Ekspresja genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w

Ekspresja genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
%KSPRESJAGENÌWZWI’ZANYCHZREGULACJ’CYKLUKOMÌRKOWEGO
WKOMÌRKACHBIAŒACZKIPROMIELOCYTARNEJ(,†
EKSPONOWANYCHNACISPLATYNÃ
%XPRESSIONOFGENESASSOCIATEDWITHCELLCYCLEREGULATION
INPROMYELOTICLEUKEMIACELLS(,†EXPOSEDTOCISPLATIN
!DAM7ILCZOK!LICJA:AJDEL*AKUB7ILCZOK!GNIESZKA+ŒYCH-ONIKA0AUL†3AMOJEDNY
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
!PTEKA`'RANDnW#HORZOWIE
+ATEDRAI:AKŒAD'ENETYKI-EDYCZNEJ7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Cisplatyna, lek przeciwnowotworowy stosowany w monoterapii jak i terapii skojarzonej wielu nowotworów, zaliczana jest do cytostatyków o działaniu niezależnym od
cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od
ich stadium rozwoju. Aktywność przeciwnowotworowa
cisplatyny jest związana z procesami regulacji cyklu komórkowego, a największe jej wiązanie do DNA ma miejsce podczas fazy S cyklu komórkowego. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A
(Affymetrix) porównywano ekspresję genów związanych
z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki
promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę
oraz w komórkach kontrolnych. Analizując sygnały fluorescencji 160 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, reprezentujących ekspresję 84
genów bezpośrednio związanych z fazą G1, przejściem
G1/S, syntezą DNA i jego replikacją, fazą G2, przejściem
G2/M, punktami kontrolnymi, pozytywną regulacją cyklu komórkowego lub jego zatrzymaniem wykazano, że
w badanych komórkach cisplatyna najsilniej stymuluje
ekspresję genów BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1
oraz hamuje ekspresję NBN i BCL2. Poznanie efektów
zmienionej ekspresji tych genów jest szczególnie istotne
dla określenia mechanizmu działania leku oraz powstawania oporności.
Abstract
Cisplatin, an anticancer drug used in monotherapy and
combined therapy of various tumors belongs to cytostatics which destroy cells undepending on the phase of their
division. Cisplatin antitumour activity is associated with
cell cycle regulation processes and its strongest binding
to DNA takes place in the S phase of the cell cycle. Using
oligonucleotide microarray technique (HG-U133A, Affymetrix) the expression pattern of genes associated with
the cell cycle regulation in HL-60 promyelotic leukemia
cells exposed to cisplatin and control cells was compared.
Analysis of the fluorescence signals of 106 probes selected from NetAffx Analysis Center database, which represent expression of 84 genes directly related to G1 phase,
G1/ S transition, DNA synthesis and its replication, G2
phase, G2/M transition, cell cycle checkpoints, and positive regulation of the cell cycle or its arrest, showed that in
the tested cells, cisplatin in the greatest extent stimulates
expression of BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 and
decreases expression of NBN and BCL2 genes. Determination of effects of altered expression of these genes is
particularly important for understanding of drug action
mechanism, including acquired resistance to cisplatin.
Key words: cisplatin, gene expression, cell cycle, promyelocytic leukemia cells, HL-60
Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, cykl komórkowy, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60
Wstęp
Cisplatyna jest lekiem przeciwnowotworowym stosowanym zarówno w monoterapii jak i terapii skojarzonej
guzów przerzutowych jąder i jajników, szyjki macicy, raka
pęcherza moczowego, płasko komórkowego raka głowy
i szyi oraz raka płuc często w połączeniu z winblastyną,
bleomycyną, etopozydem i doksorubicyną. Cisplatyna, podobnie jak karboplatyna, cyklofosfamid, ifosfamid, melfa-
lan, dakarbazyna, czy antracykliny (doksorubicyna, daunorubicyna, daktynomycyna), zaliczana jest do cytostatyków
o działaniu niezależnym od cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od ich stadium rozwoju. Mechanizm działania leku, który jest podobny do działania związków alkilujących polega na hamowaniu replikacji DNA na
skutek tworzenia silnych wiązań między- i wewnątrzłańcuchowych w DNA. Tworzenie adduktów Pt – DNA jest przyczyną cytotoksyczności cisplatyny [1-3].
