Amylaza

14367
Szkoła Festiwalu Nauki
Takao Ishikawa
Szkoła Festiwalu Nauki | ul. Ks. Trojdena 4
02-109 Warszawa | E-mail: [email protected]
Amylaza
Wykrywanie aktywności enzymatycznej amylazy w ślinie
Wstęp
Amylaza (E.C. 3.2.1.1) jest enzymem katalizującym reakcję rozkładu skrobi.
W zależności od typu katalizowanej reakcji, amylazy można podzielić na
podklasy, choć zawsze ich wspólną cechą jest zdolność hydrolizy skrobi.
Alfa-amylaza odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań alfa-1,4-glikozydowych, co powoduje skrócenie łańcuchów polisacharydowych budujących
skrobię. Powstają dwucukry i triozy.
Alfa-amylaza jest enzymem trawiennym, występuje w ślinie (przeprowadza jeden z pierwszych etapów trawienia) oraz w trzustce. Kiedy długo
trzymamy kawałek pieczywa w ustach, po pewnym czasie zaczynamy
wyraźnie czuć słodki smak. Dzieje się tak za sprawą właśnie amylazy rozkładającej skrobię z mąki na dwucukry, które odczuwamy jako słodkie.
W zestawie doświadczalnym znajduje się alfa-amylaza spożywcza,
czyli Termamyl. Enzym ten stosowany jest w przemyśle spożywczym do
upłynniania skrobi, np. podczas produkcji syropu.
Aktywność amylazy można bardzo łatwo wykryć, dodając tego enzymu
do krochmalu, który jest gęstym roztworem skrobi. Działanie amylazy
powoduje rozkład skrobi na mniejsze cząsteczki, w wyniku czego krochmal
wyraźnie zmienia konsystencję i staje się płynny. Rozkład skrobi można
stosunkowo łatwo obserwować wykorzystując specyficzną reakcję barwną, w której wykorzystuje się jodynę. Związek ten wiąże się ze skrobią,
dając intensywnie granatowe zabarwienie. W miarę rozkładu skrobi
intensywność zabarwienia wyraźnie maleje.
1 amy.pdb: Kadziola, A., Abe, J., Svensson, B., Haser, R. Crystal and molecular
structure of barley alpha-amylase. J.Mol.Biol. v239 pp.104-121, 1994
Skrobia (łańcuch n-cząsteczkowy) glukoza (n cząsteczek)
Materiały
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
www.sfn.edu.pl/volvox
Płytka z 24 dołkami lub 20 szklanych probówek
Skrobia ziemniaczana
Słoik odporny na wrzątek
Gorąca woda
2 pipetki pasteurowskie
Mieszadełko lub łyżka
Jodyna
Kubek z wodą do płukania pipetek
Enzym Termamyl
Zegarek lub stoper
Kserokopia przepisu wykonania doświadczenia
Struktura przestrzenna amylazy.
Na żółto zaznaczone są struktury
beta-kartki, na różowo alfa-helisy
Szkoła Festiwalu Nauki
Podział zadań w klasie
Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego
samego roztworu skrobi, w tej samej temperaturze. Kolejne próbki są
pobierane zawsze po tym samym czasie i w takiej samej objętości.
Kontrolą pozytywną, którą wykonują wszystkie zespoły, jest pierwsza
próbka – kropla krochmalu bez śliny dodana do roztworu jodyny. Dzięki
niej udowadniamy, że roztwór jodyny zabarwia się na granatowo pod
wpływem skrobi, a nie na przykład substancji zawartych w ślinie.
Grupa A – wariant doświadczalny A (kontrola +)
Pozytywną kontrolą w tym doświadczeniu jest roztwór komercyjnej
amylazy wykorzystywanej w przemyśle spożywczym. Enzym ten nosi
nazwę Termamyl.
Grupa B – wariant doświadczalny B (właściwa próba)
Do roztworu skrobi dodawana jest ślina uczestników doświadczenia
i badana aktywność amylazy zawartej w ślinie.
