WPŁYW DODATKU GLICEROLU NA PRODUKCJĘ BIOMASY

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 13 (3) 2014, 13-22
ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line)
WPŁYW DODATKU GLICEROLU NA PRODUKCJĘ
BIOMASY DROŻDŻY CANDIDA PELLICULOSA G4KB21
Tomasz Podeszwa, Marta Wilk, Małgorzata Krzywonos
Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu
Streszczenie. Głównym produktem ubocznym produkcji biodiesla, którego ilość w ostatnich latach gwałtownie wzrosła, jest odpadowy glicerol. Na tonę wytwarzanych etylowych
lub metylowych estrów kwasów tłuszczowych przypada około 100 kg glicerolu odpadowego. Wykorzystanie odpadowego glicerolu jest jednym z najważniejszych wyzwań dla
ochrony środowiska. Celem pracy była weryfikacja możliwości produkcji biomasy komórkowej drożdży Candida pelliculosa G4KB2 z bezwodnego glicerolu cz.d.a. podczas
hodowli okresowych wytrząsanych. W pierwszym etapie badań zdolność wzrostu tych
drożdży na glicerolu bezwodnym cz.d.a. sprawdzano poprzez pasażowanie ich na modyfikowane podłoża agarowe na płytkach Petriego – YPDG (zawierające ekstrakt drożdżowy, pepton, glukozę i glicerol), a następnie YPG (ekstrakt drożdżowy, pepton, glicerol).
Hodowle inkubowano w 30°C przez 2 dni. Wpływ stężenia glicerolu na tempo wzrostu
i poziom biomasy drożdży G4KB2 przeprowadzono w dwóch powtórzeniach w podłożach
zawierających różne stężenia glicerolu, tj. 2, 5, 10, 15 oraz 20%. Hodowle inkubowano
w 30°C w wytrząsarce obrotowej (120 obr. min-1). Tempo wzrostu drożdży analizowano
poprzez pomiar gęstości optycznej (620 nm), a biomasę oznaczano metodą grawimetryczną. Najwyższy poziom biomasy (13,9 g·dm-3 po 24 godz. i 19,2 g·dm-3 po 40 godz.) uzyskano podczas hodowli zawierającej w podłożu 10% glicerolu bezwodnego.
Słowa kluczowe: biodiesel, glicerol odpadowy, biomasa drożdży, Candida pelliculosa
WSTĘP
Od kilku lat jednym z najważniejszych problemów polityki krajowej jak i światowej jest
przyszłość energetyki. Źródłem tych problemów są m.in. kurczące się zasoby naturalne
ropy naftowej, wpływające na nieustanny wzrost cen tego surowca. Problem ten, a także
inne aspekty związane z ochroną środowiska, przyczyniły się do zwiększenia zaintereso© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Małgorzata Krzywonos, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, Katedra Inżynierii Bioprocesowej, ul. Komandorska 118/120, 53-345 Wrocław, e-mail: [email protected]
14
T. Podeszwa i in.
wania nowymi, alternatywnymi źródłami energii, m.in. produkcją biopaliw. Zastosowanie
procesów transestryfikacji olejów roślinnych umożliwiło wytworzenie biodiesla, paliwa
alternatywnego dla tradycyjnie wytwarzanego paliwa dieslowskiego. Obecnie światowa
produkcja biodiesla wynosi ok. 28 mld litrów, co daje 12-krotny wzrost w stosunku do
produkcji z 2004 r. (rys. 1).
