Zestaw surowic do identyfikacji serologicznej bakterii

Zestaw surowic do identyfikacji serologicznej bakterii

Zestaw SIT EnTy
Zestaw surowic do identyfikacji serologicznej bakterii
Salmonella Enteritidis i Typhimurium.
W związku z wprowadzeniem w 2011 roku przez Komisję UE zmian 1
w rozporządzeniach nr 2160/3003 i 2073/2005 w odniesieniu do „Salmonelli w świeżym
mięsie drobiowym”, które kładą szczególny nacisk na wykrywanie i identyfikację
serowarów S. Enteritidis i S. Typhimurium1(9) przygotowaliśmy dla Państwa skrócony
zestaw surowic do identyfikacji serologicznej wymienionych szczepów.
W skład zestawu wchodzą surowice, które służą do szczegółowej identyfikacji
zalecanych szczepów. Istotnym jest rozpoznanie i potwierdzenie serologiczne bakterii
Salmonella przy jednoczesnym wykluczeniu innych typów serologicznych o podobnym
składzie antygenów rzęskowych (skrócony schemat Kauffmann-White-Le Minor znajduje się
na stronie internetowej naszej Firmy www.immunolab.com.pl , w zakładce: „do pobrania”).
Jednocześnie pragniemy także zwrócić Państwa uwagę na jednofazowe szczepy
Salmonella Typhimurium, które odznaczają się szczególną zjadliwością dla ludzi
i zwierząt 1(13).
Informacje dla użytkownika
Wprowadzenie
Bakterie Salmonella są jedną z głównych przyczyn zatruć pokarmowych. Pośród
bakterii z gatunku Salmonella enterica można wyróżnić 2579 różnych serotypów. 80%
salmonelloz wywoływanych jest przez serotypy Salmonella Enteritidis oraz Salmonella
Typhimurium. Ze względu na wciąż obecne zakażenia produktów żywnościowych, w
tym szczególnie mięsa drobiowego, istotnymi są kontrola żywności, diagnostyka oraz
dokładna identyfikacja zakażeń.
Bakterie Salmonella posiadają antygeny somatyczne (O) oraz rzęskowe (H). Ich
identyfikacja jest niezbędna do prawidłowego serologicznego zakwalifikowania
badanego szczepu. Antygen somatyczny (O) jest lipopolisacharydem, który można
określać u bakterii pobranych z podłoża twardego wzbogaconego, np. 1,5%. Natomiast
antygeny rzęskowe (H) są białkami. Antygeny te są najlepiej wykształcone, gdy bakterie
rosną na podłożu miękkim wg Garda. Istotną cechą bakterii Salmonella jest posiadanie
jednej lub dwóch faz antygenów rzęskowych, np. szczep Salmonella Enteritidis posiada
tylko jedną fazę H:g,m, natomiast szczepy Salmonella Typhimurium mogą posiadać
jedną fazę H:i lub dwie fazy H:i oraz H:1,2. W danym momencie ekspresji ulega tylko
jedna faza, dlatego aby móc zidentyfikować drugą fazę należy zahamować ekspresję
obecnej fazy dominującej. Pozwoli to na ujawnienie drugiej fazy (patrz: Hamowanie fazy
dominującej).
Wyprodukowane przez nas surowice zawierają przeciwciała przeciwko
specyficznym antygenom somatycznym lub rzęskowym. Aglutynacja szkiełkowa
przebiega na zasadzie przyłączania się przeciwciał do antygenów bakterii i tworzenia
tzw. agregatów/strątów (Rys.1), które są widoczne gołym okiem. Tworzenie się
aglutynatów jednocześnie powoduje zwiększanie przejrzystości kropli, w której zostały
zawieszone bakterie.
Bakterie
z zaznaczonymi
antygenami
Przeciwciała
Rys. 1
1
Zastosowanie
Surowice produkowane w Zakładzie Immunolab są króliczymi surowicami
