Dom Handlowy Nauki Sp z o

WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW FIZYKOCHEMICZNYCH
(TEMP., PH I AKTYWATORÓW) NA AKTYWNOŚĆ AMYLAZY ŚLINOWEJ.
MALONIAN JAKO INHIBITOR KOMPETYCYJNY DEHYDROGENAZY
BURSZTYNIANOWEJ
A. WPŁYW WYBRANYCH CZYNNIKÓW FIZYKOCHEMICZNYCH (TEMP., pH I
AKTYWATORÓW) NA AKTYWNOŚĆ AMYLAZY ŚLINOWEJ.
CEL PRACY:
Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu pH i temperatury na aktywność amylazy ślinowej w procesie
hydrolizy skrobi.
PRZYGOTOWANIE ROZTWORU AMYLAZY ŚLINY:
 Roztwór amylazy ślinowej przygotowywany jest przez całą grupę;
 Każdy student proszony jest o pobranie kilka cm3wody ogrzanej do ok.
40C do ust i po kilkunastu sekundach wyplucie do zlewki.
 czynność proszę powtórzyć kilkakrotnie, aż do uzyskania wystarczającej ilości roztworu amylazy
– ok. 200 cm3.
WYKONANIE ĆWICZENIA:
I. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę
1. Przygotować 2 szeregi po 10 oznaczonych probówek. Do probówek w I szeregu wlać po 1 cm 3
0,005% roztworu J w KJ, do probówek II szeregu dodać po kilka kropli 0,1 M roztworu NaOH.
Statyw należy przenieść w pobliże łaźni wodnej nastawionej na temp. 40C, wraz z pipetami na
amylazę ślinową, skrobię i hydrolizat. Dopiero, kiedy dwa szeregi są gotowe do osobnej probówki
odmierzyć 5,5 cm3 świeżo przygotowanego 1% roztworu skrobi i 5,5 cm3 roztworu amylazy śliny.
2. ZARAZ po dokładnym zmieszaniu (od tego momentu powinien być mierzony czas) pobrać do pipety
„hydrolizat” 1 cm3 mieszaniny i przenieść 0,5 cm3 do pierwszej probówki pierwszego szeregu
i 0,5 cm3 do pierwszej probówki drugiego szeregu, probówkę z hydrolizatem wstawić do łaźni wodnej
o temp. 40C
Pierwsza probówka
drugiego szeregu
Pierwsza probówka
pierwszego szeregu
3. W krótkich odstępach czasu (co 30 sek. OD MOMENTU ZAMIESZANIA) do probówek w obu
szeregach wprowadzać próbki hydrolizatu o objętości 0,5 cm3. Obserwować przebieg reakcji barwnej
z jodem.
4. Po wprowadzeniu hydrolizatu w odstępach 30-to sekundowych do wszystkich probówek, do
probówek w II szeregu dodać 2 cm3 roztworu Fehlinga. Probówki II szeregu wstawić do wrzącej łaźni
wodnej do momentu pojawienia się pomarańczowego osadu Cu2O, świadczącego o redukcji miedzi z
+2 na +1 stopień utlenienia. Po pojawieniu się osadu probówki wyjąć z łaźni wodnej wstawić do
statywu i porównać oba szeregi pod kątem zmian dokonywanych przez amylazę ślinową w skrobi.
Skrobia ulega stopniowej hydrolizie tworząc produkty pośrednie: amylo- erytro- achro- i
maltodekstryny. Zanik zabarwienia z roztworem J w KJ nosi nazwę punktu achromowego.
II.
Wpływ pH:
1.
Przygotować 3 zestawy po 5 probówek. Do każdej probówki odmierzyć 1 cm3 0,005% roztworu
J w KJ.
2.
Przygotować 3 probówki. Do I probówki dodać 2 cm3 buforu uniwersalnego o pH=3,0, do II
probówki dodać 2 cm3 buforu uniwersalnego o pH=6,0, do III probówki dodać 2 cm3 buforu
uniwersalnego o pH=10,0. Do każdej z probówek odmierzyć po 2 cm3 1% roztworu skrobi i 2 cm3
roztworu amylazy śliny.
3.
Zaraz po zmieszaniu składników z I probówki pobrać 0,5 cm3
hydrolizatu i przenieść do pierwszej probówki pierwszego
szeregu (czas T=0`). Czynność powtórzyć dla pozostałych
probówek II i III, przenosząc 0,5 cm3 odpowiednio do
pierwszych próbówek szeregu drugiego i trzeciego.
4.
Probówki I, II i III w których jest hydrolizat w odpowiednim
pH wstawić do łaźni wodnej (temp. 40C).
5.
Po czasie 10 min od czasu zmieszania z I probówki pobrać
kolejne 0,5 cm3 hydrolizatu i przenieść do drugiej probówki
pierwszego szeregu (czas T=10`). Czynność powtórzyć dla
pozostałych probówek II i III, przenosząc 0,5 cm3 odpowiednio
do drugich próbówek szeregu drugiego i trzeciego.
6.
Po czasie 15, 20, 30 minut (od zmieszania) do probówek
w szeregach wprowadzić próbki hydrolizatu o obj. 0,5 cm3.
7.