&ARM0RZEGL.AUK
Analiza danych dotyczących ekspresji genów w linii
ludzkich komórek raka jajnika A2780 poddanych działaniu
cisplatyny lub oksaliplatyny wykazała, że leki te wpływają
na procesy związane z odpowiedzią komórek na uszkodzenia DNA, cyklem komórkowym, apoptozą i naprawą DNA
oraz różnymi ścieżkami przekazywania sygnałów i szlakami
metabolicznymi [4]. Działanie cisplatyny nie jest fazowospecyficzne, chociaż największe jej wiązanie do DNA ma
miejsce w fazie S cyklu komórkowego [3]. Regulacja cyklu
komórkowego odbywa się przez uruchamianie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji białek katalizowanych przez różnorodne kinazy białkowe oraz fosfatazy. Kinazy białkowe układu kontroli cyklu komórkowego, których
aktywność zależy od nagromadzenia i rozpadu cyklin, są
obecne w komórkach dzielących się podczas całego cyklu.
W czasie cyklu komórkowego cykliny A, C, D i E są syntetyzowane w miarę upływu cyklu, zaś cyklina B jest syntetyzowana w fazie G2. Maksymalne stężenie cyklin występuje
podczas mitozy, po czym ulega ono obniżeniu na skutek
trawienia ich przez proteazy. Aktywacja kinaz zachodzi
w dwóch krytycznych przedziałach czasowych tzw. punktach kontrolnych cyklu komórkowego, w fazie G1 prowadzi do przejścia z fazy G1 do S i zapoczątkowania syntezy
DNA, natomiast pod koniec fazy G2 prowadzi do przejścia
G2 do M i zapoczątkowania mitozy. Przejście z późnej fazy
G2 do M następuje w rezultacie aktywacji kinazy MPF, znanej jako czynnik wywołujący dojrzewanie [5, 6].
Jak wynika z badań wykonanych na komórkach hodowanych w warunkach laboratoryjnych, zmiany w ekspresji
genów widoczne są w czasie od 2 godzin do nawet 24 godzin ekspozycji na cisplatynę. Zarówno rodzaj jak i liczba
genów ulegających nadekspresji lub hamowaniu ekspresji
zależy od zastosowanych w eksperymencie linii komórek,
a ponadto od czasu narażenia na ten cytostatyk [7, 8].
W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za odpowiedź komórek nowotworowych na działanie cisplatyny,
a przy okazji na mechanizmy decydujące o braku wrażliwości na ten lek, poddaliśmy ocenie zmiany w ekspresji genów
związanych z regulacją cyklu komórkowego. Czas ekspozycji na cisplatynę został ograniczony do sześciu godzin,
aby nie obserwować wtórnych efektów zmian w ekspresji
genów związanych, np. z śmiercią komórki, które utrudniłyby interpretację wyników ze względu na ich nakładanie
się z efektami pierwotnej odpowiedzi komórek na ten lek.
Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkach laboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki
promielocytarnej HL-60, które wykazują istotną wrażliwość
na cisplatynę [9, 10]. Badania ekspresji genów zostały wykonane z zastosowaniem techniki mikromacierzy oligonukleotydowych firmy Affymetrix.
Materiał i metody
Hodowle komórkowe
Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiej
linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowych warunkach (37°C, 5% wysycenie atmosfery CO2),
w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco) wzbogaconej
10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma), 100 μg
/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma), 2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l
glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawano
roztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO (Sigma) tak aby uzyskać stężenie 0,22 μg/ml, odpowiadające
wartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolne
prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach
czystego DMSO, stosowanego ze względu na ograniczoną
rozpuszczalność cisplatyny. Po 6 godzinach inkubowania
hodowli komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji
RNA.
Ekstrakcja całkowitego RNA
RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL
(Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty
RNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1%
żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech).
Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix)
Całkowite RNA (8μg) zostało wykorzystane do syntezy
dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego
cRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzację
z mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie
produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo
kompleksem streptawidyna – fikoerytryna, znakowanymi
przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna – fikoerytryna zgodnie
z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene
Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W następnym etapie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent
Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray
Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych.
Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono
po normalizacji wyników w programie RMA Express polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log2) wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric,
oraz Microsoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych z cyklem komórkowym dokonano korzystając z bazy
danych Affymetrix NetAffx™ Analysis Center (http://www.
affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniu kwerendy „cell cycle”, komercyjnie dostępnego zestawu przeznaczonego do badania genów cyklu komórkowego firmy
SABiosciences oraz danych literaturowych. Z grupy 22283
sond mRNA, obecnych na mikromacierzy HG-U133A,
wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnały fluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO), (SLR – ang.
signal log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach,
strzałka á - nadekspresja, strzałka â - spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę, * - geny
kandydujące)
nazwa sondy
symbol genu
211833_s_at
BAX
204315_s_at
GTSE1
208478_s_at
BAX
210206_s_at
DDX11
203626_s_at
SKP2 *
203362_s_at
MAD2L1 *
202907_s_at
NBN *
203685_at
BCL2 *
nazwa kodowanego białka
Białko związane z BCL2
(BCL2-associated X protein)
Białko 1 ulegające ekspresji w fazach G2 i S
(G2 and S-phase expressed 1)
Białko związane z BCL2
(BCL2-associated X protein)
Zależna od ATP RNA helikaza DDX11
(ATP-dependent RNA helicase DDX11)
Białko 2 związane z kinazą fazy S (p45)
(S-phase kinase-associated protein 2 (p45))
MAD2 element punktu kontrolnego wrzeciona mitotycznego
(MAD2 mitotic arrest deficient-like 1)
Nibryna, kompleks naprawy uszkodzeń DsDNA
(NBN, Nibrin)
Białka rodziny BCL2
(BCL2)
transkryptów związanych z regulacją cyklu komórkowego.
Porównując sygnały fluorescencji tych sond, uzyskane dla
komórek kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę,
wyznaczono zbiory genów o ekspresji różniącej się więcej
niż ± 2SLR - tzw. genów różnicujących oraz zbiory genów,
których ekspresja była większa niż ± 2s, lecz mniejsza niż
± 2SLR – tzw. genów kandydujących.
Wyniki
Analiza zawartości bazy danych Affymetrix NetAffx
Analysis Center wykazała 6550 genów (stan na dzień
28.10.2009), których funkcja jest chociaż w najmniejszym
stopniu powiązana z regulacją cyklu komórkowego. Spośród tych genów, do oznaczenia zmian w ich aktywności wywoływanych przez cisplatynę w komórkach HL-60
wybrano 84, które wydają się być bezpośrednio związane
z tym procesem. Analizie poddano ekspresję genów uczestniczących w fazie G1 cyklu komórkowego oraz w przejściu G1/S: ANAPC2, CCND1, CCNE1, CDC34, CDK4,
CDK6, CDKN1B, CDKN3, CUL1, CUL2, CUL3, SKP2,
genów fazy S i replikacji DNA: ABL1, MCM2, MCM3,
MCM4, MCM5, PCNA, RPA3, SUMO1, UBE1, genów fazy
G2 oraz uczestniczących w przejściu G2/M: ANAPC2, DIRAS3, BCCIP, BIRC5, CCNB1, CCNG1, CCNH, CCNT1,
CCNT2, CDK5R1, CDK5RAP1, CDK7, CDKN3, CKS1B,
CKS2, DDX11, DNM2, GTF2H1, GTSE1, HERC5, KPNA2,
MNAT1, a także genów od których zależy przebieg fazy M:
CCNB2, CCNF, CDC2, CDC16, CDC20, MRE11A, RAD51.
Ponadto porównano ekspresję genów regulujących punkty
kontrolne i zatrzymanie cyklu komórkowego: ATM, ATR,
BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDC2, CDC34, CDK2, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CDKN3, CHEK1,
CHEK2, CUL1, CUL2, CUL3, GADD45A, HUS1, KNTC1,
MAD2L1, NBN, RAD1, RAD17, RAD9A, RB1, RBBP8,P53.