Grupa C – wariant doświadczalny B (kontrola -)
Do roztworu skrobi nie dodawany jest żaden enzym, tylko woda i
badana jest zmiana zabarwienia jodyny z próbkami roztworu skrobi w
czasie. Kontrola ma na celu sprawdzenie, czy skrobia samoistnie nie
zmienia swoich właściwości w czasie.
Przygotowania wstępne
Ponieważ przygotowanie krochmalu w warunkach szkolnych może nastręczyć nieco kłopotów, radzimy przygotować go dzień wcześniej. Skróci
to czas potrzebny do przeprowadzenia doświadczenia.
1
Przygotowanie krochmalu:
a.
Wsyp porcję skrobi (ok. 2 g) do słoika o poj. 200 ml, a następnie
rozrób w jak najmniejszej objętości zimnej wody (nie więcej niż 5
ml). Najlepiej posłużyć się łyżeczką do herbaty.
b.
Zagotuj w czajniku wodę.
c.
Zawiesinę skrobi zalej 50 ml gorącej wody. Zalanie wrzącą wodą jest
kluczowe, w przeciwnym razie może nie powstać krochmal!
d.
Zamieszaj bardzo energicznie, by nie powstały grudki skrobi. Dokładne mieszanie pozwoli uzyskać krochmal idealnie nadający się
do przeprowadzenia doświadczenia.
Pkt. 1a
www.sfn.edu.pl/volvox
Pkt. 1c
Przygotowany krochmal można
przechowywać przez 24 godziny w lodówce. Na minimum
godzinę przed wykonaniem
eksperymentu należy wyjąć go z
lodówki, by osiągnął temperaturę
pokojową. Jeżeli przygotowujemy krochmal w trakcie lekcji,
należy pamiętać o ostudzeniu
go do temperatury pokojowej
Pkt. 1d
Amylaza
2.
Przygotowanie roztworu jodyny
a.
Roztwór jodyny do wykrywania skrobi należy przygotować bezpośrednio przed lekcją. Uwaga! Odczynnik plami ubrania.
b.
Do 125 ml wody destylowanej dodaj za pomocą pipetki 0,5 ml jodyny
i dokładnie wymieszaj.
c.
Przygotowany odczynnik rozlej po ok. 25 ml do 5 kubeczków, po
jednym dla każdej grupy.
Pkt. 2a
Pkt. 2b
Pkt. 2c
3.
Przygotowanie enzymu
Roztwór enzymu Termamyl (alfa-amylaza spożywcza) należy przygotować tuż przed lekcją. Do 0,25 ml enzymu Termamyl dodaj 15
ml wody destylowanej i wymieszaj. Jeden zespół uczniów powinien
otrzymać tę probówkę i użyć jej zawartość jako kontroli zamiast
śliny. Zaleca się użycie w tym celu 2-3 ml rozcieńczonego enzymu
Termamyl na 50 ml przygotowanego krochmalu.
Opis doświadczenia
1�
Na wstępie postaw pytanie badawcze oraz sformułuj hipotezę
2�
Przygotuj zegarek, najlepiej z funkcją stopera.
3�
Dodaj przy pomocy pipetki pasteurowskiej po 1 ml roztworu jodyny
do wszystkich dołków na płytce z 24 dołkami lub do 20 probówek.
4�
Do pierwszego dołka dodaj przy pomocy czystej pipety pasterowskiej
jedną kroplę krochmalu, zamieszaj. Obserwuj barwę mieszaniny.
5�
Dodaj do słoika z krochmalem kilka mililitrów śliny (objętość około
1 łyżki). (UWAGA! W wariancie A zamiast śliny dodawane są 2-3 ml
otrzymanego od prowadzącego roztworu enzymu Termamyl, natomiast w wariancie C zamiast śliny dodawane są 2 ml wody). Bardzo
ważne jest mieszanie, aby enzym był rozprowadzony równomiernie
w krochmalu.