45
35
30
25
20
15
10
5
2023
2022
2021
2020
2019
2018
2017
2016
2015
2014
2013
2011
2012
2010
2009
2008
2007
2006
2005
0
2004
Produkcja biodiesla [mln dm3]
Biodeiesel production [bln dm3]
40
Lata – Years
Rys. 1. Produkcja biodiesla na świecie w latach 2004–2023 [http://stats.oecd.org]
Fig. 1. World biodiesel production in the years 2004–2023
Według OECD (The Organisation for Economic Co-operation and Development)
w 2023 r. wytwórczość biodiesla będzie wynosić ponad 40 mld litrów. Rozwijająca
się na całym świecie produkcja biopaliw olejowych, czyli estrów metylowych kwasów
tłuszczowych, spowodowała zwiększenie podaży produktu ubocznego tego procesu,
tj. glicerolu. Występowanie w skali światowej znacznych nadwyżek odpadowego glicerolu może w przyszłości spowodować poważny problem ekologiczny. Na tonę wytworzonych etylowych lub metylowych estrów kwasów tłuszczowych przypada około 200 kg
odpadowej frakcji glicerynowej, w tym około 100 kg glicerolu [Kijora i in. 1995]. Przed
wylaniem produktu ubocznego do ścieków konieczne jest jego oczyszczenie z alkoholu
i katalizatora, co zwiększa koszty produkcji biodiesla. Wysoki wskaźnik biologicznego
zapotrzebowania na tlen (BZT) glicerolu powoduje, że oczyszczalnie niechętnie współpracują z zakładami, w których jest on wytwarzany. Ta sytuacja przyczyniła się do poszukiwania nowych, przyjaznych dla środowiska zastosowań glicerolu, które jeśli nie
wpłyną na poprawę opłacalności produkcji biodiesla, to przynajmniej zmniejszą koszty
związane z jego utylizacją [Wen i Pyle 2009]. Nowe kierunki wykorzystania nadmiaru
odpadowego glicerolu obserwuje się głównie w przemyśle chemicznym jak i biotechnologicznym [Kośmider i Czaczyk 2009, Podeszwa i Janczar-Smuga 2011].
Okazuje się, że odpadowy glicerol może być utylizowany w procesach biotechnologicznych poprzez zastosowanie go jako jedyne źródło węgla w podłożach hodowlanych.
Badania wykazały, że odpadowa frakcja glicerynowa, a także jej poszczególne składniki
(glicerol, kwasy tłuszczowe, estry etylowe) są dobrymi surowcami do produkcji biomasy
komórkowej mikroalg [Wen i Pyle 2009] oraz różnych gatunków drożdży, m.in. Yarrowia
Acta Sci. Pol.
Wpływ dodatku glicerolu...
15
lipolityca, Candida utylis, C. tropicalis, C. robusta, Picha pastoris, Metschnikowia sp.,
Debaryomyces Rhodotorula mucilaginosa, R. glutinis, Cystofilobasidium capitatum
i Sporobolomyces roseus [Juszczyk i in. 2005, 2012, Juszczyk i Rymowicz 2009a, b,
Taccari i in. 2012, Petrik i in. 2013].
Często w badaniach wstępnych wykorzystuje się jako podłoże glicerol cz.d.a, by potwierdzić zdolności drobnoustrojów do wzrostu na podłożu zawierającym glicerol jako
źródło węgla, eliminując tym samym ewentualne podejrzenie wzrostu na pozostałych
20% składników glicerolu technicznego.
Ponadto, na podstawie licznych badań stwierdzono, że niektóre szczepy drożdży są
zdolne do biosyntezy z glicerolu różnych metabolitów wtórnych, m.in.: kwasu cytrynowego, lipidów, karotenoidów, etanolu czy 1,2-propanodiolu [Ashby i in. 2005, Imandi
i in. 2007, Morita i in. 2007, Rywińska i in. 2009, Valduga i in. 2009, Liang i in. 2010,
Yu i in. 2010, Jung i in. 2011, Yen i in. 2012, Petrik i in. 2013, Rywińska i in. 2013].
Celem pracy była weryfikacja możliwości produkcji biomasy komórkowej drożdży
Candida pelliculosa G4KB2 z bezwodnego glicerolu cz.d.a., będącego głównym źródłem węgla w podłożach, podczas hodowli okresowych wytrząsanych.
MATERIAŁ I METODY
Mikroorganizm
W badaniach wykorzystano szczep drożdży Candida pelliculosa G4KB2 pochodzący
z kolekcji czystych kultur Katedry Biotechnologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Szczep ten został wyizolowany z owoców sezonowych i jedyny
spośród wszystkich 25 pozyskanych szczepów drożdży środowiskowych charakteryzował się produkcją biomasy w podłożu zawierającym glicerol techniczny jako główne
źródło węgla. Szczep przechowywano na podłożu agarowym YPD na płytkach Petriego
w +4°C.
Podłoża hodowlane
W pierwszym etapie badań zdolność wzrostu drożdży Candida pelliculosa G4KB2 na
glicerolu bezwodnym cz.d.a. sprawdzano poprzez pasażowanie ich na modyfikowane
podłoża agarowe na płytkach Petriego – YPDG, a następnie YPG (rys. 2). Skład tych
podłoży przedstawiono w tabeli 1. Zaszczepione płytki inkubowano w 30°C przez 2 dni.
