Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego z

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych
nr 584, 2016, 23–31
WPŁYW METANOLU NA PROCES BIOSYNTEZY
KWASU CYTRYNOWEGO Z SACHAROZY
PRZEZ ASPERGILLUS NIGER
Ewelina Dymarska1,2, Jerzy Jan Pietkiewicz2
1
2
Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Witelona w Legnicy
Streszczenie. Na przebieg hodowli Aspergillus niger i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego metodą wgłębną wpływa wiele czynników, m.in. rodzaj źródła węgla i jego stężenie,
rodzaj i stężenie jonów metali występujących w podłożach hodowlanych oraz morfologia
grzybni. Wpływ czynników stymulujących proces biosyntezy kwasu cytrynowego był dotąd
szeroko badany. Alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak metanol, etanol oraz n-propanol, mogą stymulować proces produkcji kwasu cytrynowego. Celem pracy było określenie
wpływu alkoholu metylowego na biosyntezę kwasu cytrynowego w wgłębnych hodowlach
okresowych Aspergillus niger PD-66 w podłożu syntetycznym z sacharozą. Przeprowadzono
dwie serie badań, w których do podłoża hodowlanego dodawano alkohol metylowy w ilościach 2, 3, 4, i 5% obj. W pierwszej serii badań alkohol metylowy dodawano do sterylnego
podłoża przed rozpoczęciem hodowli, natomiast w drugiej serii – w 45. godzinie hodowli.
Analiza wyników badań wykazała, że alkohol metylowy wpływa negatywnie na efektywność
biosyntezy kwasu cytrynowego w całym zakresie stosowanych stężeń niezależnie od momentu wprowadzenia go do podłoża fermentacyjnego. Obniżenie efektywności procesu wynikało
przede wszystkim z toksycznego oddziaływania metanolu na wzrost grzybni.
Słowa kluczowe: Aspergillus niger, kwas cytrynowy, metanol, hodowla okresowa, biosynteza
WSTĘP
Kwas cytrynowy jest powszechnie stosowany w przemyśle spożywczym, chemicznym i farmaceutycznym. Jego globalna produkcja w 2010 roku wyniosła ponad 1,8 mln
ton. Występuje on w tkankach roślinnych i zwierzęcych. Dla organizmów żywych jest
Adres do korespondencji – Corresponding author: Ewelina Dymarska, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Zakład Mikrobiologii i Biosyntezy,
ul. Komandorska 118-120, bud. H, 53-345 Wrocław, e-mail: [email protected]
24
E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz
niezbędny w szeregu reakcji cyklu Krebsa, w którym następuje oksydacja węglowodanów do ditlenku węgla i wody z uwolnieniem energii [Fiume i in. 2012]. Kwas cytrynowy obecny jest głównie w owocach cytrusowych: cytrynach (4–8%), grejpfrutach
(1,2–2,1%), pomarańczach (0,6–1,0%), mandarynkach (0,4–1,2%), a także w ananasach,
truskawkach, malinach i porzeczkach [Dziezak 2003]. Przemysłowo kwas cytrynowy
jest otrzymywany z udziałem grzybów Aspergillus niger w hodowlach wgłębnych oraz
w hodowlach w podłożach stałych. Szczepy Aspergillus niger charakteryzują się dużą
wydajnością produkcji oraz homofermentatywnością biosyntezy kwasu cytrynowego
[Pietkiewicz 2002, Papagianni 2007, Dhillon i in. 2013].
Efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego zależy od wielu czynników,
m.in. właściwości zastosowanego szczepu oraz doboru optymalnych parametrów bioprocesu. W celu uzyskania dużej wydajności procesu biosyntezy kwasu cytrynowego
wprowadzane są do podłoży stymulatory bioprocesu. Do potencjalnych stymulatorów
fermentacji cytrynowej należą alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak alkohole
metylowy, etylowy i n-propylowy [Haq i in. 2003]. Alkohol metylowy w przeciwieństwie do etanolu nie jest asymilowany przez Aspergillus niger i nie ulega konwersji
do acetylo-CoA, będącego prekursorem cyklu Krebsa. Alkohol metylowy dodany do
podłoży hodowlanych hamuje wzrost grzybni i zarodnikowanie, zmniejsza zużycie
substratu, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej, a także wpływa na aktywność syntazy cytrynianiowej oraz akonitazy [Leśniak 1974, Pazouki i in. 2000, Barrington i in. 2008].
