną [19]. Potwierdza to wpływ stopnia ufosforylowania lipidu A na jego aktywność biologiczną. Za słusznością powyższej tezy przemawiają również wyniki badań Rietschel’a i wsp. [20], według których, im mniej reszt fosforanowych zawiera lipid A, tym mniejszą wykazuje aktywność. Lipid A z monofosforylowanym przy C1 lub C4’ disacharydem heksozoaminylowym jest 100 razy mniej aktywny niż zawierający dwa takie podstawniki (ryc. 3) [3]. Także Kumada i wsp. [21] zauważyli, że wysoka aktywność LPS jest uwarunkowana lipidem A o strukturze difosforylowanej w pozycji 1 i 4’ cukru. Prowadząc badania na niepodstawionym w pozycji 4’ i monofosforylowanym przy C1 rdzenia heksozoaminylowego lipidzie A bakterii Porphyromonas gingivalis, stwierdzili jego niską endotoksyczność oraz pewną unikalną cechę biologiczną - indukcję mitozy w komórkach śledziony myszy niewrażliwych na endotoksynę. Niska chorobotwórczość cechuje też lipid A bakterii Marinomonas vaga lub Bacteroides fragilis, zawierający tylko glikozydowo związany fosforan w pozycji 1 [22,23]. Z tego względu LPS B. fragilis uznawany jest za antagonistę endotoksyny, co może mieć znaczenie przy opracowywaniu szczepionek. Według Krauss’a i wsp. [24] także brak grupy fosforanowej w pozycji 1, a jej obecność przy C4’ szkieletu disacharydowego lipidu A skutkuje obniżeniem toksyczności (Neisseria gonorrhoeae, Mesorhizobium huakuii). Nieufosforylowany i niewykazujący aktywności biologicznej lipid A syntetyzują m.in. bakterie Bacteroides intermedius, Rhizobium leguminosarum i Francisella tularensis [25-27]. Zależność aktywności biologicznej od stopnia ufosforylowania lipidu A została przedstawiona w tabeli I. Reszty fosforanowe, jako ujemnie naładowane podstawniki szkieletu cukrowego lipidu A, mogą mieć również wpływ na przyłączanie endotoksyny do białka wiążącego LPS (LBP, ang. LPS binding potein), które transportuje je do fosfolipidowej błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu [17]. Zastąpienie grup fosforanowych resztami α-D-mannopiranozowymi nie wpływa na właściwości fizykochemiczne, ale powoduje zmniejszenie aktywności endotoksycznej, przejawiającej się zahamowaniem indukcji cytokin oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS na komórkach ludzkich [17]. Schwudke i wsp. [28] twierdzą, że brak podstawników fosforanowych zmniejsza także &ARM0RZEGL.AUK Ryc. 3. Modyfikacje hydrofilowej komponenty lipidu A a aktywność biologiczna bakteryjnych endotoksyn, na przykładzie zmian strukturalnych w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu A w odniesieniu do jego kompletnej struktury [5,20] Fig. 3 The effect of modifications of hydrophylic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified by E. coli lipid A structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole structure uporządkowanie reszt acylowych w lipidzie A, co w efekcie modyfikuje właściwości biologiczne LPS. Bakterie Porphyromonas gingivalis, Rhodobacter sp. syntetyzują charakteryzujący się niewielką endotoksycznością lipid A o strukturze różniącej się od formy o „wzorcowej” aktywności jedynie podstawnikami fosforanowymi i acylowymi [29]. Jednak niektóre mikroorganizmy (Plesiomonas shigelloides, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodobacter capsulatus) posiadają niewykazujący aktywności toksycznej lipid A o strukturze odpowiadającej temu komponentowi LPS u E. coli. Łukasiewicz i wsp. [30] sugerowali, że bakteria Plesiomonas shigelloides ma dużą zdolność indukcji cytokin, co może wynikać z difosforylowanej struktury lipidu A. Jednak przeczą temu wyniki ich późniejszych badań in vitro prowadzonych na zdefosforylowanej cząsteczce tego składnika LPS, bowiem nie potwierdziły wpływu ufosforylowania na powyższą formę aktywności biologicznej. Do