Ćwiczenie 8 -Difosfataza

Ćwiczenie 8
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ
DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)
Część doświadczalna obejmuje:
- sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy
- oznaczanie aktywności alkalicznej difosfatazy w bielmie niedojrzałych nasion kukurydzy w warunkach zróŜnicowanego stęŜenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym
WPROWADZENIE
Uniwersalnym środkiem wymiany energii swobodnej w układach biologicznych jest ATP. Adenozynotrifosforan jest cząsteczką bogatą w energię, poniewaŜ jego jednostka trifosforanowa zawiera
dwa bezwodnikowe wiązania fosforanowe (Ryc. 1). Stosunkowo duŜa ilość energii swobodnej
uwalniana jest podczas jego hydrolizy do ADP i fosforanu (-30,5 kJ x mol-1; -7,3 kcal x mol-1) (ryc.
1), a jeszcze większa zmiana energii swobodnej towarzyszy hydrolizie ATP do AMP i difosforanu
(pirofosforanu; PPi) (-45,6 kJ x mol-1; 10,9 kcal x mol-1) (Ryc. 2). W komórce, energia swobodna
tych reakcji jest jeszcze wyŜsza, gdyŜ przebiega w nieco odmiennych warunkach siły jonowej i stęŜenia jonów Mg2+ w środowisku. Inne nukleotydy trifosforanowe (GTP, CTP, UTP) równieŜ mają
dwa bezwodnikowe wiązania fosforanowe i wykazują właściwości podobne do ATP, lecz spełniają
inne funkcje w przemianie materii.
Ryc. 1. Wzajemne przekształcanie ATP i ADP (Alberts i wsp. 1999)
1
Energetycznie korzystna reakcja hydrolizy ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (HPO4-2) jest
sprzęŜona z wieloma reakcjami energetycznie niekorzystnymi. Ponadto, wiele reakcji biosyntezy
zaleŜy od alternatywnej drogi hydrolizy ATP, w której uwalniany jest difosforan i AMP (Ryc. 2).
Powstający w tym wypadku difosforan (pirofosforan; PPi) jest natychmiast hydrolizowany przez
difosfatazę do dwóch cząsteczek ortofosforanu. Cały proces wyzwala całkowitą energię swobodną
o wartości około –108 kJ/mol, dzięki czemu reakcje biosyntezy stają się nieodwracalne.
Ryc. 2. Alternatywna droga hydrolizy ATP. A – W dwóch następujących po sobie reakcjach hydrolizy atomy tlenu z cząsteczek wody są wiązane przez produkty, natomiast atomy wodoru oddysocjowują tworząc wolne jony wodorowe H+. B – Całkowita reakcja przedstawiona w postaci skróconej (Alberts i wsp. 1999)
PoniŜej przedstawione są przykładowe reakcje biosyntezy, których przebieg w prawą stronę zaleŜy
od obecności w środowisku difosfatazy (pirofosfatazy).
Synteza DNA i RNA
(DNA) n reszt + trifosforan deoksyrybonukleozydu ↔ (DNA) n+1 reszt + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
2
(RNA)n reszt + trifosforan rybonukleozydu ↔ (RNA)n+1 reszt + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
Aktywacja aminokwasów:
aminokwas + ATP ↔ aminoacylo-AMP + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
aminoacylo-AMP + tRNA → aminoacylo-tRNA + AMP
Aktywacja kwasów tłuszczowych:
kwas tłuszczowy + ATP ↔ acylo-AMP + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
acyloadenylan + HS-CoA → acylo-CoA + AMP
Biosynteza di- i oligosacharydów:
glukozo-6-fosforan → glukozo-1-fosforan
glukozo-1-fosforan + UTP→ UDP-glukoza + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
UDP-glukoza + fruktozo-6-fosforan ↔ fosfosacharoza + UDP
fosfosacharoza + H2O → sacharoza + Pi
Biosynteza glikogenu i skrobi:
glukozo-6-fosforan → glukozo-1-fosforan
glukozo-1-fosforan + UTP→ UDP-glukoza + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
UDP-glukoza + gliokogenn → glikogenn+1 + UDP
UDP-glukoza + amylozan → amylozan+1 + UDP
Difosfataza (pirofosfataza) cechuje się wysoką specyficznością względem difosforanu jako substratu (nie hydrolizuje wiązań bezwodnikowych w nukleotydach ani wiązań fosfoestrowych) i wymaga jonów magnezu jako aktywatora. Aktywność difosfatazy moŜna oznaczać na podstawie
ilości enzymatycznie uwalnianego ortofosforanu, który moŜna oznaczać m. in. metodą FiskeSubbarowa.