Celem pracy było określenie wpływu metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego z sacharozy przez szczep Aspergillus niger PD-66 we wgłębnych hodowlach
okresowych prowadzonych w kolbach na wstrząsarce.
MATERIAŁ I METODY
W badaniach stosowano szczep Aspergillus niger PD-66 pochodzący z Kolekcji Czystych Kultur Katedry Biotechnologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu.
Podłoże hodowlane używane w badaniu zawierało w swoim składzie [g·dm–3]: sacharozę – 150,0; NH4NO3 – 2,0; KH2PO4 – 0,2; MgSO4 7H2O – 0,2 i wodę wodociągową
[Pietkiewicz 2002]. Kwasowość czynną regulowano przez dodatek wodnego roztworu
HCl o stężeniu 0,5 mol·dm–3 i ustalono na poziomie 3,0. Podłoże sterylizowano w temperaturze 121°C przez 30 min. Do schłodzonego podłoża dodawano około 10 cm3 przygotowanego inokulum, tak aby stężenie konidiów wynosiło 105·cm–3. Hodowle prowadzono
przez 15 dni w temperaturze 30°C, w kolbach stożkowych o pojemności 500 cm3 wypełnionych 150 cm3 podłoża, umieszczonych we wstrząsarko-inkubatorze GFL 3033 przy
prędkości wstrząsania 200 obr·min–1.
Stężenie suchej substancji biomasy grzybni oznaczono metodą wagową. Stężenie kwasu cytrynowego oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Stosowano chromatograf Perkin Elmer wyposażony w detektor UV-VIS CE przy długości fali 210 nm. W analizach zastosowano kolumnę Knauer Eurokat H65 utrzymywaną
w temperaturze 60°C w termostacie Corabid Type KB 5506. Prędkość przepływu fazy
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych
Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego...
25
mobilnej ustalono na poziomie 0,6 cm3·min–1 z zastosowaniem wody do HPLC jako fazy
wymywającej.
Do oceny przebiegu hodowli obliczono następujące parametry kinetyczne: średnią
szybkość objętościową wzrostu biomasy (RX), średnią szybkość objętościową biosyntezy
jednowodnego kwasu cytrynowego (RP), średnią szybkość właściwą biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (QP), wydajność biosyntezy biomasy w stosunku do wprowadzonego substratu (YX/S), wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
(YP/S), współczynnik efektywności biosyntezy (Kef) [Pietkiewicz 2002]. Do wykonania
obliczeń i prezentacji danych zastosowano pakiet Excel Microsoft Office 2011.
Analizę statystyczną wyników wykonano z wykorzystaniem środowiska GNU R wersja 3.1.0. Za poziom istotności statystycznej przyjęto p <0,01. Do stwierdzenia czy między badanymi grupami występują istotnie statystyczne różnice wykorzystano test nieparametryczny Kruskala–Wallisa. W celu sprawdzenia między którymi grupami występują
różnice statystyczne wykonano analizę post hoc z wykorzystaniem testu Tukeya.
WYNIKI I DYSKUSJA
140,00
0,400
120,00
0,350
0,300
100,00
0,250
80,00
0,200
60,00
0,150
40,00
Rp [g·dm-3·h-1]
P [g·dm-3]; Y p/s [%]
Podstawowe parametry kinetyczne obrazujące przebieg hodowli Aspergillus niger PD-66
w podłożu bez dodatku alkoholu metylowego przedstawiono na rysunku i w tabeli 1.
Analiza przebiegu hodowli Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu
wykazała stopniowy wzrost stężenia kwasu cytrynowego, którego maksymalny poziom
został osiągnięty w 14. dobie hodowli (126,0 g·dm–3). Końcowe stężenie biomasy w podłożu wyniosło 11,5 g·dm–3. Średnia całkowita wydajność kwasu cytrynowego w stosunku
do wprowadzonej sacharozy wynosiła 84,0% (m/m), średnia szybkość właściwa (QP) i objętościowa (RP) biosyntezy kwasu cytrynowego wyniosły odpowiednio 0,0029 g·g–1·h–1
i 0,362 g·dm–3·h–1, a współczynnik efektywności biosyntezy Kef = 30,4.