nieaktywnych zaliczono również stosunkowo konserwatywną, difosforylowaną strukturę lipidu A bakterii Rhodopseudomonas sphaeroides [31] i Rhodobacter capsulatus [24]. Silipo i wsp. [32] wysunęli tezę o syntetyzowaniu przez bakterie nieufosforylowanego lipidu A o zmniejszonym stopniu zacylowania jako celowej strategii polegającej na łagodzeniu obrony makrooorganizmu. Bhat i wsp. [26] sugerują, że obecność podstawników fosforanowych w disacharydzie glukozoaminylowym jest dużo ważniejsza dla bakterii jelitowych niż innych, gdyż warunkuje ich żywotność, oraz wraz z resztami acylowymi determinuje właściwości toksyczne lipidu A oraz zdolność LPS do immunostymulacji w zainfekowanym makroorganizmie. Do grup fosforanowych lipidu A mogą być przyłączone dodatkowe podstawniki, np. etanoloamina (Etn), drugi fosforan (P), 4–aminoarabinoza (4-AraN), 4-amino-4-deoksy-L- arabinopiranoza (L-Arap4N), D-arabinofuranoza (Araf), glukozoamina (GlcN) [33-35]. Prawdopodobnie mogą one wzmagać aktywność toksyczną LPS lub ją modyfikować. Vaara i wsp. [36] twierdzą, że kationowa 4-AraN wzmaga oporność przeciwko niektórym antybiotykom dzięki odpychaniu przez grupy fosforanowe czynników antymikrobiologicznych posiadających ładunek dodatni, np. polimyksynę B. Przy czym, oporność na ten antybiotyk jest proporcjonalna do liczby podstawionych 4-AraN grup fosforanowych w lipidzie A. Prowadząc badania nad LPS bakterii z rodzaju Pectinatus Helander i wsp. [37] początkowo sugerowali, że obecność niezestryfikowanego fosforanu w dystalnej GlcN jest istotna dla wiązania polimyksyny. Jednak ich teza, o oporności na ten antybiotyk mikroorganizmów (Bacteroides fragilis, Chromobacterium violaceum, Proteus mirabilis, Pseudomonas cepacia, mutanty pmr S. typhimurium) syntetyzujących lipid A pozbawiony tej grupy fosforanowej lub zawierający kationowe podstawniki, nie została potwierdzona w badaniach nad Pectinatus. Ich dalsze badania dowiodły jednak, że dodatnio naładowane podstawniki reszt fosforanowych w lipidzie A determinują reaktywność względem polimyksyny. Maskowanie grup fosforanowych skutkuje przesunięciem w kierunku kationowym ładunku pola elektrostatycznego w LPS, co nie sprzyja wiązaniu polimyksyny i w konsekwencji wpływa na wirulencję bakterii [37]. Lipid A Chromobacterium violaceum zawiera podstawione obie grupy fosforanowe - pierwszą glikozydowo GlcN, a drugą estrowo L-Arap4N [38]. Prawdopodobnie nadaje to specyficzność serologiczną lipidowi A. Pomimo, iż właściwości biologiczne tej cząsteczki nie zostały jeszcze w pełni zbadane, to sugeruje się jej znaczną aktywność, niższą jednak niż „aktywnych” form LPS. Krauss i wsp. [24] COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Rodzaj podstawnika Organizm disacharydu w pozycji C4’ Agrobacterium tumefaciens Bordetella pertussis Bartonella henselae Chlamydia trachomatis Comamonas testosteroni Escherichia coli Erwinia carotovora Haemophilus ducreyi Haemophilus influenzae Pseudomonas reactans Yersinia pestis Pectinatus frisingensis Pectinatus cerevisiiphilus Pseudomonas aeruginosa PA01 Plesiomonas shigelloides Salmonella typhimurium Moraxella catarrhalis Vibrio cholerae Campylobacter jejuni Chromobacterium violaceum Klebsiella pneumoniae O3 Rhodospirillum tenue 2761 Rhodopseudomonas gelatinosa Rhodobacter capsulatus Porphyromonas gingivalis Rhodopseudomonas sphaeroides Neisseria gonorrhoeae Shigella sonnei Mesorhizobium huakuii Bacteroides fragilis Flavobacterium meningosepticum Leptospira interrogans Marinomonas vaga Aquifex pyrophilus Bacteroides intermedius Bdellovibrio bacteriovorus Francisella tularensis Rhizobium etli Rhizobium leguminosarum Rhodomicrobium vannielii Aktywność biologiczna Literatura wysoka średniowysoka wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka