Prokariotyczne i eukariotyczne systemy produkcji rekombinowanych

Prokaryotyczne i eukaryotyczne
systemy nadekspresji bialek.
Czyli jak produkować dużo, latwo i tanio
dr Marcin Golebiewski
,
Zaklad Biotechnologii,
Wydzial Biologii i Nauk o Ziemi,
Uniwersytet Mikolaja Kopernika,
Toruń
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
1
Nadekspresja bialek
Produkcja i oczyszczanie bialek ma znaczenie zarówno naukowe, jak i przemyslowe:
jeżeli chcemy scharakteryzować jakiejś bialko (określić jego strukture,
, zbadać
aktywność itp.) musimy je oczyścić w dostatecznej ilości
istnieja, bialka, które wykorzystuje sie, przemyslowo (enzymy, szczepionki itd.),
ich tania produkcja na duża, skale, ma wówczas kluczowe znaczenie
Systemy do nadekspresji bialek pozwalaja, nadprodukować bialka, czasem też
ulatwiaja, ich oczyszczanie.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
2
Systemy nadekspresji - rodzaje
Systemy nadekspresji bialek można podzielić ze wzgledu
na różne kryteria,
,
najważniejsze z nich to:
• przynależność taksonomiczna organizmu w którym system dziala
. systemy prokaryotyczne
. systemy eukaryotyczne
• “tryb” ekspresji
. systemy konstytutywne
. systemy indukowalne
W przypadku ukladów dzialajacych
w wyższych Eukaryota można je podzielić
,
jeszcze na:
. stransformowane “na stale”
. eksprymujace
przejściowo (transient expression)
,
. tkankowo, organowo, ukladowo specyficzne
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
3
. nadprodukujace
we wszystkich komórkach
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
4
Systemy ekspresyjne, co w tym siedzi?
W sklad ukladów do nadekspresji wchodza, minimum dwa elementy:
1. wektor
2. szczep (linia) gospodarza
Wektor musi dawać możliwość wprowadzenia go do gospodarza, wyselekcjonowania klonów, które go pobraly i stabilnego utrzymywania sie, w trakcie
hodowli.
Najistotniejszym dla ekspresji elementem wektora jest promotor.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
5
Dobór ukladu
Wybór ukladu w którym bedziemy
nadprodukować bialko zależy od wielu
,
czynników, np.:
• pochodzenia i rodzaju bialka
• potrzebnej ilości
• czy zamierzamy je potem oczyszczać
• do czego ma slużyć
• naszych możliwości sprzetowo-finansowych
,
Dobranie wlaściwego systemu jest pierwszym z kluczowych etapów w produkcji bialka.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
6
Systemy prokaryotyczne
Prokaryotyczne uklady do nadprodukcji bialek najcześciej
dzialaja, w Es,
cherichia coli. Praktycznie zawsze sa, to systemy indukowalne.
Stosujemy je z wyboru, kiedy nadeksprymujemy bialko bakteryjne (z dowolnej
bakterii), badź
male bialko eukaryotyczne, które nie jest glikozylowane, ani w
,
inny sposób modyfikowane posttranslacyjnie.
Zalety tych systemów to:
• latwość manipulacji genetycznych w bakteriach (szczególnie w E. coli)
• duża wydajność (do 50% totalnego bialka)
• latwość i niski koszt hodowli
• możliwość prostego przeskalowania hodowli do rozmiarów przemyslowych
Natomiast wady:
• trudno jest nadprodukować duże bialka
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
7
• brak eukaryotycznych modyfikacji posttranslacyjnych
• bialka eukaryotyczne moga, sie, źle faldować
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
8
Systemy eukaryotyczne
Eukaryotyczne uklady do nadprodukcji bialek podzielić można na pracujace
,
w jednokomórkowych Eukaryota (np. drożdżach) i te oparte na wyższych eukaryontach.
Dalej mamy podzial ukladów “wielokomórkowych” na dzialajace
w liniach
,
komórkowych (owadzie, ssacze) i w calych organizmach (roślinne, zwierzece).
,
System eukaryotyczny wybieramy zwracajac
, uwage, na pokrewieństwo organizmu z którego pochodzi bialko i organizmu w którym prowadzona bedzie
,
nadprodukcja, wymagania co do modyfikacji posttranslacyjnych i możliwości
techniczno-finansowe.
Generalnie uklady oparte na liniach komórkowych trudno sie, skaluje, pozostale można skalować wzglednie
latwo.
,
Oczyszczanie bialka z eukaryontów jest trudniejsze, niż z bakterii.
Wydajności nie sa, tak duże, jak w przypadku prokaryontów.