W przypadku braku zabarwienia roztworu w probówkach
w szeregu trzecim wprowadzić do nich kilka kropli 0,1% HCl.
8.
Odwrotność czasu (1/t) potrzebnego do osiągnięcia punktu
achromowego jest miarą szybkości reakcji. Sporządzić wykres
zależności 1/t od wartości pH w którym doszło do osiągnięcia punktu achromowego i sformułować
wniosek o zależności pomiędzy aktywnością amylazy ślinowej, a pH środowiska reakcji.
III. Wpływ temperatury na aktywność amylazy:
1.
Przygotować 5 probówek
2.
Do I, II, III i IV wprowadzić po 3 cm3 buforu uniwersalnego o pH=6,0 oraz po 3 cm3 1% roztworu
skrobi.
3.
Do I, II i III wprowadzić po 2 cm3 0,005% roztworu J w KJ.
4.
Amylazę ślinową po 3 cm3 wprowadzić do probówek I, II, III, i V. Wszystkie probówki dokładnie
zmieszać.
5.
I probówkę umieścić w zamrażalniku lodówki (temp. 0C), II probówkę pozostawić na stole
laboratoryjnym (temp. pokojowa), III próbówkę umieścić w łaźni wodnej (temp. 40C), a IV i V
umieścić w łaźni wodnej wrzącej.
6.
Po około 2 min. pobytu w łaźni wodnej wrzącej zmieszać zawartości probówek IV i V i całość
inkubować dalej we wrzącej łaźni wodnej.
7.
Wszystkie barwne probówki obserwować, w momencie CAŁKOWITEGO odbarwienia
którejkolwiek z barwnych probówek, wszystkie probówki z każdej z temperatur umieścić w statywie,
probówkę wyciągniętą z łaźni wrzącej należy najpierw ochłodzić pod strumieniem zimnej wody,
a następnie dodać do niej 2 cm3 0,005% roztworu J w KJ.
8.
Na podstawie różnic w zabarwieniu roztworów w poszczególnych probówkach wyciągnąć
i zanotować wniosek o zależności aktywności amylazy ślinowej od temperatury.
B. MALONIAN JAKO
BURSZTYNIANOWEJ
INHIBITOR
KOMPETYCYJNY
DEHYDROGENAZY
Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną ściśle związaną z wewnętrzną błoną
mitochondrialną. Enzym ten utlenia bursztynian do fumaranu, a w warunkach fizjologicznych akceptorem
protonów i elektronów jest ubichinon.
W oznaczeniach aktywności enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej in vitro stosowany jest
sztuczny akceptor elektronów - heksacyjanożelazian (III) potasu (K3[Fe(CN)6].) Elektrony powstające w
reakcji utleniania bursztynianu powodują redukcję żółtego heksacyjanożelazianu (III) potasu do
bezbarwnego heksacyjanożelazianu (II) potasu wg reakcji przedstawionej poniżej:
Aktywność dehydrogenazy bursztynianowej jest więc proporcjonalna do stopnia redukcji K3[Fe(CN)6].
Heksacyjanożelazian (III) potasu absorbuje światło o długości fali () 420 nm. Ponieważ absorbancja jest
wprost proporcjonalna do stężenia związku w określonym zakresie jego stężeń, dlatego też śledząc
zmianę absorbancji przy  = 420 nm można wnioskować o zmianie stężenia heksacyjanożelazianu (III)
potasu.
Miarą aktywności dehydrogenazy bursztynianowej jest więc ilość zredukowanego heksacyjanożelazianu
(III) potasu, a tym samym spadek absorbancji roztworu przy  = 420 nm.
WYKONANIE ĆWICZENIA:
1. Przygotować mieszaniny inkubacyjne na podstawie zamieszczonej poniżej tabeli.
Próbówka 1 - próba kontrolna bez substratu .
Próbówka 2 - próba kontrolna bez aktywnego enzymu.
Numer próbówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,05 M bursztynian sodowy
(ml)
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
2,0
2,0
2,0
2,0
0,05 M malonian sodowy
(ml)
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0
0
0,5%K3[Fe(CN)6]
(ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Woda destylowana
(ml)
3,0
2,9
2,9
2,9
2,8
2,8
0,9
0,9
1,0
1,0
0,1 M bufor fosforanowy pH=6,0
(ml)
2.
Do próbówki nr 2 dodać 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego (związek o właściwościach
denaturujących).
3.
Wprowadzić do każdej próbówki po 0,5 ml homogenatu wątroby będącego źródłem aktywnej
dehydrogenazy bursztynianowej.
4.
Wymieszać zawartość próbówek i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
5.
Przerwać reakcję enzymatyczną poprzez dodanie 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego (TCA) do każdej
próbówki (za wyjątkiem próbówki nr 2).
6.
Odwirowywać osad zdenaturowanych białek.
7.
W otrzymanym supernatancie oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm względem wody.
8.
Obliczyć i wpisać do tabeli stężenia substratu dehydrogenazy bursztynianowej (bursztynianu) i jej
inhibitora (malonianu) w poszczególnych próbówkach.
SPRAWOZDANIE
WYNIKI POMIARU ABSORBANCJI
Numer
próbówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
WNIOSKI
Cbursztynianu
[mol/dm3]
Cinhibitora
[mol/dm3]
A