brak danych wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka wysoka brak danych wysoka średniowysoka wysoka wysoka wysoka niska niska niska [32] [33] [47] [48] [29] [9] [41] [45] [46] [49] [35] [10] [10] [51] [30] [36] [52] [34] [40] [38] [37] [53] [39] [24] [21] [31] zredukowana brak danych zredukowana zredukowana niska zredukowana niska [54] [55] [14] [22] [13] [56] [23] niska niska niska niska niska brak danych niska [12] [25] [28] [27] [57] [26] [11] C1 Difosforylowane -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P -P-L-Arap4N -P -P-L-Arap4N -P-PEtn -P -P -P-L-Arap4N -P -P-PEtn -P -P-PEtn -P-PEtn -P-Etn -P-Arap4N -P-GlcpN -P-L-Arap4N -P-L-Arap4N -P-Araf -P-L-Arap4N -P -P -P-Etn -P-Etn -P -P-Etn -P -P Monofosforylowane -P -P -P -GalA -P -P -PMe -P Nieufosforylowane -GalA -D-Manp -D-Manp -GalA -GalA -D-GlcN -D-Manp P – reszta fosforanowa, Etn – etanoloamina, PEtn – fosfoetanoloamina, D-GalpA – kwas D-galakturonowy, Arap4N–4-amino-4-deoksy-L-arabinopiranoza, Araf - arabinofuranoza, GlcpN – 2-amino-2-deoksy-D-glukopiranoza, D-Manp – D-mannopiranoza, Me – grupa metylowa, D-GlcN - D-glukozoamina, GalA - kwas galakturonowy Tabela I. Stopień ufosforylowania lipidu A i aktywność biologiczna bakterii Gram-ujemnych Table I. Phosphorylation degree of lipid A and biological activity of Gram-negative bacteria stwierdzili, że podstawienie reszty fosforanowej etanoloaminą lub fosfoetanoloaminą zmniejsza toksyczność lipidu A. Przeczą temu jednak wyniki badań zawierającego te podstawniki LPS bakterii Rhodopseudomonas gelatinosa, które wykazały wysoką aktywność biologiczną tej endotoksyny [39]. Odzwierciedleniem przestrzennym struktury chemicznej lipidu A jest jej konformacja, która wpływa na właściwości biologiczne lipopolisacharydu. Struktura chemiczna o największej aktywności, czyli difosforylowany heksaacyl lipid A z asymetrycznie rozmieszczonymi podstawnikami acylowymi przybiera kształt stożkowaty, charakteryzujący się dużym kątem odchylenia szkieletu glukozoaminylowego od powierzchni tworzonej przez kwasy tłuszczowe (>45°). Taka konformacja lipidu A skutkuje silną indukcją IL-6 [17]. W monofosforylowanym lipidzie A kąt odchylenia jest mniejszy i cząsteczka występuje w bardziej cylindrycznej konformacji. Jest to związane z obniżeniem jej aktywności toksycznej, przejawiającej się w hamowaniu sekrecji IL-6 [5,17]. Łukasiewicz i Ługowski [2] twierdzą, że cylindrycz- &ARM0RZEGL.AUK ne lipidy A tetra- lub pentaacylowane o kącie nachylenia mniejszym niż 25° całkowicie tracą swoje właściwości toksyczne. +-qR¸y|²É\¥ypAol7l|q|alA®y¬Ai|qla|k -Ai-¬J¥J®Ryl|ªRa||J |yl-oRa| ¥\|\|¬q|ª-ylW strukturze LPS ufosforylowany może być nie tylko lipid A, lecz także oligosacharyd rdzeniowy. Niektóre bakterie Gram-ujemne posiadają region heptozowy oraz Kdo (kwas 3-deoksy-D-mannooktulozonowy) podstawione w pozycji 7 fosforanem lub jego pochodnymi, najczęściej fosfoetanoloaminą lub pirofosforanem. U meningokoków stwierdzono zróżnicowanie immunotypowe, bowiem niektóre z nich posiadają przy C3 lub C6 dystalnej heptozy (HepII) fosfoetanoloaminę (PEtn), a u innych brak tego podstawnika [18]. W pozycji C6, rzadziej C7, komponentu oligosacharydowego LPS bakterii Campylobacter jejuni Aspinall i wsp. [40] zidentyfikowali PEtn związaną z proksymalną resztą heptozową (HepI). Również u Erwinia carotovora występuje jednostka HepI monofosforylowana w pozycji C4 [41]. LPS Klebsiella pneumoniae serotypu C3 posiada ubogo ufosforylowany rdzeń oligosacharydowy, a w serotypie C1 zamiast reszty fosforanowej występuje kwas galakturonowy [37]. Gatunki Pectinatus cerevisiiphilus i P. frisingensis syntetyzują wyjątkową strukturę sacharydową – ufosforylowaną glukozoaminę przyłączoną do C4 Kdo [10]. LPS z ufosforylowanym