0,100
20,00
0,050
0,00
0,000
Czas [h]
P
Rys.
Fig.
Yp/s
Rp
Przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (YP/S) oraz szybkości biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (RP) w czasie wgłębnej hodowli okresowej
Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu
Time course of changes of citric acid concentration (P), yield (YP/S) and volumetric rate
(RP) of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus niger PD-66
without addition of methanol
nr 584, 2016
26
E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz
Tabela 1. Podstawowe parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we
wgłębnych hodowlach okresowych przez Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku alkoholu metylowego
Table 1. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus
niger PD-66 without addition of methanol
Symbol Jednostka
t
h
S0
g·dm–3
XK
g·dm–3
Parametr
czas trwania hodowli
–3
–1
RX
g·dm ·h
PK
g·dm–3
RP
QP
Wartości
348
początkowe stężenie cukru w podłożu
150,0
końcowe stężenie biomasy w podłożu
11,5
średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy
0,036
końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu
126,0
g·dm–3·h–1
średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
0,362
–1
0,029
–1
g·g ·h
średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
YX/S
% (m/m)
wydajność biosyntezy biomasy
YP/S
% (m/m)
Kef
–
8,4
wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
84,0
współczynnik efektywności biosyntezy
30,4
W hodowlach prowadzonych bez dodatku metanolu grzybnia Aspergillus niger rosła
głównie w postaci kuleczek o średnicy 1–2 mm oraz kłaczków o długości 1–2 mm.
W pierwszym etapie badano wpływ alkoholu metylowego, na proces biosyntezy kwasu cytrynowego, dodawanego w ilości 2, 3, 4 i 5% obj. do sterylnego podłoża przed rozpoczęciem hodowli grzybów. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2.
Przeprowadzona analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharozą. Alkohol metylowy dodany do podłoża hodowlanego przed rozpoczęciem hodowli
negatywnie wpływał na efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w całym
zakresie stosowanych stężeń. Najwyższe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego
(98,0 g·dm–3) w podłożach z dodanym alkoholem metylowym osiągnięto, stosując dawkę 2% obj., a wydajność procesu biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonej sacharozy (YP/S) wynosiła 65,3%. Stężenie kwasu cytrynowego
w podłożu zmniejszało się wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego, osiągając
48,7 g·dm–3 przy 5% dawce metanolu. Alkohol metylowy hamował wzrost grzybni. Zawartość biomasy w podłożu malała wraz ze wzrostem stężenia metanolu, osiągając przy
dawce 5% wartość 7,64 g·dm–3, a przy dodatku metanolu w ilości 2–4% następowała
niewielka redukcja zawartości biomasy. W podłożach zawierających alkohol metylowy
dodany w ilości od 2 do 4% pleśń Aspergillus niger rosła w postaci rozproszonych strzępek i drobnych kuleczek tworzących puszystą grzybnię. Przy 5% dodatku alkoholu metylowego powstawały kuliste agregaty grzybni o średnicy około 4 mm.
W drugim etapie badań określano wpływ alkoholu metylowego dodawanego w ilości
2, 3, 4 i 5% obj. w 45. godzinie hodowli. Wyniki badań wpływu dawki alkoholu metylowego wprowadzonej do podłoża hodowlanego w 45. godzinie hodowli na biosyntezę
kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD-66 przedstawiono w tabeli 3.
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych
Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego...