poliklonalnymi. Surowice w przygotowanym zestawie pozwalają na pełną identyfikację
serologiczną szczepów Salmonella Enteritidis oraz Salmonella Typhimurium zgodnie
z zaleceniami1).
Skład
Surowice do aglutynacji pałeczek Salmonella są wykonane z surowic królików
szczepionych inaktywowanymi szczepami bakterii. Są one kontrolowane z zestawami
szczepów i preparowane w rozcieńczeniach pozwalających na uzyskanie czytelnego
odczytu w krótkim czasie. Surowice są rozcieńczone w 0,85% NaCl i konserwowane
0,01% mertiolatem w postaci gotowej do użycia.
Zestaw SIT EnTy zawiera 15 buteleczek surowic wraz z zakraplaczem: HM po 5 ml,
O:4; O:9; O:46; H:g,m; H:m; H:q; H:s; H:t; H:i; H:2; H:5, H:6 po 3 ml, oraz H:i i H:2 do
hamowania reakcji niepożądanych o pojemności 2ml. Dodatkowo dołączamy podłoże
Garda do przygotowania 5x0,5l podłoża 0,5%, którego skład wspomaga rozwój
antygenów rzęskowych bakterii Salmonella.
Sposób postępowania
Po przeprowadzeniu testów biochemicznych, których wyniki sugerują, że badane
szczepy należą do rodzaju Salmonella należy:
1. Badane szczepy hodować w temperaturze 37 0C przez 20 godzin na podłożu
stałym (dla określenia antygenów somatycznych – 1,5% agar odżywczy, dla
antygenów rzęskowych – podłoże miękkie wg Garda).
2.
Wykonać test aglutynacji szkiełkowej (patrz: Schemat kolejności postępowania)
 Przed użyciem doprowadzić surowice do temperatury pokojowej (18-24ºC).
W przypadku zmętnienia surowice odwirować przy 4000-5000 RPM przez
30 min.
Wykonywanie identyfikacji należy zacząć od sprawdzenia szczepu z 3%
roztworem NaCl.
Jeśli wystąpi aglutynacja, oznacza to, że szczep jest w fazie szorstkiej
i wykazuje auto-aglutynację. Takiego szczepu nie można identyfikować
serologicznie w teście aglutynacji szkiełkowej.
Następnie przeprowadza się aglutynację z poliwalentną surowicą HM.
Pozytywny wynik potwierdza, że badany szczep należy do rodzaju
Salmonella.
Wykonanie:
I. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym umieścić kroplę NaCl lub
surowicy.
II. Opaloną, ostudzoną ezą lub jałową bagietką pobrać szczep z podłoża
i umieścić obok kropli. Rozcierać szczep na szkiełku łącząc z surowicą tak,
aby powstała jednolita zawiesina o mlecznym kolorze.
eza
2
III. Kołysząc lekko szkiełkiem ruchem kolistym przez 10 – 30 sekund
(najdłużej do 1 minuty!) obserwować wynik reakcji.
Uważać, aby kropla nie ściekła ze szkiełka.
Aglutynacja „+++”
Brak aglutynacji „–”
 aglutynaty
 zwiększanie się przezroczystości kropli
 brak strątów
 „mleczna” kropla
Aglutynacja jest lepiej widoczna, jeśli wynik reakcji obserwuje się nad
ciemnym tłem.
NIE DOPUSZCZAĆ DO WYSCHNIĘCIA KROPLI, GDYŻ DAJE TO WYNIK
FAŁSZYWIE POZYTYWNY.
 Wykonać badanie z surowicami O:9 i O:4.
Pozytywna reakcja z jedną z surowic pozwala na wstępne określenie grupy
serologicznej. [Brak reakcji wskazuje ma konieczność prowadzenia badań
z dalszymi surowicami dla antygenów grupowych. Oznacza to, że w badanym
materiale nie ma bakterii S. Enteritidis ani S. Typhimurium, ale mogą być inne
szczepy Salmonella].
 Do przeprowadzenia pełnej identyfikacji antygenów rzęskowych należy