Kdo w pozycji C5 zidentyfikowano również u Vibrio cholerae, Bacteroides gingivalis i Bordetella pertussis [42-44]. W endotoksynach Haemophilus ducreyi obecny jest monofosforylowany Kdo [45]. Nie wyjaśniono jeszcze w pełni wpływu ufosforylowania komponenty oligosacharydowej LPS na aktywność biologiczną tych biomolekuł. Według Helander’a i wsp. [46] obecne w Kdo podstawniki fosforanowe mogą działać jak sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy i heptozylotransferazy. Ponadto z fosforanami mogą łączyć się kationy Mg2+ i Ca2+ warunkując strukturalną i funkcjonalną integralność błony zewnętrznej. Ufosforylowana część rdzeniowa endotoksyny bakterii Helicobacter pylori ma natomiast znaczenie w wiązaniu lamininy, glikoproteiny występującej w błonach komórkowych makroorganizmów. Proces ten jest istotny w inicjowaniu kolonizacji śluzówki żołądka przez te bakterie i prawdopodobnie wiąże się z wpływem LPS na prawidłowe oddziaływanie białek błony podstawnej komórek, a tym samym słabszym wiązaniem lamininy z jej receptorem w nabłonku żołądka [3]. Łukasiewicz i wsp. [30] zasugerowali, że w warunkach in vivo rdzeń oligosacharydowy Plesiomonas shigelloides typu S zawierający, zamiast reszty fosforanowej, kwas galakturonowy, może wykazywać zdolność do dezagregacji i mniej efektywnej neutralizacji komórki bakteryjnej przez organizm gospodarza, co teoretycznie przekłada się na wyższą toksyczność tych mikroorganizmów. Piśmiennictwo 1. Rietschel ETh, Wollenweber HW, Brade H, Zahringer U, Lindner B, Seydel U, Bradaczek H, Barnickel G, Labischinski H, Giesgrecht P, Structure and Conformation of the Lipid A Component of Lipopolisaccharides, Handbook of Endotoxin, Elsevier, Science Publishers 1984, 187-219. 2. Łukasiewicz J, Ługowski C. Biologiczna aktywność lipopolisachrydu. Post Hig Med Dośw 2003; 57: 33-53. 3. Różalski A. Lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych – struktura chemiczna, aktywność biologiczna i znaczenie w chorobotwórczości. (II) Budowa chemiczna a funkcja biologiczna LPS. Post Mikrobiol 1995; 3 (XXXIIV): 317-33. 4. Saluk–Juszczak J, Wachowicz B. Aktywność prozapalna lipopolisacharydu. Post Biochem 2005; 51: 280-5. 5. Lodowska J i wsp.: Heterogenność strukturalna lipidu A bakterii Gram-ujemnych. Post Hig Med Dośw 2007; 61: 106-21. 6. Olsthroon MMA i wsp.: Identification of a novel core type in Salmonella lipopolysaccharide. Complete structure analysis of the core region of the lipopolysaccharide from Salmonella enterica sv. arizonae O62. J Biol Chem 1998; 273: 3817-29. 7. Vinogradov EV i wsp.: The structures of the carbohydrate backbones of the lipopolysaccharides from Escherichia coli rough mutants F470 (R1 core type) and F576 (R2 core type). Eur J Biochem 1999; 261: 629-39. 8. Shashkov AS i wsp.: Structure of a 2-aminoethyl phosphate-containing O-specific polysaccharide of Proteus penneri 63 from a new serogroup O68. Eur J Biochem 2000; 267: 601-5. 9. Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical degradations and identification of products. J Biol Chem 1979; 254: 5906-17. 10. Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides of the genus Pectinatus. Eur J Biochem 1994; 224: 63-70. 11. Holst O i wsp.: structural studies on the phosphate-free lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100. Eur J Biochem 1983; 137: 325-32. 12. Plötzt B i wsp.: Characterization of a novel lipid A containing D-galacturonic acid that replaces phosphate residues. The structure of the lipid A of the lipopolysacchride from the hyperthermophilic bacterium Aquifex pyrophilus. J Biol Chem 2000; 275: 11222-8. 13. Tanamoto K i wsp.: Biological properties of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum. Clin Diagn Lab Immun 2001; 8: 522-7. 