27
Tabela 2. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych
hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach metanolu dodanego na początku hodowli
Table 2. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergillus niger PD-66 with different concentration of methanol added at the beginning of the
cultivation
Symbol
Jednostka
Parametr
2
3
4
5
348
348
348
348
348
t
h
S0
g·dm–3
początkowe stężenie cukru w podłożu
150,0 150,0 150,0 150,0 150,0
XK
g·dm–3
końcowe stężenie biomasy w podłożu
12,48 11,88 11,08 11,06
RX
czas trwania hodowli
Dawka metanolu [%]
0
7,64
g·dm–3·h–1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,036 0,034 0,032 0,034 0,022
końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu
126,0
g·dm–3·h–1
średnia szybkość objętościowa biosyntezy
jednowodnego kwasu cytrynowego
0,362 0,282 0,209 0,198 0,140
QP
g·(g–1·h–1)
średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
0,029 0,024 0,019 0,017 0,018
YX/S
% (m/m)
wydajność biosyntezy biomasy
8,4
7,9
7,4
7,8
5,1
YP/S
% (m/m)
wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu
cytrynowego
84,0
65,3
48,5
46,0
32,4
Kef
–
współczynnik efektywności biosyntezy
30,4
18,4
10,2
9,1
4,5
PK
g·dm–3
RP
98,0
72,8
69,0
48,7
Tabela 3. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych
hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach alkoholu metylowego dodanego w 45. godzinie hodowli
Table 3. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergillus
niger PD-66 with different concentration of methanol added at 45 hours of the cultivation
Jednostka
t
h
S0
g·dm–3
początkowe stężenie cukru w podłożu
150,0 150,0 150,0 150,0 150,0
XK
g·dm–3
końcowe stężenie biomasy w podłożu
8,72
średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy
0,025 0,028 0,025 0,019 0,016
końcowe stężenie jednowodnego kwasu
cytrynowego w podłożu
115,2
–3
Parametr
Dawka metanolu [%]
Symbol
czas trwania hodowli
–1
0
2
3
4
5
348
348
348
348
348
9,60
8,72
6,60
5,48
RX
g·dm ·h
PK
g·dm–3
RP
g·dm–3·h–1
średnia szybkość objętościowa biosyntezy
jednowodnego kwasu cytrynowego
0,331 0,201 0,068 0,041 0,024
QP
g·(g–1·h–1)
średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego
0,038 0,021 0,008 0,006 0,004
YX/S
% (m/m)
wydajność biosyntezy biomasy
8,7
9,6
5,8
4,4
3,7
YP/S
% (m/m)
wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu
cytrynowego
76,8
46,7
15,9
9,6
5,6
Kef
–
współczynnik efektywności biosyntezy
25,4
9,4
1,1
0,4
0,1
nr 584, 2016
70,0
23,8
14,4
8,4
28
E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz
Analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharozą, jednak alkohol
metylowy dodany do podłoża w 45. godzinie hodowli wyraźnie negatywnie oddziaływał na przebieg bioprocesu. Największą wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu
cytrynowego w stosunku do sacharozy (YP/S) (46,7%) osiągnięto, stosując małą dawkę
alkoholu metylowego (2%). Dodatek metanolu w ilości od 3 do 5% znacząco zmniejszał
efektywność procesu. Stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu malało
wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego i wyniosło 70 g·dm–3 przy 2% dodatku
metanolu, natomiast przy największej 5% dawce tylko 8,4 g·dm–3. Alkohol metylowy
dodany w 45. godzinie hodowli w ilości 2% sprzyjał przyrostowi biomasy, natomiast
dodany do podłoża w ilości od 4 do 5% wyraźnie hamował wzrost grzybni. Dodatek 5%
alkoholu spowodował zmniejszenie zawartości grzybni o około 60% w stosunku do jej
zawartości w próbie kontrolnej. Dodatek alkoholu metylowego wpływał na kształtowanie
morfologii grzybni Aspergillus niger PD-66. Przy dawce 2% sprzyjał tworzeniu grzybni
w postaci kuleczek o średnicy około 1 mm, a przy dodatku w ilościach od 3 do 5% grzybnia przybierała postać luźnej zawiesiny.
