ĆWICZENIE NR 4. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI BAKTERYJNEJ β

ĆWICZENIE NR 4. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI BAKTERYJNEJ β

ĆWICZENIE NR 4.
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI BAKTERYJNEJ β-GALAKTOZYDAZY NA
PRZYKŁADZIE OPERONU LAKTOZOWEGO
Uwaga: Ze względu na kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są uŜywać fartuchów i
jednorazowych rękawiczek.
Poznawanie procesów transkrypcji i tranlacji genów to zaledwie część badań nad ich
ekspresją. Nie wszystkie geny w komórce ulegają ekspresji jednocześnie, ekspresja jest regulowana
i mogą na nią mieć wpływ warunki zewnętrzne. W odpowiedzi na aktualne Ŝywieniowe i fizyczne
warunki środowiska moŜe nastąpić aktywacja genów uprzednio milczących lub wyciszenie genów
aktywnych. Ta cecha pozwala komórkom bakteryjnym na duŜą elatyczność w dostosowaniu się do
zmian i zapobiega niepotrzebnemu marnotrawieniu energii. Regulacja ekspresji genów moŜe
odbywać się na kaŜdym poziomie przepływu informacji genetycznej komórki , najczęściej jednak u
bakterii zachodzi na poziomie transkrypcji. Wydajność regulacji na poziomie transkrypcji (etap
inicjacji) wynika ze specyficznej organizacji genomu bakteryjnego, który składa się z tzw. jednostki
transkrypcyjnej w postaci operonu.
Enzym β-galaktozydaza, kodowany przez jeden z genów struktury operonu
laktozowego u E.coli, hydrolizuje laktozę na dwa cukry proste: glukozę i galaktozę. JeŜeli E.coli
rośnie w obecności glukozy, preferowanego przez nią źródła węgla i energii, ekspresja
β-galaktozydazy nie zachodzi. Jeśli jednak jedynym dostępnym cukrem jest laktoza - następuje
indukcja enzymu (tzw. efekt glukozowy). Oznacza to, Ŝe ekspresja kontrolawana jest na dwa
sposoby:
- kontrola negatywna – wymaga represora, ktory wyłącza geny operonu laktozowego przy
braku laktozy
- represja kataboliczna – pozwala na ekspresję genów tylko wtedy, gdy stęŜenie glukozy
spadnie poniŜej granicznego (operon jest nieaktywny w obecności glukozy w środowisku
(kontrola pozytywna)
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania 1
Istnieją dwie hipotezy regulacji ekspresji genu β-galaktozydazy:
HIPOTEZA 1
Laktoza stymuluje syntezę enzymu przez aktywację drogi DNA →RNA→ BIAŁKO
Ta hipoteza sugeruje, Ŝe enzym nie jest obecny lub występuje w małym stęŜeniu w komórce dopóki
laktoza nie jest jedynym źródłem węgla w poŜywce. JeŜeli hipoteza ta jest prawdziwa to ilość bgalaktozydazy obecnej w komórce będzie zaleŜeć od tego jak długo gen β-galaktozydazy będzie
ulegać ekspresji.
HIPOTEZA 2
W bakterii E.coli występują formy nieaktywne enzymu β-galaktozydazy
Według tej hipotezy laktoza nie wpływa na ilość syntezowanego enzymu, raczej jest czynnikiem
aktywującym enzym.
W celu zbadania tych dwóch hipotez i poznania mechanizmu kontroli ekspresji genów
operonu laktozowego naleŜy zastymulować syntezę/aktywację β-galaktozydazy, a następnie
dodawać w odpowiednich odstępach czasowych antybiotyk (chloramfenikol) w celu blokowania
syntezy białka. JeŜeli β-galaktozydaza jest produkowana w szlaku DNA →RNA→ BIAŁKO, ilość
enzymu w kulturze będzie zaleŜeć od tego jak długo przebiega proces syntezy zanim zostanie
dodany chloramfenikol.
DNA → mRNA → łańcuch polipeptydowy → białko
↑ chloramfenikol
JeŜeli nieaktywna forma β-galaktozydazy jest zawsze obecna w komórce, dodanie chloramfenikolu
nie będzie miało wpływu na ilość enzymu w kulturze E. coli.
Podczas doświaczenia zostanie dodany syntetyczny induktor IPTG (izopropylo-β-D-1tiogalaktopiranozydu). IPTG po dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąŜe się do represora
laktozowego, powodując jego inaktywację (regulacja allosteryczna represora).
