pobierz plik: Instrukcja_3

Biologia wybranych grup organizmów – Mikroorganizmy glebowe – aspekt współczesny,
I rok studiów magisterskich (II stopnia)
Instrukcja do ćwiczenia nr 3
Badanie wiązania azotu w brodawkach korzeni olszy
oraz izolowanie Frankia z brodawek
Materiał: brodawki korzeniowe olszy czarnej Alnus glutinosa,
wiążący azot szczep Azospirillum (kontrola pozytywna)
1. Badanie aktywności nitrogenazy w brodawkach (metodą redukcji acetylenu):
-
do badania użyć świeżych brodawek,
-
oddzielić poszczególne płaty brodawek i umieścić w trzech probówkach o pojemności
12 cm3 po 3,5 g lub - w przypadku mniejszej ilości materiału- w probówkach o pojemności 2,5 cm3 po 0,7 g (brodawki wypełniają probówkę do połowy jej wysokości),
-
probówki zamknąć szczelnie gumowymi, sterylnymi korkami "serum stopper",
-
w jednej z trzech probówek sprawdzić wolną pojemność probówki (wlewając do brodawek ilościowo wodę "pod korek" przy użyciu pipety szklanej o pojemności 10 cm3)
-
z dwóch pozostałych probówek usunąć strzykawką powietrze i wprowadzić acetylen
(nową strzykawką) tak, aby stanowił on 10% całkowitej wolnej pojemności probówki,
-
po ≥2 godz. inkubacji w temperaturze 30°C pobrać z probówek 1 ml (lub 0,2 ml)
próbki gazowe i zbadać w nich zawartość etylenu przy użyciu chromatografu gazowego (kolumna o wymiarach 2 m × 1,8 mm wypełniona Porapak R, 80-100 mesh,
temperatura kolumny 70°C, dozownika i detektora 100°C, gaz nośny azot z przepływem 40 cm3/min, detektor FID),
-
zanalizować dane przy użyciu programu komputerowego "Chrom-Anal",
-
obliczyć wg wzoru Martennsona ilość nm etylenu/próbkę/godz, a następnie przeliczyć
ilość etylenu na 1 g świeżej masy brodawek
A= % C2H4/100 x [(PV/RT) x 109] / t
A-aktywność nitrogenazy (nm C2H4/próbkę/godz),
% C2H4 - % powierzchni piku etylenu z chromatografu gazowego,
P- ciśn. atmosferyczne (~ 1,0 atm)
V- objętość acetylenu (C2H4) wstrzykniętego do probówki (ml),
R- stała gazowa = 82,054 ml x atm/mol/°K,
T - temperatura w stopniach Kelvina (273 + °C)
t - czas inkubacji próbki z acetylenem
2
2. Badanie wiązania azotu przez szczep Azospirillum:
-
do badania użyć szczepu wyhodowanego w bezazotowej pożywce Rennie (pożywka
nie zaszczepiona będzie stanowiła "ślepą próbę"),
-
zastąpić korek z waty na sterylny "serum stopper",
-
z probówki za pomocą strzykawki usunąć 0,7 cm3 powietrza (10%) znad pożywki i
dodać taką samą ilość acetylenu,
-
inkubować hodowlę w 30°C przez 2 godz. (lub dłużej)
-
do dozownika chromatografu gazowego wstrzyknąć 1 cm3 próbki gazowej pobranej
znad pożywki, zbadać w próbce zawartość etylenu,
-
aktywność nitrogenazy wyrazić w nmolach etylenu/hodowlę/godzinę wg wzoru
Martennsona.
3. Izolowanie Frankia metodą filtracji Bensona
-
oddzielone płaty brodawek przepłukać pod bieżącą wodą
-
przeprowadzić powierzchniową sterylizację brodawek używając 2,5% podchlorynu
sodu (zastosować preparat Ace w rozcieńczeniu 1:1, do rozcieńczenia użyć sterylnej
wody destylowanej), do podchlorynu dodać kroplę Tween 20, brodawki wytrząsać na
mieszadle magnetycznym przez 25 min.,
-
brodawki przepłukać 5-krotnie niewielką ilością wody sterylnej,
-
w sterylnych warunkach pociąć brodawki na bardzo drobne kawałki, odrzucając
wierzchołki,
-
przeprowadzić homogenizację skrawków brodawek w sterylnym, szklanym homogenizatorze w niewielkiej ilości sterylnej wody,
-
filtry o porach 50 i 20 µm wysterylizować 1% podchlorynem sodu - 1 min., po czym
kilkakrotnie przepłukać sterylną wodą,
-
homogenat przefiltrować przez oba filtry stosując do przepłukiwania duże ilości sterylnej wody,
-
materiał z filtra o porach 20 µm, będący właściwym inokulum, przenieść do sterylnej
probówki,
-
sprawdzić obecność pęcherzyków Frankia ("vesicle clusters") w zawiesinie pod mikroskopem,
-
uzyskaną zawiesiną zaszczepić 10 probówek z bezazotową pożywką dla Frankia.