14. Choma A, Sowiński P. Characterization of Mesorhizobium huakuii lipid A containing both D-galacturonic acid and phosphate residues. Eur J Biochem 2004; 271: 1310-22. 15. Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical degradations and identification of products. J Biol Chem 1979; 254: 5906-17. 16. Alexander C, Zähringer U. Chemical structure of lipid A – the primary immunomodulatory center of bacterial lipopolysaccharides. Trends Glycosci Glyc 2002; 14: 69-86. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 17. Schromm AB i wsp.: Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion. Eur J Biochem 2000; 267: 2008-13. 18. Cox AD i wsp.: Phosphorylation of the lipid A region of meningococcal lipopolysaccharide: Identification of a family of transferases that add phosphoetanoloamine to lipopolysaccharide. J Bacteriol 2003; 185: 3270-7. 19. Moran AP i wsp.: Structural analysis of the lipid A component of Campylobacter jejuni CCUG 10936 (serotype O:2) lipopolysaccharide. Description of a lipid A containing a hybrid backbone of 2-amino-2-deoxy-D-glucose and 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose. Eur J Biochem 1991; 198: 459-69. 20. Rietschel E i wsp.: Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J 1994; 8: 217-25. 21. Kumada H i wsp.: Structural study on the free lipid A isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 1995; 177: 2098-106. 22. Weintraub A i wsp.: Structural characterization of the lipid A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 1989; 183: 425-31. 23. Krasikova IN i wsp.: Detailed structure of lipid A from lipopolysaccharide from the marine proteobacterium Marinomonas vaga ATCC 27119. Eur. J. Biochem. 2004; 271: 2895-904. 24. Krauss JH i wsp.: Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4. Eur J Biochem 1989; 180: 519-26. 25. Johne B, Olson I, Bryn K. Fatty acids and sugars in lipopolysaccharides from Bacteroides intermedius, Bacteroides gingivalis and Bacteroides loescheii. Oral Microbiol Immunol 1988; 3: 22-7. 26. Bhat UR, Forsberg LS, Carlson RW. Structure of lipid A component of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli lipopolysaccharide. Unique nonphosphorylated lipid A containing 2-amino-2-deoxygluconate, galacturonate, and glucosamine. J Biol Chem 1994; 269: 14402-10. 27. Vinogradov E, Perry MB, Conlan JW. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide. Eur J Biochem 2002; 269: 6112-8. 28. Schwudke D i wsp.: The obligate predatory Bdellovibrio bacteriovorus possesses a neutral lipid A containing α-Dmannoses that replace phosphate residues. Similarities and differences between the lipid A and the lipopolysaccharides of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 and its host-independent derivative HI100. J Biol Chem 2003; 278: 27502-12. 29. Iida T i wsp.: Chemical structure of lipid A isolated from Comamonas testosteroni lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1996; 237: 468-75. 30. Łukasiewicz T i wsp.: Structure of the lipid A – inner core region and biological activity of Plesiomonas shigelloides O54 (strain CNCTC 113/92) lipopolysaccharide. Glycobiology 2006; 16: 538-50. 31. Quereshi N i wsp.: Chemical reduction of 3-oxo and unsaturated groups in fatty acids of diphosphoryl lipid A from the lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides. Comparison of biological properties before and after reduction. J Biol Chem 1991; 266: 6532-8. 32. Silipo A i wsp.: Full structural characterization of the lipid A components from the Agrobacterium tumefaciens strain C58 lipopolysaccharide fraction. Glycobiology 2004; 14: 805-15. 33. Caroff M i wsp.: Structural characterization of the lipid A of Bordetella pertussis 1414 endotoxin. J Bacteriol 1994; 176: 5156-9. 