Zbiór analizowanych genów uzupełniono o geny regulują-
wartość SLR
1,66 ↑
1,39 ↑
1,31 ↑
1,17 ↑
0,968 ↑
0,887 ↑
-0,758 ↓
-0,799 ↓
ce cykl komórkowy: ABL1, ANAPC2, ANAPC4, DIRAS3,
ATM, ATR, BCCIP, BCL2, BRCA2, CCNB1, CCNB2, CCNC,
CCND1, CCND2, CCNE1, CCNF, CCNH, CCNT1, CCNT2,
CDC16, CDC2, CDC20, CDK2, CDK4, CDK5R1, CDK6,
CDK7, CDK8, CDKN1A, CDKN1B, CKS1B, DDX11, E2F4,
GADD45A, KNTC1, MKI67, PCNA, RAD9A, RB1, SKP2,
TFDP1, TFDP2, w tym również odpowiedzialne za negatywną regulację: ATM, BAX, BRCA1, CDKN2B, RBL1,
RBL2, P53. Genom tym przyporządkowano 160 sond na
mikromacierzy HG–U133A.
Podczas analizy porównywano wartości sygnałów ekspresji genów uzyskane dla komórek hodowanych w obecności cisplatyny rozpuszczonej w DMSO z sygnałami
otrzymanymi dla hodowli, do której dodano tylko DMSO
stanowiącej układ odniesienia. Zmierzone wartości sygnałów fluorescencji dla genów różnicujących oraz genów
o najbardziej zmienionej ekspresji, tzw. genów kandydujących, które, mimo iż znacznie różnią się ekspresją, nie spełniają kryterium genu różnicującego zestawiono w tabeli I.
Cisplatyna, dodana do hodowli komórek HL-60, powoduje
stymulację ekspresji BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1
oraz hamowanie NBN i BCL2. Geny te pełnią bardzo istotne
funkcje w procesach regulujących cykl komórkowy.
Dyskusja
Analizując wyniki uzyskane w przedstawianej pracy,
w pierwszej kolejności należy przypomnieć, jakie funkcje
w badanych komórkach pełnią geny, których ekspresja pod
wpływem cisplatyny uległa największej stymulacji bądź
hamowaniu. Gen BAX, którego ekspresja znacząco wzrosła, jest odpowiedzialny za kodowanie białka powiązanego
z Bcl2 (Bax), które jest niezbędne dla inicjacji uwalniania
cytochromu c oraz innych czynników proapoptotycznych
z zewnętrznej błony mitochondrium i przez to do aktywacji
kaspaz podczas apoptozy. Białko supresorowe nowotworów
&ARM0RZEGL.AUK
P53 powoduje wzrost ekspresji BAX. U ssaków rodzinę białek Bcl2 dzieli się na 3 podrodziny: podrodzinę Bcl2 (np.
B-, Bcl-xl, Bcl-xs, A1), podrodzinę Bax (Bax, Bak, Bok)
oraz podrodzinę BH3 (Bad, Bik, Bid). Białka z podrodziny
Bcl2 (z wyjątkiem Bcl-xs) są inhibitorami apoptozy, natomiast białka z podrodziny Bax i BH3 są promotorami aktywnej śmierci komórki [11]. Obserwowana w komórkach
HL-60 nadekspresja BAX, może warunkować wrażliwość
na cisplatynę. Przypuszczenia te znajdują potwierdzenie w
badaniach Perego i wsp., w których zaobserwowano, że komórki oporne na lek charakteryzują się niskim poziomem
białka BAX [12]. Wysoka ekspresja genu BCL2 z niską
ekspresją białka BAX są przyczyną niskiej śmiertelności
i oporności komórek na chemioterapię. Obserwowane w
wyniku oddziaływania cisplatyny na komórki HL-60 obniżenie ekspresji BCL2 oraz zwiększenie ekspresji BAX,
wynika najprawdopodobniej z niewystarczającego poziomu
białka BAX, niezbędnego w komórce podlegającej procesowi apoptozy. Gen GTSE1 bierze udział w syntezie G2
i S enzymatycznego białka 1, ulegającego ekspresji w fazach S oraz G2 cyklu komórkowego, które w odpowiedzi
na uszkodzenie DNA gromadzi się w jądrze i wiąże białko P53, powodując jego przemieszczenie z jądra i hamując
jego zdolność do indukowania apoptozy. Nagromadzenie
się białka GTSE1 powoduje opóźnienie przejścia komórki
z fazy G2 do M [13]. Kolejnym z genów, którego ekspresja w komórkach HL-60 uległa zwiększeniu pod wpływem
cisplatyny jest DDX11 koduje enzym, zależną od ATP helikazę RNA. Jego funkcja jest najprawdopodobniej związana
z utrzymywaniem jakości przekazywania chromosomów
i stabilności genomu. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost ekspresji SKP2 – genu kodującego białko 2 związane z kinazą fazy S, które specyficznie rozpoznaje fosforylowany zależny od cyklin inhibitor 1B, znany
również jako p27, przede wszystkim w fazie S i oddziałuje
z białkiem 1 związanym z kinazą fazy S (SKP1, p19). Co
ciekawe gen ten określany jest jako proonkogenny i współuczestniczący w patogenezie białaczek [14], biorąc pod
uwagę skuteczność działania cisplatyny, wzrost ekspresji
tego genu należy uznać za niepożądany. MAD2L1, którego
ekspresja w próbach eksponowanych na cisplatynę, również uległa zwiększeniu, koduje białko będące składnikiem
punktu kontrolnego tworzenia wrzeciona mitotycznego, który zapobiega przejściu do anafazy do momentu, gdy chromosomy nie są prawidłowo ułożone na płytce metafazowej
i w ten sposób uniemożliwia podział komórki [15]. W badanych komórkach HL-60, poza omówionym już obniżeniem
ekspresji BCL2, cisplatyna powoduje obniżenie ekspresji
NBN, genu, który koduje białko nubrynę (nibrynę). Białko
to bierze udział w naprawie pęknięć w dwuniciowym DNA,
które w poważnym stopniu uszkadzają genom [16].