Kolejnym etapem doświadczenia było przeszczepienie materiału biologicznego na
płynne podłoże inokulacyjne YPG (rys. 2). W komorze laminarnej dwie kolby Erlenmayera (300 cm3), wypełnione 100 cm3 jałowego podłoża płynnego YPG (pH = 5,6),
zaszczepiono drożdżami pobranymi z płytek Petriego za pomocą jałowej ezy. Komórki
namnażane były na wstrząsarce rotacyjnej Braun Biotech – CERTOMAT S przez 48 godzin, w temperaturze 30°C przy 120 obr. min-1. Następnie podłoża inokulacyjne zostały
wprowadzone do jałowej probówki (200 cm3) i odwirowane w wirówce Sigma 4k15,
przy szybkości obrotowej 13131 obr. min-1 przez 15 min. Osad drożdżowy został zalany
podłożem YPG20% w ilości 20 cm3. Do 25 probówek Eppendorf o objętości 1,5 cm3
wprowadzono po 1 cm3 tak przygotowanej szczepionki drożdżowej (rys. 2).
Biotechnologia 13 (3) 2014
16
T. Podeszwa i in.
Absorbacja [-]
Absorbance
Rys. 2. Uproszczony schemat przygotowania podłoży do badań nad wpływem stężenia glicerolu
na przyrost biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2
Fig. 2. Simplified diagram of the preparation of substrates to study the effect of glycerol concentration on the growth of yeast biomass C. pelliculosa G4KB2
t [h]
Rys. 3. Wpływ stężenia glicerolu na wzrostu biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2
Fig. 3. Effect of glycerol concentration on the biomass growth of the yeast Candida pelliculosa
G4KB2
Acta Sci. Pol.
Wpływ dodatku glicerolu...
17
Tabela 1. Skład i przeznaczenie podłoży
Table 1. The composition and function of substrates
Nazwa
Name
Agar
YPD
Agar
YPDG
Agar
YPG
Bulion
YPG
broth
YPG
Podłoże
YPG2%
Medium
YPG2%
Podłoże
YPG5%
Medium
YPG5%
Podłoże
YPG10%
Medium
YPG10%
Podłoże
YPG15%
Medium
YPG15%
Podłoże
YPG20%
Medium
YPG20%
Skład
Composition
glukoza – 20 g, pepton P– 20 g, ekstrakt drożdżowy
Y– 10 g, agar – 20 g, woda destylowana – 1 dm3
glucose – 20 g, peptone – 20 g, yeast extract – 10 g,
agar – 20 g, distilled water – 1 dm3
glukoza – 10 g, glicerol bezwodny cz.d.a. – 10 g,
pepton – 20 g, ekstrakt drożdżowy – 10 g,
agar – 20 g, woda destylowana – 1 dm3
glucose – 10 g, glycerol anhydrous p.a. – 10 g,
peptone – 20 g, yeast extract – 10 g, agar – 20 g,
distilled water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 20 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 10 g, agar – 20 g,
woda destylowana – 1 dm3,
glycerol anhydrous p.a. – 20 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, agar – 20 g, distilled water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 20 g, pepton – 20 g, ekstrakt
drożdżowy – 10 g, woda destylowana – 1 dm3,
glycerol anhydrous p.a. – 20 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, distilled water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 20 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 10 g,
woda wodociągowa – 1 dm3
glycerol anhydrous p.a. – 20 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, tap water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 50 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 1 0 g, woda wodociągowa – 1 dm3
glycerol anhydrous p.a. – 50 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, tap water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 100 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 10 g, woda wodociągowa – 1 dm3
glycerol anhydrous p.a. – 100g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, tap water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 150 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 10 g, woda wodociągowa – 1 dm3
glycerol anhydrous p.a. – 150 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, tap water – 1 dm3
glicerol bezwodny cz.d.a. – 200 g, pepton – 20 g,
ekstrakt drożdżowy – 10 g, woda wodociągowa – 1 dm3
glycerol anhydrous p.a. – 200 g, peptone – 20 g,
yeast extract – 10 g, tap water – 1 dm3
Zastosowanie
Application
przechowywanie drożdży
na płytkach Petriego
storing yeast on Petri dishes
pierwszy etap uzdolnienia
drożdży do wzrostu
na podłożu z glicerolem
first step of growing yeast
on medium with glycerol
drugi etap uzdolnienia
drożdży C.p. do wzrostu
na podłożu z glicerolem
second step of growing yeast
on medium with glycerol
hodowle inokulacyjne
dla procesów prowadzonych
na wytrząsarce
inoculation processes carried
out in shake-flasks
analiza przyrostu biomasy
w hodowlach wytrząsanych
analysis of biomass growth
during shake-flasks
cultures
Ocenę wpływu stężenia glicerolu na tempo wzrostu i poziom biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2 przeprowadzono w trakcie hodowli wytrząsanych w podłożach:
YPG2%, YPG5%, YPG10%, YPG15% oraz YPG20% (n = 2) (tab. 1) (rys. 2). Temperatura i prędkość obrotowa wytrząsarki były takie same jak w przypadku hodowli inokulacyjnej. Odczyn pH podłoża ustalono na poziomie 5,6, używając 2M H2SO4. Wodę destylowaną zastąpiono wodą wodociągową ze względu na źródło mikro- i makroelementów.