Uzyskane w ramach tych badań wyniki, dotyczące wpływu stężenia i różnego momentu wprowadzenia metanolu do podłoża hodowlanego na proces biosyntezy kwasu
cytrynowego, wykazały, że w podłożach syntetycznych zawierających sacharozę jako
źródło węgla alkohol metylowy wywiera toksyczny wpływ na syntezę biomasy grzybni;
hamuje on wzrost grzybni, a w konsekwencji powoduje obniżenie efektywności bioprocesu. Szczep Aspergillus niger PD-66 produkował kwas cytrynowy z największą szybkością w podłożach nie zawierających alkoholu metylowego. Dawka alkoholu metylowego
w ilości od 2 do 4% toksycznie oddziaływała na wzrost biomasy, redukując jej ilość
w nieznacznym stopniu. Podobnych wniosków dostarcza praca Roukas i Kotzekidou
[1997], w której dodatek od 1 do 4% alkoholu metylowego nie ograniczał w znacznym
stopniu wzrostu grzybni. Przy dawce 5% alkohol metylowy znacząco ograniczał wzrost
biomasy. Również El-Holi i inni [2004], badając wpływ dodatku metanolu w podłożach
zawierających sacharozę i serwatkę, zauważyli, że dawki metanolu powyżej 5% powodują znaczne ograniczenie wzrostu biomasy. Wyniki uzyskane w badaniach prezentowanych w tej pracy wykazały, że alkohol metylowy dodany do podłoży z sacharozą negatywnie oddziałuje na efektywność bioprocesu, powodując redukcję biosyntezy kwasu
cytrynowego wraz ze wzrostem jego stężenia. Wyraźnie większą redukcję ilości uzyskanego kwasu cytrynowego odnotowano, gdy alkohol metylowy dodawano w 45. godzinie
hodowli. Dawka 5% alkoholu metylowego dodana w 45. godzinie hodowli spowodowała
14-krotne zmniejszenie ilości kwasu cytrynowego w stosunku do próby kontrolnej. Ta
sama ilość alkoholu dodana przed rozpoczęciem hodowli powodowała około dwukrotny
spadek ilości kwasu cytrynowego.
Do podobnych wniosków doszedł Rugsaseel i inni [1996], którzy w celu określenia
roli metanolu w stymulowaniu procesu biosyntezy kwasu cytrynowego, przeprowadzili
badania z udziałem mutantów szczepu Aspergillus niger, charakteryzujących się zaburzeniami syntezy białek. Autorzy wykazali, że dodatek metanolu do podłoży syntetycznych
powodował ograniczenie produkcji kwasu cytrynowego oraz wzrostu grzybni wraz ze
zwiększaniem stężenia metanolu w podłożu. Mutanty charakteryzowały się większą wy-
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych
Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego...
29
dajnością procesu bez obecności metanolu. Z kolei szczep rodzicielski więcej kwasu cytrynowego wytwarzał hodowany w podłożach z dodatkiem 2% metanolu. Stąd wniosek,
że wydajność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w środowisku z metanolem zależy
od cech osobniczych stosowanych drobnoustrojów.
Mechanizm oddziaływania metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego zarówno
w podłożach syntetycznych, jak i naturalnych nie został do końca wyjaśniony. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że alkohol metylowy w podłożach z sacharozą,
szczególnie zastosowany w dużych dawkach, znacznie obniża efektywność bioprocesu.
Prawdopodobnie wynika to z faktu, że alkohol metylowy zaburza procesy metaboliczne
oraz wzrost biomasy, co skutkuje obniżeniem produkcji kwasu cytrynowego. Powoduje
on również zaburzenia w syntezie białek komórkowych we wczesnych etapach hodowli
[Rugsaseel i in. 1996, Nadeem i in. 2010]. Alkohol metylowy wpływa na przepuszczalność błon komórkowych, czego przyczyną mogą być zmiany w składzie fosfolipidów
i trójgliceroli [Podgórski 2002]. Według Jernejec i innych [1990] fosfolipidy odgrywają
istotną rolę w regulacji przepuszczalności błon dla kwasu cytrynowego. Alkohol metylowy może zaburzać kształtowanie się struktury grzybni poprzez efekt chelatowania jonów
metali takich jak jony miedzi (II), które odgrywają istotną rolę w regulowaniu zawartości
kwasów tłuszczowych glikolipidów i fosfolipidów [Benuzzi i Segovia 1996].
Przedstawione w pracy wyniki potwierdzają, że alkohol metylowy wpływa na zmniejszenie akumulowanego kwasu cytrynowego, oddziałując toksycznie na wzrost grzybni.