Warto zauważyć, że wzrost ekspresji genu nie zawsze
przekłada się bezpośrednio na wzrost stężenia kodowanego
przez ten gen białka. Ponieważ ekspresja genu za pomocą
mikromacierzy oligonukleotydowych mierzona jest na poziomie transkrypcji, a często zależność pomiędzy transkrypcją i translacją regulowana jest na zasadzie sprzężenia
zwrotnego, można założyć, że wysoki poziom ekspresji
genu może być także odzwierciedleniem obniżonego stężenia białka, np., gdy jego synteza nie zachodzi lub zachodzi
wolniej na skutek błędów podczas translacji w rybosomach,
na skutek degradacji białka, a nawet jego nieprawidłowej
lokalizacji w komórce.
Zależność pomiędzy zatrzymaniem cyklu komórkowego
i cytotoksycznością jest bardzo złożona. W szeregu opublikowanych prac jednoznacznie potwierdzono, że przeciwnowotworowa aktywność cisplatyny jest związana z procesami
regulacji cyklu komórkowego [17-19]. W komórkach raka
jajnika cisplatyna powoduje zwiększenie ekspresji genów
kodujących białka niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania punktu kontrolnego G2/M: WEE1, CDC25C oraz
CCNB1, a także genu CDC6 [19]. Indukcja apoptozy przez
cisplatynę jest uważana za podstawowy mechanizm jej aktywności przeciwnowotworowej. Ekspozycja na cisplatynę
prowadzi do aktywacji wielu szlaków molekularnych, włączając kinazy aktywowane mitogenami oraz P53 [20]. Już
1990 roku odkryto, że wywoływane przez cisplatynę zaburzenia kontroli cyklu komórkowego mogą mieć miejsce
zanim komórka wchodzi w fazę S lub po replikacji DNA
[21]. Przez to zatrzymanie wzrostu komórki może nastąpić
zarówno w fazie G1 jak i G2/M. Gdy uszkodzenie DNA
następuje w punkcie kontrolnym G1/S, zatrzymanie cyklu
komórkowego jest zwykle zależne od P53. Szlak P53 jest od
dawna uważany za kluczowy w odpowiedzi na czynniki genotoksyczne, w tym również cisplatynę [19]. Uszkodzenia
DNA prowadzą do nagromadzania P53 poprzez hamowanie
degradacji zależnej od ubikwityny. Gen P53 może indukować transkrypcję genów istotnych dla punktów kontroli cyklu komórkowego jak również zaangażowanych w śmierć
komórki [22]. Ponadto reguluje on szereg innych specyficznych tkankowo genów, co umożliwia odpowiednio dostosowaną odpowiedź komórek. Cisplatyna powoduje znaczny
wzrost aktywności białek P53 i P21 oraz zmniejszenie aktywności białka P27 [23]. Jednakże nie wszystkie aspekty
odpowiedzi przez punkt kontrolny G1 na stres genotoksyczny mogą być łączone z szlakiem P53, ponieważ hamowanie CDK2 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA zachodzi
nawet w komórkach nie syntetyzujących P53 lub P21 [24].