Inokulum stanowiło 0,1% objętości płynu hodowlanego.
Biotechnologia 13 (3) 2014
18
T. Podeszwa i in.
Metody analityczne
Tempo wzrostu drożdży analizowano co 2 godziny poprzez pomiar gęstości optycznej
(próba 5 cm3) przy długości fali λ = 620 nm na spektrofotometrze (SP-830 PLUS/ Metertech). Biomasę oznaczano metodą grawimetryczną. Glicerol oraz metabolity wtórne
oznaczano metodą HPLC (Knauer; detektory UV-VIS and RI; typ kolumny, Phenomenex
ROA organic acids; wymiary kolumny, 7,8 mm i.d. × 30 mm, eluent 0,2 mM H2SO4;
szybkość przepływu, 0,5 cm3 min-1; temperatura, 65°C). Długość fali 210 nm.
Objaśnienia użytych skrótów:
μ
YC
– szybkość właściwa wzrostu [h-1] – specific biomass grow rate [h-1]
– wydajność całkowita biomasy [g biomasy/g początkowego stężenia glicerolu
w podłożu] – total biomass yield [g biomass/g initial glycerol concentration]
YP/S 24,YP/S 40 – wydajność biomasy [g biomasy/g wykorzystanego glicerolu w podłożu]
po 24 i 40 godz. [g·g-1]
biomass yield [g biomass/g used glycerol concentration] after 24 and 40 h [g·g-1]
Q24, Q40 – szybkość produkcji biomasy odpowiednio po 24 i 40 godz. [g·dm-3 h-1]
volumetric biomass production rate after 24 and 40 h [g·dm-3 h-1]
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Tempo wzrostu drożdży C. pelliculosa G4KB2 w trakcie trwania hodowli wytrząsanej,
a także poziom biomasy po 24 i 40 godz. zależały od stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym (2–20%) (rys. 3, tab. 2). Najwyższa wartość szybkości właściwej μ uzyskana
w niniejszej pracy wynosiła 0,1841 h-1. Gdy podłoże zawierało 15 i 20%, wartość ta
była niewiele niższa i wynosiła odpowiednio 0,1779 i 0,1787 h-1. Najniższą wartość tego
parametru (0,0626 h-1) otrzymano w hodowlach w podłożu zawierającym najmniejszą
ilość glicerolu, tj. 2% (tab. 2). Średnia wartość właściwej szybkości wzrostu (μ) Yarrowia lipolytica w obecności 1% glicerolu wyznaczona dla czasu 0–24 godz. określonego
przedziału czasu hodowli mieściła się w zakresie od 0,008 do 0,077 h-1 [Robak 2007].
W prezentowanych badaniach dla tego samego okresu wartość μ wynosiła od 0,1053 do
0,1121 h-1.
Tabela 2. Produkcja biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2 po 24 i 40 godz. hodowli
wstrząsanych, w podłożach zawierających różne stężenie glicerolu
Table 2. Biomass of the yeast Candida pelliculosa G4KB2 after 24 and 40 h of shake- flask culture in media containing various concentrations of glycerol
24 h
Wariant podłoża
Variant of culture medium
40 h
Biomasa
[g·dm-3]
Biomass
Szybkość właściwa
[h-1]
Specific growth rate
Szybkość właściwa
[h-1]
Specific growth rate (0–24 h)
YPG 2%
7,8
7,9
0,0626
0,1121
YPG 5%
7,6
7,8
0,1529
0,1053
YPG 10%
13,9
19,2
0,1841
0,1107
YPG 15%
10,1
13,25
0,1779
0,1108
YPG 20%
12,4
16,5
0,1787
0,1153
Acta Sci. Pol.