Twierdzeniu temu przeczą badania udowadniające pozytywny wpływ metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego w podłożach syntetycznych. W badaniach Maddox i innych
[1986] metanol w podłożach syntetycznych, zawierających galaktozę jako źródło węgla,
wywoływał efekt toksyczny poprzez ograniczenie wzrostu grzybni i zmniejszenie zużycia substratu, ale równocześnie zwiększał wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego. Ponadto alkohol metylowy hamował aktywność dehydrogenazy 2-oksyglutarowej,
co pociągało za sobą zwiększenie akumulacji kwasu cytrynowego. Również Yaykaşlı
i inni [2005] dowodzą, że alkohol metylowy w procesie biosyntezy przy użyciu unieruchomionych konidiów Aspergillus niger w podłożach z sacharozą przyczynia się do
zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego.
Większość dostępnych danych literaturowych donosi o pozytywnym wpływie niższych stężeń alkoholu metylowego na wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego
przez Aspergillus niger w podłożach naturalnych, charakteryzujących się małą czystością, np. w podłożach melasowych [Moyer 1953b, Roukas i Kotzekidou 1997, Podgórski 2002, Haq i in. 2003, Ashraf i in. 2004, Nadeem i in. 2010, Kareem 2010, Shetty
2015]. Stymulujący wpływ alkoholu metylowego dodanego do podłoży naturalnych
wynika z ograniczenia negatywnego oddziaływania na proces biosyntezy zawartych
w podłożu jonów metali, takich jak: mangan, żelazo i cynk, na które szczepy Aspergillus niger wykazują dużą wrażliwość. Alkohol metylowy natomiast zwiększa tolerancję Aspergillus niger na zawartość jonów żelaza, manganu oraz cynku występujących
w podłożach [Moyer 1953a]. Alkohol metylowy powoduje zmiany w normalnej ścieżce
metabolizmu węglowodanów, zwiększając zdolności glikolityczne, a w konsekwencji
akumulację kwasu cytrynowego. W podłożach naturalnych stymuluje produkcję kwasu
cytrynowego, wpływając na wzrost grzybni oraz zmianę składu lipidów ściany komórkowej [Shetty 2015].
nr 584, 2016
30
E. Dymarska, J.J. Pietkiewicz
WNIOSKI
Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają stwierdzić, że alkohol metylowy w podłożach syntetycznych, zawierających sacharozę jako źródło węgla, okazał się czynnikiem
negatywnie wpływającym na wydajność i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego we
wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66. Obniżenie ilości produkowanego kwasu cytrynowego było wynikiem toksycznego oddziaływania alkoholu metylowego na przyrost oraz morfologię biomasy grzybni.
LITERATURA
Ashraf H., Rehman A., Haq I., 2004. Effect of alcohols on the production of citric acid by Aspergillus niger using solid state fermentation. J. Food Technol. 2, 1, 1–3.
Barrington S., Kim J.W., 2008. Response surface optimization of medium components for citric
acid production by Aspergillus niger NRRL 567 grown in peat moss. Bioresource Technol. 99, 2, 368–377.
Benuzzi D.A., Segovia R.F., 1996. Effect of the copper concentration on citric acid productivity by
an Aspergillus niger strain. Appl. Biochem. Biotech. 3, 61, 393–397.
Dhillon G.S., Brar S.K., Kaur S., Verma M., 2013. Bioproduction and extraction optimization of
citric acid from Aspergillus niger by rotating drum type solid-state bioreactor. Ind. Crop
Prod. 41, 78–84.
Dziezak J.D., 2003. Acids. Properties and determination. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Institute of Food Research, Norwich, UK, Elsevier.
El-Holi M.A., Al-Delaimy S., 2004. Citric acid production from whey with sugars and additives by
Aspergillus niger. Afr. J. Biotechnol. 2, 10, 356–359.
Fiume M., Heldreth B., 2012. Final report. On the safety assessment of citric acid, inorganic citrate
salts, and alkyl citrate esters as used in cosmetics. Pobrane z: http://www.cir-safety.org/
sites/default/files/citric032012FR.pdf.
Haq I.U., Ali S., Qadeer M., Iqbal J., 2003. Stimulatory effect of alcohols (methanol and ethanol)
on citric acid productivity by a 2-deoxy D-glucose resistant culture of Aspergillus niger
GCB-47. Bioresource Technol. 86, 3, 227–233.
Jernejec K., Cimerman A., Vendramin M., Perdih A., 1990. Lipids of a citric-acid-producing Aspergillus niger strain grown in copper- and in manganese-supplemented media. Appl. Microbiol. Biot. 32, 6, 699–703.