Manipulacje DNA w organizmach wyższych sa, dużo trudniejsze, niż w bakteriach, dlatego wiekszość
operacji wykonuje sie, w E. coli. Przedluża to procedure,
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
9
- trzeba przygotowany konstrukt wprowadzić do organizmu docelowego.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
10
Przyklady systemów ekspresyjnych
1. Systemy prokaryotyczne
• pET28 + E. coli BL21(DE3)
2. Systemy eukaryotyczne
• Systemy drożdżowe
. pPICZ + Pichia pastoris
• Systemy roślinne
. wektory z promotorem alc z Aspergillus nidulans + np. Solanum tuberosum
• Systemy zwierzece
,
. pBAC (wektor oparty na baculovirusie) + linia komórek owadzich
. pT-REx-DEST30 + linia komórek ludzkich
. pBC1 + mysz
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
11
Uklad bakteryjny - pET28 + E. coli BL21(DE3)
Uklad oparty jest na ekspresji z promotora faga T7. Jest to bardzo silny
promotor, dzialajacy
wylacznie
z polimeraza, RNA faga T7.
,
,
Polimeraza znajduje sie, pod kontrola, promotora laktozowego w genomie
gospodarza (BL21(DE3)).
Pomiedzy
promotorem, a poczatkiem
wyrażanej ramki jest operator lakto,
,
zowy, co daje podwójna, kontrole.
,
Zalety: bardzo duża i ściśle regulowana ekspresja, tani, latwo skalowalny.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
12
Wady: bakteryjny. . .
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
13
Uklad roślinny - pSRN + pAlc + Lycopersicon esculentum
Nie mam map plazmidów, ale postaram sie, o nich opowiedzieć.
Uklad oparty jest na silnym, indukowalnym promotorze genu alc z Aspergillus
nidulans.
Czynnik transkrypcyjny blokujacy
promotor alc (produkt genu alcR)
,
wyrażany jest spod konstytutywnego promotora wirusa mozaiki kalafiora (CMV)
w T-DNA plazmidu pomocniczego (pSRN).
Plazmid ekspresyjny zawiera w T-DNA wyrażany gen pod kontrola, promotora
alc.
Obydwa plazmidy wprowadza sie, do roślin przy pomocy Agrobacterium tumefaciens z plazmidem Ti.
Indukcja ekspresji nastepuje
po spryskaniu transgenicznych roślin etanolem
,
badź
aldehydem octowym.
,
Zalety: dobrze kontrolowana, silna ekspresja, latwa i tania indukcja, latwość
skalowania
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
14
Wady: trudne oczyszczanie bialek, roślinny wzór glikozylacji (to może też być
zaleta, ;))
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
15
Uklad zwierzecy
- pT-REx-DEST30 + HeLa
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
16
Uklad zwierzecy
- pT-REx-DEST30 + HeLa
,
Uklad oparty jest na wczesnym promotorze cytomegalowirusa. Promotor
ten jest konstytutywny, ale dzieki
umieszczeniu za nim (a przed wyrażana,
,
ramka)
, dwóch sekwencji operatora tetracyklinowego (tetO2 ) jest on regulowany
przez tetracykline.
, Do tego wymagana jest obecność represora tetracyklinowego
(TetR) w komórkach gospodarza.
Wektor stabilnie utrzymuje sie, w komórkach ssaczych dzieki
replikonowi
,
wirusa SV40.
Można stosować dowolna, linie, komórkowa, jeżeli stransformuje sie, ja, plazmidem wyrażajacym
TetR, albo używa sie, linii z TetR produkowanym z sekwencji
,
wintegrowanej w genom.
Zalety: ssacze modyfikacje posttranslacyjne
Wady: dluga lista. . . Skomplikowanie, mala wydajność ekspresji, trudno
skalować, drogie, wymaga używania kultur komórek ssaczych itd. itp.
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
17
Uklad zwierzecy
- pBC1 + Mus musculus
,
Uklad jest oparty na silnym, tkankowo specyficznym promotorze koziej βkazeiny. Promotor ten jest aktywny wylacznie
w gruczole mlecznym w okresie
,
laktacji.
Wektor nie utrzymuje sie, sam w komórkach gospodarza, wymaga integracji.
Zalety: stosunkowo wysoka wydajność ekspresji (ok. 100-1000× wyższa, niż w
przypadku systemów opartych na kulturach komórkowych), ssacze modyfikacje,
wzgledna
latwość oczyszczania bialka z mleka.
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
18
Wady: doiliście kiedyś myszy??? No i drobny problem ze skonstruowaniem
transgenicznego zwierzaka (a w naszym pieknym
kraju jeszcze dostaniem zez,
wolenia na próbe, konstrukcji tegoż).
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
19
Podsumowanie
Dla każdego coś sie, znajdzie - to tylko kwestia dobrania odpowiedniego
ukladu.
I pieniedzy.
..
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
20
Dziekuj
e, za uwage,
,
Dziekuje, za uwage!
,
Marcin Golebiewski,
WBiNoZ UMK Toruń
,
21