posiać bakterie na podłoże z agarem miękkim 0,5% wg Garda i inkubować
w 370C przez 20 godzin.
Materiał do aglutynacji pobiera się
z obrzeży porośniętego obszaru płytki.
!
Należy pamiętać o tym, że samo potwierdzenie obecności pożądanych
antygenów nie wystarczy. Trzeba wykluczyć możliwe występowanie innych
antygenów, które odróżniają szczepy Salmonella od Salmonella Enteritidis
i Typhimurium.
Poniżej zostały przedstawione właściwe wyniki reakcji potwierdzające obecność
Salmonella Enteritidis (Tabela 1) oraz Salmonella Typhimurium (Tabela 2):
Tabela 1
Sól/Surowica
Wynik
3% NaCl
-
HM
+++
O:9
+++
Salmonella Enteritidis
O:46 H:g,m H:m H:q H:p
+++
+++
-
H:s
-
H:t
-
H:u
-
+++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem
- reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina
3
Tabela 2
Sól/Surowica
Wynik
3% NaCl
-
Salmonella Typhimurium *
HM
O:4
H: i
H:2
H:5
+++
+++
+++
+++
-
H:6
-
* Należy pamiętać, że występują również jednofazowe szczepy Salmonelli
Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-
+++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem
- reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina
Dodatkowe informacje dla identyfikacji Salmonella Typhimurium
Jeśli aglutynacja z surowicą H:i jest dodatnia, a z surowicą H:2 nie, oznacza to silną
pierwszą fazę szczepu, którą trzeba zahamować. Drugą fazę wzmacnia się przez
hamowanie fazy dominującej poprzez dodanie do miękkiego agaru 0,5% wg Garda
surowicy z przeciwciałami przeciwko antygenom silnej fazy, w tym wypadku surowicy
H:i (szczegółowa procedura: Hamowanie fazy dominującej) . Jeżeli po zahamowaniu fazy wciąż
nie uzyskuje się potwierdzenia fazy H:2, H:5 ani H:6 należy przyjąć, że ma się do
czynienia z jednofazowym szczepem S.Typhimurium.
Hamowanie fazy dominującej
Hamowanie przeprowadza się na płytkach z agarem miękkim wg metody S. Garda,
w sytuacji, gdy silne występowanie jednej z faz uniemożliwia wykrycie drugiej fazy
szczepu.
Sposób postępowania:
1. Upłynnić przygotowany wg przepisu agar miękki wg Garda 0,5% w kuchence
mikrofalowej i schłodzić do temperatury 45°C.
2. Nakropić zakraplaczem 5 kropli surowicy H do hamowania na środek dna małej,
sterylnej płytki Petriego (Ø 5 cm).
Silna faza H:i -> hamowanie surowicą H:i do hamowania w celu wzmocnienia
ekspresji fazy H:2
Silna faza H:2 -> hamowanie surowicą H:2 do hamowania w celu wzmocnienia
ekspresji fazy H:i
3. Do nakropionej surowicy dodać ok. 10 ml agaru miękkiego wg Garda 0,5%
i wymieszać delikatnie kołysząc płytką.
4. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej, aż do stężenia agaru. (Nie suszyć!)
5. Za pomocą ezy pobrać hodowlę z płytki agarowej lub z hodowli bulionowej
i zaszczepić agar w centralnej części.
6. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
7. Materiał z peryferyjnych części płytki jest odpowiedni do wykonania aglutynacji
szkiełkowej.
Jeśli dominująca faza H nie została zahamowana, należy powtórzyć procedurę.
(Materiał do ponownego zaszczepienia
przeprowadzano wcześniejsze hamowanie).
należy
pobrać
z
płytki,
na
której
Przechowywanie i środki ostrożności