P2O7 4- + H2O
2PO4 3- + 2H+
3
WYKONANIE
Odczynniki:
- 50mM bufor Tris – HCl, pH 8,6,
- 2mM roztwór difosforanu (V) sodu w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6,
- roztwory MgCl2 w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6,
- 5mM roztwór CaCl2 w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6,
- 12,5M roztwór EDTA w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6,,
- 5mM roztwór NaF w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6,,
- 10% roztwór TCA,
- 10M H2SO4,
- roztwór molibdenianu (VI) amonu ,
- eikonogen,
Materiał:
ZamroŜone bielmo (endosperm) z niedojrzałych nasion kukurydzy
Oznaczanie aktywności difosfatazy (pirofosfatazy) w warunkach zróŜnicowanego
stęŜenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym
Przygotowanie ekstraktu białkowego:
Z zamroŜonego bielma zdrapać metalową szpatułą 2 g zamroŜonej tkanki i po rozmroŜeniu rozetrzeć w małym moździerzu. Dobrze roztarty materiał przelać do dwóch probówek wirówkowych
Eppendorfa i wirować 5 min. przy 15 000 obr/min. Ściągnięty pipetą z obu probówek nadsącz poddać rozdziałowi na krótkiej (15 cm x 1,5 cm) kolumnie Sephadex G-15 (sączenie Ŝelowe) w celu
oddzielenia frakcji białkowej (zawierającej m. in. difosfatazę!) od endogennego fosforanu, jonów
magnezu, wapnia i innych związków niskocząsteczkowych, które mogą wpływać na aktywność
enzymu. W tym celu, przy zamkniętym wypływie kolumny, nanieść ostroŜnie na powierzchnię Ŝelu
całą objętość nadsączu po wirowaniu, a następnie otworzyć wylot kolumny. Po wniknięciu całej
próbki do Ŝelu (UWAGA! nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny!) pipetą Pasteura nanieść
ostroŜnie na powierzchnię Ŝelu ok. 4-5 ml buforu do elucji (50mM Tris-HCl, pH 8,6), a następnie
podłączyć butlę z roztworem elucyjnym i prowadzić rozdział, śledząc przesuwanie się wzdłuŜ kolumny Ŝółto zabarwionej frakcji białek. Kiedy białka będą na wysokości ok. 2-3 cm od wylotu
4
kolumny rozpocząć zbieranie frakcji o objętości około 1 ml. Frakcję o najintensywniejszym Ŝółtym
zabarwieniu zachować do oznaczeń, natomiast pozostałe zebrane frakcje wylać. Przed rozpoczęciem oznaczeń zebraną (odsoloną!) próbę rozcieńczyć 20-krotnie buforem uŜywanym do elucji.
Przygotowanie środowiska reakcyjnego:
Do prób od 1 do 9 napipetować podane w Tabeli I objętości roztworu substratu (2mM difosforan czterosodowy w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 8,6) oraz kolejnych roztworów zawierających
jony Mg2+ o rosnącym stęŜeniu, Mg2+ + wersenian czterosodowy (EDTA), Ca2+ oraz fluorku
sodu. Wszystkie mieszaniny reakcyjne przygotować w dwóch powtórzeniach! Wszystkie probówki (18 probówek; w kaŜdej po 0,9 ml roztworu) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 300C
co najmniej 5 minut przed rozpoczęciem dodawania enzymu.