Kareem S.O., Akpan I., Alebiowu O.O., 2010. Production of citric acid by Aspergillus niger using
pineapple waste. Malays J. Microbiol. 6, 2, 161–166.
Leśniak W., 1974. Przydatność niektórych substancji jako stymulatorów w procesie fermentacji
wgłębnej kwasu cytrynowego. Prace Naukowe Wyższej Szkoły Ekonomicznej We Wrocławiu 52, 74, 49–61.
Maddox I.S., Hossain M., Brooks J.D., 1986. The effect of methanol on citric acid production from
galactose by Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 23, 3, 205–205.
Moyer A.J., 1953a. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and
submerged culture. I. Nature of the alcohol effect. Appl. Microbiol. 1, 1, 1–6.
Moyer A.J., 1953b. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and
submerged culture. II. Fermentation of crude carbohydrates. Appl. Microbiol. 1, 1, 7–13.
Nadeem A., Syed Q., Baig S., Irfan M., Nadeem M., 2010. Enhanced production of citric acid by
Aspergillus niger m-101 using lower alcohols. Turk. J. Biochem. 35, 1, 7–13.
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych
Wpływ metanolu na proces biosyntezy kwasu cytrynowego...
31
Papagianni M., 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical
aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25, 244–263.
Pazouki M., Felse P.A., Sinha J., Panda T., 2000. Comparative studies on citric acid production by
Aspergillus niger and Candida lipolytica using molasses and glucose. Bioprocess Eng.
22, 4, 353–361.
Pietkiewicz J.J., 2002. Biosynteza kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w warunkach jedno- i wielostopniowych hodowli ciągłych. Prace Naukowe Akademii Ekonomicznej we
Wrocławiu. Monografie i Opracowania 927/100.
Podgórski W., 2002. Kształtowanie aktywności oddechowej i kwasotwórczej Aspergillus niger
podczas produkcji kwasu cytrynowego w podłożach z melasą trzcinową. Prace Naukowe
Akademii Ekonomicznej We Wrocławiu. Monografie i Opracowania 914/144.
Roukas T., Kotzekidou P., 1997. Pretreatment of date syrup to increase citric acid production. Enzyme Microb. Tech. 21, 4, 273–276.
Rugsaseel S., Kirimura K., Usami S., 1996. Citric acid accumulation by cycloheximide sensitive
mutant strains of Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 45, 1–2, 28–35.
Shetty V.G., 2015. Production and optimization of citric acid by Aspergillus niger using molasses
and corncob. Int. J. Pharm. Sci. 7, 5, 152–157.
Yaykaşlı K.O., Demirel G., Yaţar A., 2005. Influence of alcohols on citric acid production by Aspergillus niger A-9 entrapped in polyacrylamide gels. J. Food Eng. 70, 4, 518–522.
EFFECT OF METHANOL ON CITRIC ACID BIOSYNTHESIS FROM SUCROSE
BY ASPERGILLUS NIGER
Summary. Several factors influence the course of the Aspergillus niger culture and the
rate of citric acid biosynthesis in submerged culture. Amongst them are the kind of carbon
source and its concentration, type and concentration of metal ions present in the culture
media and the mycelium morphology. The stimulating effect of the factors on the citric
acid biosynthesis has been studied extensively. Low molecular weight alcohols, such as
methanol, ethanol and n-propanol can stimulate the biosynthesis of citric acid. The aim
of the study was to evaluate the effect of methyl alcohol on citric acid biosynthesis in
submerged batch culture by Aspergillus niger PD-66 in synthetic medium with sucrose. Two
series of tests were conducted in which the methyl alcohol was added to the culture medium
in amounts of 2, 3, 4, 5% (v/v). In the first series of tests methyl alcohol was added to the
sterile medium before the start of the culture, while in other – after period of 45 hours of
culture run. Analysis of the results showed that the methyl alcohol gives negative effect on
the efficiency of biosynthesis of citric acid over the range of concentrations used. This was
observed regardless of the time when alcohol was added to the fermentation medium. The
efficiency reduction of the process was primarily due to the toxic effects of the methanol on
the formation of mycelium.
Key words: Aspergillus niger, citric acid, methanol, batch culture, biosynthesis
nr 584, 2016