Komórki HL-60 zastosowane w przedstawianej pracy charakteryzują się w znacznym stopniu zmutowaną sekwencją
i funkcją TP53 [25]. Istotna jest tu rola cyklin. Badania wykazały, że wywołane przez cisplatynę uszkodzenie DNA
może indukować zatrzymanie G1 poprzez dwuetapowy proces: szybkie zatrzymanie G1 niezależne od szlaku P53 spowodowane przez proteolizę cykliny D1 i wolniejsze utrzymywanie zatrzymania, wynikające z wzrostu stabilności P53
[26]. Akumulacja komórek w fazie G1 jest rzadko spotykana, ponieważ komórki najczęściej pozostają zablokowane
w punkcie G2/M i to ten właśnie punkt kontrolny odgrywa
kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. W fazie
G2 komórki są zdolne do zapoczątkowania zatrzymania cyklu komórkowego w obecności jak i nieobecności P53 [27].
Przejście do mitozy jest uniemożliwiane przez utrzymywanie CDK1 (Cdc2) w zahamowanej formie poprzez brak fosforylacji, albo poprzez sekwestrację składników kompleksu
CDK1 – cyklina B poza jądrem. Aktywacja punktów kontrolnych przez cisplatynę, może czasowo indukować zatrzymanie fazy S, po czym następuje hamowanie kinaz Cdc2
cyklin A i B powodujące długotrwałe zatrzymanie G2/M.
Ponadto, chociaż głównym celem P21 jest udział w fazie
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
G1 cyklu komórkowego, pełni on również funkcję regulacyjną w utrzymaniu zatrzymania w fazie G2 poprzez blokowanie interakcji Cdc25c [28]. Ponieważ hamujący efekt
adduktów cisplatyny z DNA na zależne od cyklin kinazy
białkowe fazy G1 (CDKs) jest późniejszym wydarzeniem
w sekwencji aktywacji tego punktu kontrolnego i jest najprawdopodobniej wspomagany przez p16INK4A - inhibitor
CDK4, uważa się, że zatrzymanie cyklu komórkowego, jako
konsekwencja uszkodzenia DNA, jest niezbędne dla kompleksu naprawiającego DNA poprzez wycinanie nukleotydów (NER), aby mógł on usunąć addukty i umożliwić przeżycie komórki [29]. Taka naprawa DNA jest jedną z wielu
przyczyn powstawania oporności komórek na cisplatynę.
Tylko, gdy naprawa DNA nie jest kompletna, co następuje podczas znacznego uszkodzenia DNA po zastosowaniu wyższych stężeń cisplatyny, komórki mogą ulegać
apoptozie. Naprawa DNA jest nierozerwalnie związana
z aktywacją punktów kontrolnych cyklu komórkowego
oraz apoptozą, a wszystkie trzy procesy są w zależny od
siebie sposób związane z białkiem supresorowym nowotworu P53.
Przedstawione w niniejszej pracy wyniki badań, sugerują, że cisplatyna w znaczący sposób modyfikuje ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego
w komórkach HL-60. Dokładne poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz sposobu powstawania
i przeciwdziałania oporności.
Wnioski
1. Dodanie cisplatyny do hodowli komórek HL-60
znacznie wpływa na ekspresję genów związanych z
regulacją cyklu komórkowego.
2. Wpływ cisplatyny na ekspresję poszczególnych genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w
komórkach HL-60 nie jest jednakowy - geny BAX,
GTSE1 oraz DDX11 wykazują najbardziej stymulowaną ekspresję, natomiast ekspresja genów NBN i
BCL2 jest najbardziej hamowana w porównaniu do
komórek hodowli kontrolnych.
3. Poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest
niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku i prognozowania skuteczności terapii.
Piśmiennictwo
1. Einhorn LH. Curing metastatic testicular cancer. Proc
Natl Acad Sci 2002; 99: 4592–95.
2. Wang G, Reed E, Li QQ. Molecular basis of cellular response to cisplatin chemotherapy in non-small cell lung
cancer (Review). Oncol Rep 2004; 12: 955-65.
3. Lippert B. Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a
Leading Anticancer Drug. Wiley-VCH, Weinheim 1999,
111-35.