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania 2
1. Przygotowanie biomasy E.coli
a) Przygotować poŜywkę bakteryjną
•
Trypton broth (TB): 5g Bacto Tryton rozpuścić w 500ml PBS (buforowana sól fizfologiczna
o pH= 7,4)
Do kolby Erlenmayera o pojemności 250ml wprowadzić 150ml poŜywki. PoŜywkę
zautoklawować w autoklawie automatycznym (121°C, czas ok 45 min). Po ostygnięciu
zaszczepić bakteriami E.coli. Hodowlę prowadzić
w 37°C przez 24h w łaŜni wodnej z
wytrząsaniem
b) Do probówek dodać odpowiednie ilości TB (trypton broth) i IPTG (izopropylotiogalaktozyd),
chloramfenikolu oraz hodowlę E.coli według poniŜszej tabeli.
c) Inkubować probówki w 37°C przez 60 minut,
nr
TB (ml)
0,01M
IPTG (ml)
1
9.0
-
-
1.0
2
9.9
0.1
-
-
3
8.9
0.1
-
1.0
4
8.7
0.1
0.2
T=0
1.0
5
9.7
0.1
0.2
T=0
-
6
8.7
0.1
0.2
T=15
1.0
7
8.7
0.1
0.2
T=30
1.0
8
8.7
0.1
0.2
T=45
1.0
0,013M chloramfenikol dodawany w czasie (T=min) E.coli (ml)
d) Z kaŜdej probówki pobrać 3ml próbki do analizy aktywności β-galaktozydazy (patrz punkt 2),
resztę (7ml) pozostawić do oznaczania liczby aktywnych cząsteczek β-galaktozydazy
produkowanych przez jedną komórkę bakteryjną (patrz punkt 3).
2. Analiza aktywności β-galaktozydazy
a) Do analizy pobrać 3ml z kaŜdego probówki,
b) Do kaŜdej probówki szybko dodać oraz dobrze wymieszać:
•
6 kropli chloroformu i 3 krople SDS (10% w/v w wodzie), dobrze wymieszać,
•
0.1ml 0.006 M ONPG (syntetyczny substrat o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd),
Obecność enzymu określić na podstawie zmiany barwy roztworu (β-galaktozydaza katalizuje
reakcję hydrolizy wiązania β-1,4-glikozydowego w ONPG, co prowadzi do powstania barwnego
produktu o-nitrofenolu i galaktozy),
Probówki umieścić w łaźni wodnej z wytrząsaniem w 37°C na 10 min.
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania 3
c) Dodać 3ml 0.1 M Na2CO3,
d) Próbki odwirować(10 000rpm, 5 min),
e) Uzyskane próbki poddać badaniu metodą UV-VIS przy dlugości fali 420nm
Próba ślepa dla próbki z numerem 1 – 0.1ml ONPG w 3 ml TB i 3 ml Na2CO3
Próba ślepa dla próbki nr 3 – jest próbka nr 2
Próba ślepa dla próbek nr 4,6,7,8 – jest próbka nr 5
3. Oznaczanie liczby cząsteczek aktywnej β-galaktozydazy w komórce
Zmierzyć spektrofotometrycznie gęstość optyczną (OD) próbki przy dlugości fali 600nm
Próba ślepa dla próbki nr 1 - jest TB
Próba ślepa dla próbki nr 3 - jest próbka nr 2
Próba ślepa dla próbek nr 4,6,7,8, - jest próbka nr 5
OD 600 - gęstość optyczna (OD) mierzoną przy długości fali 600. Jest to pomiar zmiętnienia
zawiesiny bakteryjnej: spektrofotometr mierzy światło tracone na skutek rozproszenia światła przez
hodowlę. Ilość światła rozproszonego jest proporcjonalna do liczby komórek.
4. Opracowanie wyników
Według poniŜszego wzoru obliczyć ilośc β-galaktozydazy w komórce
OD420
Ilość β-galaktozydazy w komórce = 600 x--------------------------t x vol x OD600)
OD460 - ilość o-nitrofenolu produktu hydrolizy ONPG przez β-galaktozydazę Oznacza to
aktywnośc galaktozydazy w kulturze bakteryjnej.
OD 600 - gęstość optyczna (OD) mierzoną przy długości fali 600.
t = czas
vol = 1
600 = ( mol/komórka x min x ml)
5.Odczynniki:
TB (tryptone broth)
0,01M IPTG (stymulator -izopropylotiogalaktozyd)
0,013M chloramfenikol
bakterie E.coli
0,006M ONPG (o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd)
chlorororm
10% SDS
0,1 M Na2CO3
Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania 4