34. Broady KW, Rietschel ET, Lüderitz O. The chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae. Eur J Biochem 1981; 115: 463-8. 35. Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404. 36. Vaara M, Viljanen P. Binding of polymyxin B nonapeptide to gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother 1985; 27: 548-54. 37. Helander IM i wsp.: Characterization of lipopolysaccharides of polymyxin-resistant and polymyxin-sensitive Klebsiella pneumoniae O3. Eur J Biochem 1996; 237: 272-8. 38. Hase S, Rietschel ET. The chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccharides from Chromobacterium violaceum NCTC 9694. Eur J Biochem 1977; 75: 23-34. 39. Tharanathan RN i wsp.: The structure of lipid A from the lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas gelatinosa 29/1. Arch Microbiol 1985; 141: 279-83. 40. Aspinall GO i wsp.: Chemical structure of the core region of Campylobacter jejuni serotype O:2 lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1993; 213: 1029-37 41. Fukuoka S i wsp.: Elucidation of the structure of the core region and the complete structure of the R-type lipopolysaccharide of Erwinia carotovora FERM P-7576. Eur J Biochem 1997; 250: 55-62. 42. Brade H. Occurrence of 2-keto-deoxyoctonic acid 5-phosphate in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae ogawa and inaba. J Bacteriol 1985; 161: 795-8. 43. Kumada H i wsp.: Occurrence of O-phosphorylated 2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopolysaccharide of Bacteroides gingivalis. FEMS Microbiol Lett 1988; 51: 77-80. 44. Chaby R, Szabó L. 3-deoxy-2-octulosonic acid 5-phosphate: a component of the endotoxin of Bordetella pertussis. Eur J Biochem 1975; 59: 277-80. 45. Melaugh W i wsp.: Partial characterization of the major lipooligosaccharide from a strain of Haemophilus ducreyi, the causative agent of chancroid, a genital ulcer disease. J Biol Chem 1992; 267: 13434-9. 46. Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae strain I-69 Rd-/b+. Eur J Biochem 1988; 177: 483-92. 47. Zähringer U i wsp.: Structure and biological activity of the short-chain lipopolysaccharide from Bartonella henselae ATCC 49882. J Biol Chem 2004; 279: 21046-54. 48. Rund S i wsp.: Structural analysis of the lipopolysaccharide from Chlamydia trachomatis serotype L2. J Biol Chem 1999; 274: 16819-20. &ARM0RZEGL.AUK 49. Silipo A i wsp.: Structural determination of lipid A of the lipopolysaccharide from Pseudomonas reactans. Eur J Biochem 2002; 269: 2498-505. 50. Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404. 51. Bhat UR i wsp.: Structural studies of lipid A from Pseudomonas aeruginosa PA01: occurrence of 4-amino-4deoxyarabinose. J Bacteriol 1990; 172: 6631-6. 52. Masoud H, Perry MB, Richards JC. Characterization of the lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis. Structural analysis of the lipid A from M. catrarrhalis serotype A lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1994; 220: 209-16. 53. Tharanathan RN, Weckesser J, Mayer H. Structural studies on the D-arabinose-containing lipid A from Rhodospirillum tenue 2761. Eur J Biochem 1978; 84: 385-94. 54. Post DMB i wsp.: Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: importance of a hexaacyl lipid A. Infect Immun 2002; 70: 909-20. 55. Ługowski C, Romanowska E. Chemical studies on Shigella sonnei lipid A. Eur J Biochem 1974; 48: 319-23. 56. Que-Gewirth NLS i wsp.: A methylated phosphate group and four amide-linked acyl chains in Leptospira interrogans lipid A. The membrane anchor of an unusual lipopolysaccharide that activates TLR2. J Biol Chem 2004; 279: 25420-9. 