Etapy przygotowania preparatów do badań w mikroskopie

Pracownia Mikroskopii
Elektronowej Skaningowej
Laboratory of Scanning
Electron Microscopy
Uniwersytet Śląski
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
University of Silesia
Faculty of Biology and
Environmental Protection
ul. Jagiellońska 28
40-032 Katowice
tel: (+48 32) 200 93 74
e-mail: [email protected]
www.semlab.us.edu.pl
Etapy przygotowania preparatów do badań
w mikroskopie skaningowym
1.UTRWALANIE. 2. PŁUKANIE. 3. OSMOWANIE. 4. PŁUKANIE.
5. ODWADNIANIE. 6. SUSZENIE W PUNKCIE KRYTYCZNYM (CPD).
7. NAKLEJANIE PRÓBEK. 8. NAPYLANIE
9. OBSERWACJA W SEM I ANALIZA OBRAZU
Standardowa metoda SEM dla tkanek biologicznych
1. Utrwalanie - 3% aldehyd glutarowy (utrwalacz redukcyjny) w 0.1 M buforze fosforanowym w temp. pokojowej
o
lub 0-4 C (4-24h)
2. Płukanie w 0.1 M buforze fosforanowym o pH=7.2 (3 x 10min.)
3. Dotrwalanie w 1-2% czterotlenku osmu (utrwalacz utleniający) w 0.1 M buforze fosforanowym o pH=7.2 (24h w temp. pok. w ciemności pod dygestorium): (1%OsO4) - fiolka 0.25g OsO4 w 25 ml 0.1 M buforu
fosforanowego (12.5 ml 0.2 M r-ru fosforanowego + 12.5 ml wody dest.) lub 2% r-r czterotlenku osmu (fiolka
0.25g OsO4 w 12.5 ml buforu 0.1 M (6.25 ml 0.2M r-ru fosforanowego + 6.25 ml wody dest.)
4. Płukanie w 0.1 M buforze fosforanowym o pH=7.2 (3 x 10 min.)
5. Odwadnianie w wodnym szeregu alkoholowym 50%, 60%, 70% (w alkoholu 70% można przerwać
procedurę), 80%, 90%, 96%, 100% (5-15 min.); 2x100% alkohol absol. lub aceton (15-30 min.)
6. Suszenie w punkcie krytycznym CPD
7. Naklejanie próbek na stolik aluminiowy
8. Napylanie metalem szlachetnym
9. Obserwacja w SEM i analiza obrazu
Metoda przygotowania 0.1 M buforu fosforanowego:
I. Roztwór fosforanowy 0.2 M:
R-r A: Na2HPO4 · 12 H2O - 35.82 g/500ml
lub Na2HPO4 · 2H2O -17.8 g/500ml
R-r B: NaH2PO4 · 2 H2O - 15.6 g/500ml
lub NaH2PO4 · H2O - 13.6 g/500ml
II. Bufor fosforanowy 0.1 M o pH 7.2: 36 ml r-ru A i 14 ml r-ru B (roztwór fosforanowy 0.2 M) i uzupełnić wodą
destylowaną do 100 ml, a następnie sprawdzić na pehametrze czy otrzymano bufor fosforanowy 0.1 M o pH 7.2.
III. 3% aldehyd glutarowy: 50 ml 0.2 M roztworu fosforanowego + 12 ml 25% aldehydu glutarowego + 38ml
wody destylowanej.
Powyższa procedura jest wprawdzie uniwersalna, ale pewne odstępstwa są dopuszczalne w zależności od rodzaju
badanego materiału.
Jagna Karcz ®
METODY PRZYGOTOWANIA PREPARATÓW DO BADAŃ W SKANINGOWYM
MIKROSKOPIE ELEKTRONOWYM
METODA SEM DLA TKANEK ROŚLINNYCH
1
Odczynniki chemiczne
Temperatura
Czas
Powtórzenia
Utrwalanie
3% glutaraldehyd w buforze
fosforanowym lub w wodzie dest.
temp. pok. lub
0-4°C
2-4 h (max. 24 h)
1
Płukanie
bufor fosforanowy lub woda dest.
temp. pok. lub
0-4°C
10-30 min.
3-5
Dotrwalanie
1-2% czterotlenek osmu w buforze
fosforanowym lub w wodzie dest.
temp. pok. lub
0-4°C
2-4 h
1
Płukanie
bufor fosforanowy lub woda dest
temp. pok. lub
0-4°C
10-30 min.
3-5
temp. pok. lub
0-4°C
15-30 min.
15-30 min.
15-30 min.
15-30 min.
15-30 min.
15-30 min.
30 min.
1
1
1
1
1
1
2
Odwadnianie
30% etanol
50% etanol
70% etanol (można przerwać procedurę)
80% etanol
90% etanol
95% etanol
100% etanol
Suszenie w punkcie krytycznym CPD
Naklejenie próbek na stolik aluminiowy za pomocą taśmy węglowej lub grafitowej
Napylanie próbek metalem szlachetnym, np. złotem technicznym
Przechowywanie próbek w eksykatorze
METODA SEM DLA TKANEK ZWIERZĘCYCH
1
Odczynniki chemiczne
Temperatura
Czas
Powtórzenia
Utrwalanie
3% glutaraldehyd w buforze
fosforanowym lub w wodzie dest.
temp. pok. lub
0-4°C
24-48 h
1
Płukanie
bufor fosforanowy lub woda dest.
tem. pok. lub 0- 10-20 min.
4°C
3-5
Dotrwalanie
1-2% czterotlenek osmu w buforze
fosforanowym lub w wodzie dest.
temp. pok. lub
0-4°C
1-2 h
1
Płukanie
bufor fosforanowy lub woda dest.
temp. pok. lub
0-4°C
10-20 min.
3-5
temp. pok. lub
0-4°C
10 min.
10 min.
10 min.
10 min.
10 min.
10 min.
10-30 min.
Odwadnianie
30% etanol
50% etanol
70% etanol (można przerwać procedurę)
80% etanol
90% etanol
95% etanol
100% etanol
Suszenie w punkcie krytycznym CPD
Naklejenie próbek na stolik aluminiowy za pomocą taśmy węglowej lub grafitowej
Napylanie próbek metalem szlachetnym, np. złotem technicznym
Przechowywanie próbek w eksykatorze
1
1
1
1
1
1
2