Wpływ dodatku glicerolu...
19
W niniejszej pracy wydajność całkowita biomasy wykazywała duże zróżnicowanie w zależności od użytego stężenia glicerolu w podłożu oraz czasu trwania hodowli
(tab. 3). Najwyższą wydajność na poziomie 0,39 g·g-1 (po 24 h i 40 h) stwierdzono w hodowli z użyciem podłoża z 20 g·dm-3 glicerolu cz.d.a. W badaniach Juszczyka i in. [2012]
wydajność procesu produkcji biomasy drożdży Pichia pastoris z wykorzystaniem glicerolu kosmetycznego była wyższa i osiągnęła wartości 0,44–0,59 g·g-1 w zależności od
pH podłoża. W niniejszej pracy dużo niższe wartości wydajności po 24 godz. (0,06–0,15
g·g-1) i po 40 godz. (0,08–0,19 g·g-1) otrzymano w pozostałych hodowlach z wyższym
stężeniem glicerolu. Tak niską wydajność procesu produkcji można tłumaczyć brakiem
zdolności drożdży C. pelliculosa G4KB2 do utylizacji wyższych niż 2% stężeń glicerolu
oraz brakiem skomponowania optymalnych warunków rozwoju drożdży w podłożu (pH,
zawartość mikro- i makroelementów, szybkość obrotowa, temperatura).
Tabela 3. Wydajność całkowita (YP/S) i objętościowa szybkość produkcji biomasy (Q) w zależności
od stężenia glicerolu w podłożu
Table 3. Effect of glycerol concentration in the medium on total yield biomass production (g·g-1)
and volumetric biomass production rate (Q)
Medium
YC24 [g·g-1]
Y P/S 24 [g·g-1]
YC40 [g·g-1]
Y P/S 40 [g·g-1]
Q24 [g·dm-3 h-1]
Q40 [g·dm-3 h-1]
YPG2%
0,39
1,22
0,39
1,20
0,33
0,20
YPG5%
0,15
0,29
0,15
0,28
0,32
0,20
YPG10%
0,14
0,39
0,19
0,49
0,58
0,48
YPG15%
0,07
0,30
0,09
0,36
0,42
0,33
YPG20%
0,06
0,35
0,08
0,43
0,52
0,41
Szybkość produkcji biomasy kształtowała się na poziomie od 0,32 do 0,58 g·dm-3 h-1
po 24 godz. oraz od 0,20 do 0,48 g·dm-3 h-1 i zależała od stężenia glicerolu w podłożu.
Największą produktywność biomasy uzyskano w wariancie hodowli z udziałem 10% glicerolu cz.d.a. (0,58 g·dm-3 h-1 po 24 godz. i 0,48 g·dm-3 h-1 po 40 godz.). Wyniki szybkości
produkcji biomasy w niniejszej pracy są zdecydowanie niższe niż otrzymali Juszczyk i in.
[2012] dla drożdży Pichia pastoris na glicerolu kosmetycznym (1,32–1,71 g·dm-3 h-1).
Uzyskana ilość biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2 w podłożu zawierającym
10% glicerolu jest wynikiem bardzo obiecującym i porównywalnym z wynikami produkcji biomasy innych gatunków drożdży. Taccari i in. [2012] przeprowadzili badania
dotyczące możliwości wzrostu i optymalizacji produkcji biomasy wybranych drożdży
w podłożu wzbogacanym czystym i technicznym glicerolem. Spośród 113 przebadanych
przez nich szczepów, należących do rodzajów Candida, Debaryomyces, Lachancea,
Kluyveromyces, Tetrapisispora, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Yarrowia, Rhodotorula, Metschnikowia, Aureobasidium, Kodamaea i Amauroascus, aż 45 charakteryzowało się dobrym wzrostem na czystym glicerolu. Dwadzieścia trzy szczepy były zdolne
do produkcji biomasy drożdży w ilości porównywalnej z tymi hodowanymi w podłożu
zawierającym glukozę (12–17 g·dm-3). Dzięki zastosowaniu metodologii powierzchni
odpowiedzi (RSM) ustalono optymalne stężenie glicerolu technicznego i temperaturę
hodowli wstrząsanej do produkcji biomasy drożdży przez szczepy Yarrowia lipolytica
DiSVA C 12.1 (60 g·dm-3 glicerolu technicznego; temperatura 25°C – 25,7 g·dm-3 biomasy),