Surowice należy przechowywać w temperaturze od 20C do 80C. - NIE ZAMRAŻAĆ!.
Chronić od światła.
4
Czasami po przedłużonym okresie przechowywania widoczna jest zmętnienie
spowodowane wytrąceniem lipoprotein. Wytrącenie można usunąć poddając surowicę
wirowaniu (4000-5000 RPM przez 30 min).
Nie stosować po upływie terminu ważności zamieszczonego na opakowaniu.
1
ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 1086/2011
z dnia 27 października 2011 r. zmieniające załącznik IIdo rozporządzenia (WE) nr 2160/2003 Parlamentu
Europejskiego i Rady oraz załącznik I do rozporządzenia Komisji (WE) nr 2073/2005 w odniesieniu do
Salmonelli w świeżym mięsie drobiowym.
(9) Zgodnie ze wspólnotowym sprawozdaniem zbiorczym w sprawie tendencji w chorobach
odzwierzęcych i ich źródeł, zwierzęcych czynników chorobotwórczych oraz ognisk chorób
przenoszonych przez żywność w Unii Europejskiej w 2008 r. ( 5 ) przygotowanym przez Europejski
Urząd Bezpieczeństwa Żywności około 80 % przypadków salmonellozy u ludzi wywoływanych jest przez
Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium, podobnie jak w latach poprzednich. Mięso drobiowe
pozostaje najważniejszym źródłem salmonellozy u ludzi.
(13) Jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium szybko stały się jednym z najbardziej
rozpowszechnionych serotypów Salmonelli u kilku gatunków zwierząt i w izolatach klinicznych od ludzi.
Zgodnie z opinią naukową w sprawie monitorowania i oceny zagrożenia dla zdrowia publicznego
stwarzanego przez szczepy podobne do Salmonella Typhimurium ( 6 ) jednofazowe szczepy Salmonella
Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- są uważane za odmiany Salmonella Typhimurium i,
jak wykazują obecne dowody, stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego porównywalne do
zagrożenia stwarzanego przez inne szczepy Salmonella Typhimurium. Należy zatem wyjaśnić, że
przepisy dotyczące Salmonella Typhimurium mają zastosowanie także do tych szczepów
jednofazowych.
Producent
Zakład Badawczo-Wdrożeniowy Ośrodka Salmonella „IMMUNOLAB Sp. z o.o.”
Adres:
81- 451 Gdynia, Al. Zwycięstwa 96/98
Tel./Fax: 058 781-44-91
E-mail: [email protected]
5
Schemat kolejności wykonywania testu aglutynacji szkiełkowej
Szczep bakteryjny po przeprowadzeniu szeregu biochemicznego podejrzewany o przynależność do rodzaju Salmonella (posiany na agar 1,5%)

Aglutynacja wstępna z 3% NaCl
[+++]
[-]
Aglutynacja obecna - szczep nie może zostać
zidentyfikowany
Brak aglutynacji

Aglutynacja wstępna
z surowicą HM
[-]
[+++/++]
Brak aglutynacji - szczep nie należy do
rodzaju Salmonella
Aglutynacja obecna

Identyfikacja z surowicami O
O:9 i O:4 wg tabeli 1 i 2
O:4
-
O:9
+++

O:46
-
O:4
+++
O:9
-

Przesianie bakterii na podłoże miękkie wg Garda
(Pobieranie materiału z obrzeży porośniętej strefy)
Identyfikacja z odpowiednimi surowicami H
wg tabeli 1 i 2
H:g,m
+++
H:m
+++
H:q
-
H:s
-
H: i
+++
H:t
-
H:2
+++

H:5
-
H:6
-

Salmonella Enteritidis
Salmonella Typhimurium*
* Należy pamiętać, że występują również jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium o wzorze antygenowym: 1,4,[5],12:i:O:4
+++
O:9
-
H: i
+++
H:2
-
H:5
-
H:6
-
6