57. Que NLS i wsp.: Purification and mass spectrometry of six lipid A species from the bacterial endosymbiont Rhizobium etli. Demonstration of a conserved distal unit and variable proximal portion. J Biol Chem 2000; 275: 28006-16. Adres do korespondencji: dr Jolanta Lodowska Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląski Uniwersytet Medyczny ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel.: 032 364 1064 e-mail: [email protected] &ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 0ROFILEKSPRESJIGENÌWKODUJCYCHBIAKA ZWIZANEZAKTYWNOuCIABIOLOGICZNLEPTYNY WRAKUENDOMETRIUM %XPRESSIONPROFILEOFGENESCONNECTEDWITHBIOLOGICALACTIVITYOFLEPTIN INENDOMETRIALCANCER -AGORZATA3TACHOWICZ*OANNA/RCHEL*ACEK/LENDER )ZABELA7OxNICZKO!NDRZEJ7ITEK +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJW3OSNOWCU +ATEDRAI+LINIKA0OONICTWAI'INEKOLOGIIW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD'ENETYKI-EDYCZNEJW3OSNOWCU +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJW3OSNOWCU +IEROWNIKDRHAB5RSZULA-AZUREK Streszczenie Leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce. Celem pracy było porównanie transkryptomów tkanek endometrium wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) oraz wyselekcjonowanie z puli transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny, które na poziomie mRNA różnicują tkanki endometrium. W badaniu analizowano wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, Na podstawie bazy Affymetrix, bazy NCBi i danych literaturowych wyselekcjonowano 91 transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays) Wśród tych genów w gruczolakoraku endometrium obserwowano nadekspresję MMP2, MMP9 i VEGFA. w porównaniu do endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej. Słowa kluczowe; leptyna, mikromacierz oligonukleotydowa, rak enometrium ' Ö Leptyna (LEP) początkowo zidentyfikowana jako hormon związany z regulacją przyjmowania pokarmu, jest adipokiną o wielokierunkowym działaniu. Plejotropowa natura leptyny związana jest z występowaniem w organizmie receptora leptyny Ob-R. Znanych jest kilka izoform receptora leptyny będących wynikiem alternatywnego składania eksonów i proteolitycznego rozszczepienia białek już istniejących izoform receptora (ryc. 1). Wewnątrzko- Summary Intracellular signalling pathways are activated by leptin and are involved in cancerogenesis. The aim of the study was to analyze of endometrial tissues transcriptome by using oligonucleotide microarray technique (HGU133A Affymetrix). Next, among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin there were choose genes which differentiated investigated tissues of endometrium. There were analyzed: endometrium histopatological estimated as healthy in proliferative phase and endometrial adenocarcinoma (G1-G4). The obtained values of fluorescence for each probe on microarray chips were normalized with the RMAExpress.. Differences in mRNA levels were evaluated with SAM program (Significance Analysis of Microarrays), Statistica v.6,0 and Excel. Among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin including transcripts involved in leptin– induced intracellular signaling pathway; MMP2, MMP9 i VEGFA occurred overexpression in cancer tisssues. Key words; leptin, oligonucleotide microarray, endometrial cancer mórkowa domena receptora leptyny Ob-Rb zawiera region box1 złożony z 29 aminokwasów, który przyłącza domenę kinazy tyrozynowej Janusa JAK2, region box2 również odpowiedzialny za przyłączenie kinazy JAK oraz region box3, miejsce wiązania białek STAT (ang. signal transducer and activator of transcription), które po ufosforylowaniu i utworzeniu dimerów pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych w regulacji ekspresji genów [1,] (ryc. 1). Badania Myers’a dowodzą, że w przypadku długiej izoformy receptora leptyny Ob-Rb do aktywacji kinaz JAK oprócz regionu box1