Biotechnologia 13 (3) 2014
20
T. Podeszwa i in.
Metschnikowia sp. DiSVA 50 (60 g·dm-3; 27°C – 22 g·dm-3 biomasy), Debaryomyces
sp. DiSVA 45/9 (38 g·dm-3; 26°C – 19,8 g·dm-3 biomasy) i Rhodotorula mucilaginosa
DiSVAC 7.1 (60 g·dm-3; 25°C – 20,5 g·dm-3 biomasy). Wyniki te wskazują, że glicerol techniczny może być wykorzystywany jako główne źródło węgla w hodowli wyżej
wymienionych drożdży do produkcji biomasy, a osiągnięte wyniki nie odbiegają znacznie od tych uzyskanych w niniejszej pracy (19 g·dm-3 biomasy). Należy jednak zauważyć, że stężenie glicerolu w podłożu, w przypadku hodowli C. pelliculosa G4KB2, było
o 40 g·dm-3 wyższe niż u Taccari i in. [2012] w porównaniu z hodowlą drożdży Yarrowia lipolytica DiSVA C 12.1, Metschnikowia sp. DiSVA 50, Rhodotorula mucilaginosa
DiSVAC 7,1 i o 62 g·dm-3 wyższe w porównaniu z hodowlą drożdży Debaryomyces sp.
DiSVA 45/9. Hodowle te prowadzone były również w innych temperaturach oraz w podłożach z glicerolem o innym stopniu czystości.
Juszczyk i Rymowicz [2009b] wykorzystywali w swoich badaniach frakcję glicerynową jako główne źródło węgla w hodowli szczepu Y. lipolytica ATCC 8661 UV’1. Celem
tych badań była optymalizacja dawki (NH4)2SO4, KH2PO4, autolizatu drożdży i stopnia
natlenienia pożywki dla procesu produkcji biomasy. Wykazano, że najwyższy poziom
biomasy uzyskano (około 17–19 g·dm-3) w hodowlach z dodatkiem 10 g·dm-3 (NH4)2SO4
i 34 cm3·dm-3 autolizatu drożdży, 0,125 g·dm-3 KH2PO4 i stopniem natlenienia na poziomie 35%. W innych badaniach Juszczyk i in. [2012] analizowali wpływ pH i stężenia
metanolu na produkcję biomasy drożdży Pichia pastoris. Najwyższy poziom biomasy
(19,4 g·dm-3) uzyskano w podłożu zawierającym 30 g gliceryny odpadowej z dodatkiem
(NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4·7H2O, metanolu (5 g·dm-3) i wody wodociągowej w pH 4,0.
W obu przypadkach najwyższe stężenia biomasy są niemal identyczne z wynikiem uzyskanym przez szczep C. pelliculosa G4KB2, jednak należy zaznaczyć, że hodowle te
były prowadzone w bioreaktorze w podłożach syntetycznych z wykorzystaniem glicerolu
odpadowego jako główne źródło węgla o czystości 45–50%.
Duarte i in. [2013] w swoich badaniach wykorzystywali glicerol odpadowy, wytworzony przy syntezie biodiesla, do analizy potencjału tłuszczowego dzikich drożdży.
Wstępna selekcja przeprowadzona za pomocą techniki barwienia Sudanem czarnym B
umożliwiła wybór 5 spośród 129 badanych szczepów wykorzystywanych do dalszych
analiz. Hodowle prowadzono w kolbach Erlenmayera zawierających 200 cm3 podłoża
o składzie (g·dm-3): 30 – czysty lub surowy glicerol (42,4% w/v); 7 – KH2PO4; 2,5 –
Na2HPO4; 1,5 – MgSO4·7H2O; 0,15 – CaCl2; 0,15 – FeCl3·6H2O; 0,02 – ZnSO4·7H2O;
0.06 – MnSO4·H2O; 0,5 – (NH4)2SO4; 0,5 – ekstrakt drożdżowy; pH 6,0, Hodowle inkubowano w temperaturze 28°C w wytrząsarce obrotowej (185 obr. min-1). Największą zawartość lipidów w hodowli na czystym i surowym glicerolu (20,46 i 56,58%) i najwyższy
poziom biomasy (11,86 i 16,12 g·dm-3) uzyskano przy wykorzystaniu szczepu LEB-M3,
który został zidentyfikowany genotypowo jako szczep z rodzaju Candida.