Tabela I. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych do oznaczania aktywności difosfatazy w warunkach zróŜnicowanego stęŜenia jonów dwuwartościowych
Skład próby
1
2mM PPi w 50mM Tris- 0,5 ml
2
3
4
5
6
7
8
9
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,4 ml
0,2 ml
0,2 ml
-HCl, pH 8,6
50mM Tris-HCl, pH 8,6 0,4 ml
2,5 mM MgCl2
5 mM MgCl2
0,4 ml
0,4 ml
0,4 ml
10 mM MgCl2
12,5 mM MgCl2
0,4 ml
0,4 ml
5 mM CaCl2
0,2 ml
12,5 mM EDTA
0,2 ml
5 mM NaF
5
Wykonanie oznaczenia
Do prób umieszczonych w łaźni i podgrzanych do 300 C dodawać w odstępach co 30 sekund po
0,1 ml 20-krotnie rozcieńczonego roztworu odsolonych na kolumnie białek w kolejności: 1, 1’; 2,
2’; 3, 3’… itd., z pominięciem prób 9 i 9’ (próby zerowe!). Nie wyłączając stopera, inkubować
wszystkie próby 30 min w łaźni wodnej (temp. 30oC), po czym dokładnie po 30 min rozpocząć
hamowanie reakcji dodając co 30 s po 0,5 ml 10% roztworu TCA (denaturacja białek!) w kolejności: 1, 1’; 2, 2’; 3,3’ itd. , tak jak dodawano enzym. Postępując w ten sposób wszystkie próby będą
inkubowane z enzymem dokładnie 30 minut. Uwaga! Na końcu, do 9 i 9’ (próby kontrolne!) dodać
najpierw po 0,5 ml 10% roztworu TCA, a następnie po 0,1 ml enzymu! (dodanie najpierw TCA
spowoduje, Ŝe wprowadzony do próby enzym będzie natychmiast denaturowany przez TCA).
Wszystkie próby wyjąć z łaźni wodnej, a następnie do kaŜdej dodać kolejno odczynniki potrzebne
do oznaczaniu ortofosforanu metodą Fiske-Subbarowa: 0,4 ml mieszaniny zawierającej H2SO4,
molibdenian amonu i H2O zmieszanych w stosunku 1:2:1, a po dokładnym wytrząśnięciu kaŜdej
próby, po 0,1 ml eikonogenu (redukcja kompleksu fosfomolibdenowego). Wszystkie próby ponownie umieścić w łaźni wodnej na 10 min w celu przyspieszenia w 300 C reakcji tworzenia barwnego
kompleksu błękitu molibdenowego. Po 10 min., próby wyjąć z łaźni i zmierzyć absorbancję przy
660 nm względem próby zerowej (połączone próby 9 i 9’).
Korzystając z przygotowanej uprzednio krzywej kalibracyjnej (ćwiczenie 6) obliczyć ilość
uwolnionego enzymatycznie ortofosforanu, (ilość wyrazić w µmolach) w czasie 30 min inkubacji
enzymu w środowisku reakcyjnym o odpowiednim składzie. Aktywność difosfatazy, wyraŜona
jako ilość µmoli ortofosforanu powstałego w ciągu 1 min inkubacji enzymu z substratem, przedstawić w postaci histogramów. Pod kaŜdym prostokątem podać końcowe stęŜenie substratu (PPi) oraz
stęŜenie badanego jonu w środowisku reakcyjnym (0,9 ml mieszaniny reakcyjnej + 0,1 ml enzymu).
Zagadnienia do przygotowania:
- reakcje produkujące nieorganiczny difosforan (pirofosforan) w komórce
- rola enzymu hydrolizującego difosforan
- zasada oznaczania aktywności enzymatycznej alkalicznej difosfatazy
- aktywatory i inhibitory reakcji enzymatycznej (hamowanie kompetycyjne i niekompetycyjne)
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
6