6�
Dokładnie wymieszaj krochmal i od razu dodaj jedną kroplę do
drugiego dołka. Uruchom stoper lub zanotuj dokładną godzinę.
7�
Po upływie jednej minuty, czystą pipetą pobierz próbkę krochmalu
i dodaj jedną kroplę do trzeciego dołka, mieszając jego zawartość
końcówką pipety. Cały czas mieszaj krochmal.
Copyright © Takao Ishikawa, 2005
Szkoła Festiwalu Nauki
Pkt. 2
Pkt. 6
Pkt. 8
8�
Czynność opisaną w pkt. 6 powtarzaj co minutę, dodając krochmal
do kolejnych dołków, za każdym razem odnotowując w tabeli zmianę
barwy. Zaleca się płukanie w czystej wodzie pipetki po każdym pobraniu krochmalu, gdyż pozostający w niej krochmal może wpływać na
wiarygodność wyniku.
9�
Możesz zakończyć doświadczenie, gdy odczynnik przestanie zmieniać barwę.
Nr dołka
Czas [min]
1.
kontrola
2.
0
3.
1
4.
2
5.
3
6..
4
7.
5
8.
6
9.
7
10.
8
11.
9
12.
10
13.
11
14.
12
15.
13
16.
14
17.
15
18.
16
19.
17
20.
18
www.sfn.edu.pl/volvox
Kolor roztworu w dołku
Konsystencja krochmalu
Amylaza
Oczekiwane wyniki
Zanotowane barwy roztworu jodyny po dodaniu kolejnych próbek z
krochmalem i wymieszaniu:
Wariant
Dodany enzym
Pomiar 0
Pomiar 1...
Pomiar 20
A
termamyl
granatowy
granatowy
brak zmiany koloru
B
amylaza ze śliny
granatowy
granatowy
brak zmiany koloru
C
woda
granatowy
granatowy
granatowy
Rozwiązywanie problemów
Nawet w próbkach pobieranych po 20 minutach jodyna staje się granatowa:
Aktywność amylazy w próbce jest zbyt niska. Należy dodać więcej
enzymu z probówki Termamyl lub więcej śliny. Doświadczenie wychodzi
zdecydowanie lepiej, jeżeli osoba „plująca” do próbki żuła wcześniej
gumę lub jadła pieczywo.
Krochmal przygotowywany był tuż przed doświadczeniem i był za
gorący w momencie, kiedy dodano do niego próbkę śliny. Wysoka temperatura spowodowała dezaktywację enzymu.
Przygotowany poprzedniego dnia krochmal nie został wyjęty z lodówki
odpowiednio wcześniej. Jeżeli temperatura krochmalu jest zbyt niska,
amylaza działa z bardzo małą wydajnością. Krochmal powinien mieć
temperaturę pokojową.
Roztwór nie zmienia barwy niemal od razu:
Enzym zawarty w próbce ma bardzo wysoką aktywność lub objętość
dodanego enzymu była zbyt duża. Należy powtórzyć doświadczenie
zmniejszając objętość dodawanej śliny.
Próba kontrolna w postaci roztworu enzymu Termamyl nie działa:
Można zwiększyć objętość próbki enzymu oraz delikatnie podgrzać
słoik z krochmalem (np. wstawić go do naczynia z ciepłą wodą). Amylaza
Termamyl wykazuje aktywność w temperaturze pokojowej, ale optymalną
temperaturą dla jej działania jest 50-60oC.
Uwagi:
• Roztwory po eksperymencie można wylać do zlewu;
• Jodynę i jej roztwory należy chronić przed światłem, np. zakrywając
cały pojemnik folią aluminiową.
Podziękowania
Ilustracje wykonała Anna Lea Chojnacka.
Adaptacja protokołu została wykonana w ramach projektu VOLVOX finansowanego przez Komisję Europejską w Szóstym Programie Ramowym.
Copyright © Takao Ishikawa, 2005