Petrik i in. [2013] przeprowadzili eksperyment dotyczący analizy wpływu glicerolu technicznego i odpadowego (83%) w podłożu hodowlanym (40 g·dm-3 podłoża)
na produkcję biomasy drożdży z rodzaju Rodothorula, Cystofilobasidium i Sporobolomyces. Wszystkie przebadane szczepy były zdolne do utylizacji glicerolu jako jedynego źródła węgla w podłożu. Najlepsze wyniki plonu biomasy uzyskano z wykorzystaniem glicerolu odpadowego (a) i technicznego (b) w przypadku drożdży R. glutinis
(a: 17,25 g·dm-3; b: 17,99 g·dm-3), R. aurantiaca (a: 19,92 g·dm-3; b: 21,16 g·dm-3),
C. capitanum (a: 21,76 g·dm-3; b: 22,53 g·dm-3) i S. shibatanus (a: 20,52 g·dm-3;
Acta Sci. Pol.
Wpływ dodatku glicerolu...
21
b: 19,90 g·dm-3). Wyniki te uzyskano w 75-godzinnych hodowlach bioreaktorowych
w 28°C. Na podstawie nieznacznych różnic w wynikach badań można przypuszczać
o zdolności utylizacji glicerolu odpadowego przez szczep C. pelliculosa G4KB2 na równie wysokim poziomie co w prezentowanej pracy. Na podstawie nieznacznych różnic
w uzyskanych wydajnościach biomasy cytowanych autorów można przypuszczać, że
zdolności utylizacji glicerolu odpadowego przez szczep C. pelliculosa G4KB2 oraz plonu biomasy są na równie wysokim poziomie co w prezentowanej pracy.
PODSUMOWANIE
Na podstawie uzyskanego plonu biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2 w opisanych
badaniach można stwierdzić, że szczep ten jest zdolny do utylizacji glicerolu i produkcji porównywalnych ilości biomasy ze szczepami z rodzaju Yarrowia, Debaryomyces,
Rhodotorula, Metschnikowia i Candida. Kolejnym etapem badań będzie optymalizacja
składu podłoża i warunków prowadzenia procesu w podłożach zawierających glicerol
bezwodny, techniczny i odpadowy oraz analiza powstających metabolitów.
PIŚMIENNICTWO
Ashby R., Nuñez A., Solaiman D., Foglia, T., 2005. Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel coproduct stream. J. Am. Oil Chem. Soc., 82, 625–630.
Duarte S.H., de Andrade C.C., Ghiselli G., Maugeri F., 2013. Exploration of Brazilian biodiversity
and selection of a new oleaginous yeast strain cultivated in raw glycerol. Bioresour Technol.
138, 377–381.
Imandi S.B., Bandaru V.R., Somalanka S.R., Garapati H.R., 2007. Optimization of medium constituents for the production of citric acid from byproduct glycerol using Doehlert experimental
design. Enzym. Microb. Technol., 40, 1367–1372.
Jung J.Y., Yun H.S., Lee J.W., Oh M.K., 2011. Production of 1,2-propanediol from glycerol in Saccharomyces cerevisiae. J. Microbiol. Biotechnol., 21, 846–853.
Juszczyk P., Musiał I., Rymowicz W., 2005. Dobór szczepów drożdży do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 4, 65–76.
Juszczyk P., Rymowicz W., 2009a. Microbial bioconversion of Raw glycerol. Nova Publish.
Juszczyk P., Rymowicz W., 2009b. Optymalizacja procesu produkcji drożdży paszowych z odpadowego glicerolu. Inż. Ap. Chem., 48, 5, 40–41.
Juszczyk P., Rymowicz W., Liszka P., 2012. Produkcja biomasy Pichia pastoris z surowców odpadowych z produkcji biodiesla. Inż. Ap. Chem., 51, 4, 138–140.
Kijora C., Bergner H., Kupsch R.-D., Hagemann L., 1995. Glycerin als Futterkomponente in der
Schweinemast. Arch. Tierernahr., 47, 345–360.
Kośmider A., Czaczyk K., 2009. Perspektywy wykorzystania glicerolu. Post. Mikrobiol., 48, 277–87.