4. Varma R i wsp. Platinum drug effects on the expression
of genes in the polyamine pathway: time-course and
concentration-effect analysis based on Affymetrix gene
expression profiling of A2780 ovarian carcinoma cells.
Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 711–23.
5. Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN.
The cell cycle: a review of regulation, deregulation
and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif 2003; 36:
131-49.
6. Meeran SM, Katiyar SK. Cell cycle control as a basis for
cancer chemoprevention through dietary agents. Front
Biosci 2008; 13: 2191-202.
7. Previati M i wsp. RNA expression induced by cisplatin
in an organ of Corti-derived immortalized cell line. Hear
Res 2004; 196: 8-18.
8. Kerley-Hamilton JS i wsp. A p53-dominant transcriptional response to cisplatin in testicular germ cell tumorderived human embryonal carcinoma. Oncogene 2005;
24: 6090–100.
9. Previati M i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in human
promyelocytic leukemia cells. Int J Mol Med 2006; 18:
511-16.
10. Malinowska K i wsp. Aktywność biologiczna – in vitro
nowych związków koordynacyjnych platyny(II) i palladu(II). Pol Merk Lek 2009; 151: 52-6.
11. Ota T i wsp. Complete sequencing and characterization
of 21,243 full-length human cDNAs. Nat Genet 2004;
36: 40–5.
12. Perego P i wsp. Association between cisplatin resistance
and mutation of p53 gene and reduced bax expression in
ovarian carcinoma cell systems. Cancer Res 1996; 56:
556-62.
13. Monte M i wsp. The cell cycle-regulated protein human
GTSE-1 controls DNA damage-induced apoptosis by affecting p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 30356-64.
14. Méndez J i wsp. Human origin recognition complex large subunit is degraded by ubiquitin-mediated proteolysis
after initiation of DNA replication. Mol Cell 2002; 9:
481-91.
15. Privette LM i wsp. Loss of CHFR in human mammary epithelial cells causes genomic instability by disrupting the mitotic spindle assembly checkpoint. Neoplasia
2008; 10: 643-52.
16. Cerosaletti KM, Concannon P. Nibrin forkhead-associated domain and breast cancer C-terminal domain
are both required for nuclear focus formation and phosphorylation. J Biol Chem 2003; 278: 21944-51.
17. Mack PC i wsp. Cell cycle-dependent potentiation of
cisplatin by UCN-01 in non-small cell lung carcinoma.
Cancer Chemother Pharmacol 2003; 51: 337-48.
18. Senderowicz AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene 2003; 22: 6609-20.
19. Clarke PA i wsp. Characterisation of molecular events
following cisplatin treatment of two curable ovarian cancer models: contrasting role for p53 induction and apoptosis in vivo. Br J Cancer 2004; 91: 1614-23.
20. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 7265–79.
21. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events
associated with cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatin. J Natl Cancer Inst 1990; 82:
749-55.
22. Ryan KM, Phillips AC, Vousden KH. Regulation and
function of the p53 tumor suppressor protein. Curr Opin
Cell Biol 2001; 13: 332–37.
&ARM0RZEGL.AUK
23. Qin LF, Ng IOL. Induction of apoptosis by cisplatin
and its effect on cell cycle-related proteins and cell cycle changes in hepatoma cells. Cancer Lett 2002; 175:
27-38.
24. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network. Nature 2000; 408: 307-10.
25. Konac E i wsp. Detection of p53 deletions using FISH
values in the HL-60, Daudi, Raji and K-562 cell-lines.
Exp Oncol 2003; 25: 33–5.
26. Agami R, Bernards R. Distinct initiation and maintenance mechanisms cooperate to induce G1 cell cycle arrest
in response to DNA damage. Cell 2000; 102: 55-66.
Adres do korespondencji:
dr hab. n. farm. Adam Wilczok
Katedra i Zakład Biofarmacji SUM
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
tel. 32 364 10 63
e-mail: [email protected]
27. Taylor WR, Stark GR. Regulation of the G2/M transition by p53. Oncogene 2001; 20: 1803-15.
28. Ando T i wsp. Involvement of the interaction between
p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage. J Biol Chem
2001; 276: 42971-77.
29. Ferry KV, Hamilton TC, Johnson SW. Increased nucleotide excision repair in cisplatin-resistant ovarian cancer
cells: role of ERCC1-XPF. Biochem Pharmacol 2000;
60: 1305–13.