Liang Y., Cui Y., Trushenski J., Blackburn J.W., 2010. Converting crude glycerol derived from yellow grease to lipids through yeast fermentation. Bioresour. Technol., 101, 7581–7586.
Morita T., Konishi M., Fukuoka T., Imura T. Kitamoto D., 2007. Microbial conversion of glycerol
into glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by a basidiomycete yeast, Pseudozyma antarctica JCM 10317T. J. Biosci. Bioeng., 104, 78–81.
Petrik S., Marova I., Haronikova A., Kostovova I., Breierova E., 2013. Production of biomass, carotenoid and other lipid metabolites by several red yeast strains cultivated on waste glycerol from
biofuel production – a comparative screening study. Annals Microbiol., 63, 4, 1537–1551.
Biotechnologia 13 (3) 2014
22
T. Podeszwa i in.
Podeszwa T., Janczar-Smuga M., 2011. Kierunki zagospodarowania odpadowego glicerolu. Nauki
Inżynierskie i Technologie. 3, 165–184.
Robak M., 2007. Yarrowia lipolytica specific growth rate on acetate medium supplemented with
glucose, glycerol or ethanol Acta Sci. Pol. Biotechnol. Biotechnologia, 6 (1), 23–31
Rywińska A., Rymowicz W., Żarowska B., Wojtatowicz M., 2009. Biosynthesis of citric acid from
glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica in fed-batch fermentation. Food Technol.
Biotechnol., 47, 1–6.
Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W.,
2013. Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications.
Biomass Bioenerg, 48, 148–166.
http://stats.oecd.org
Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M., 2012. Screening of yeasts for growth
on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresour Technol., 110, 488–495.
Valduga E., Tatsch P.O., Tiggemann L., Zeni J., Colet R., Cansian J.M., Treichel H., Luccio M.,
2009. Evaluation of the conditions of carotenoids production in a synthetic medium by Sporidiobolus salmonicolor (CBS 2636) in a bioreactor. Int. J. Food Sci. Technol., 44, 2445–2451.
Wen Z., Pyle D.J., 2009. Athalye SK Production of omega-3 polyunsaturated fatty acids from biodiesel-derived crude glycerol by microalgal and fungal fermentation. Microbial conversions
of raw glycerol. New York: Nova Science Publishers Inc., 41–63.
Yen H.-W., Yang Y.-C., Yu Y.-H., 2012. Using crude glycerol and thin stillage for the production of microbial lipids through the cultivation of Rhodotorula glutinis. J. Biosci. Bioeng., 114, 453–456.
Yu K.O., Kim S.W., Han S.O., 2010. Engineering of glycerol utilization pathway for ethanol production by Saccharomyces cerevisiae. Bioresour. Technol., 101, 4157–4161.
EFFECT OF GLYCEROL CONCENTRATION ON BIOMASS GROWTH
OF YEAST CANDIDA PELLICULOSA G4KB2
Abstract. The main by-product of biodiesel production, which in recent years has rocketed,
is raw glycerol. Per ton of produced ethyl or methyl esters of fatty acids about 100 kg of
raw glycerol was obtained. Utilization of raw glycerol is one of the most important and
serious challenge in the environment protection. The aim of the study was to verify the production possibility of the cell biomass yeast Candida pelliculosa G4KB2 on pure glycerol
in shake-flask cultures. In the first stage of the study, ability of growth on pure glycerol
yeast Candida pelliculosa G4KB2 was checked by passaging them in a modified agar Petri
dishes – YPDG (YE, peptone, dextrose, glycerol) then YPG (YE, peptone, glycerol). Cultures incubated at 30°C for 2 days. Effect of glycerol concentration on the growth rate and
biomass of G4KB2 were performed in duplicate in media containing: 2, 5, 10, 15 and 20%
of glycerol. Cultures were incubated at 30°C on an orbital shaker (120 rpm). The growth
rate of the yeast was analyzed by measuring the optical density and biomass concentration was determined gravimetrically. The highest biomass growth (13.9 g·dm-3 at 24 h and
19.2 g·dm-3after 40 h) was obtained during culture in medium containing 10% of pure
glycerol.
Key words: biodiesel, raw glycerol, yeast biomass, Candida pelliculosa
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.12.2014
Do cytowania – For citation: Podeszwa T., Wilk M., Krzywonos M., 2014. Wpływ
dodatku glicerolu na produkcję biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2. Acta Sci.
Pol. Biotechnol., 13 (3), 13–22.
Acta Sci. Pol.