Pichia pastoris jako system ekspresyjny do produkcji białek

Pichia pastoris jako system ekspresyjny do produkcji białek rekombinowanych
STRESZCZENIE
P
ichia pastoris cieszy się coraz większą popularnością jako system ekspresyjny. Niski
koszt hodowli oraz wysoka wydajność czynią ten gatunek drożdży atrakcyjną alternatywą dla systemów wykorzystujących komórki wyższych eukariontów. Wybierając P. pastoris
omija się też wiele problemów napotykanych w przypadku zastosowania systemów bakteryjnych — nieprawidłowe zwijanie białek oraz brak modyfikacji potranslacyjnych. Dostępność bardzo silnych promotorów, zwłaszcza promotora AOX1, a także możliwość sekrecji
rekombinowanego białka do medium hodowlanego również przyczyniają się do ogromnej
popularności P. pastoris. Wiele zalet tego systemu umożliwia jego zastosowanie nie tylko
do produkcji białek w celach badawczych, ale także na większą skalę do zastosowań przemysłowych.
WPROWADZENIE
W latach 70. XX wieku większość komercyjnie dostępnych białek pozyskiwana była w tradycyjny sposób poprzez izolację z tkanek roślinnych lub zwierzęcych. Metodą tą nie można było uzyskać dużych ilości białek, stąd też ich
dostępność była niska, a ceny wysokie. Dopiero rozwój inżynierii genetycznej
umożliwił produkcję białek rekombinowanych w znaczących ilościach. Wykorzystuje się w tym celu różnego rodzaju systemy ekspresyjne, do których należą
bakterie, drożdże, grzyby pleśniowe, komórki owadzie oraz komórki ssaków i
roślin [1-3]. Wady i zalety wybranych systemów ekspresyjnych przedstawiono
w tabeli 1.
Tabela 1. Zalety i wady wybranych systemów ekspresyjnych używanych do
produkcji białek rekombinowanych na podstawie [1-3].
Zalety
Bakterie
Drożdże
Komórki
owadów
Komórki
ssaków
niski koszt
łatwość hodowli oraz
manipulacji potranslacyjnych
duża wydajność
hodowla nie jest praco- i
czasochłonna
niski koszt
mogą być hodowane do
dużych gęstości
łatwość manipulacji genetycznych
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjne
duża wydajność
możliwa sekrecja białka do
medium hodowlanego
prawidłowe zwijanie białek
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjnych
duża wydajność
możliwa sekrecja białka do
medium hodowlanego
prawidłowe zwijanie białek
jednoczesna ekspresja wielu genów
przeprowadzają modyfikacje
potranslacyjne
sposób glikozylacji najbardziej
zbliżony do ludzkiego
prawidłowe zwijanie białek
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
Wady
Anna Ciarkowska*
Anna Jakubowska
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,
Toruń
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,
ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń; tel.: (56) 61 14
542, e-mail: [email protected]
*
Artykuł otrzymano 7 lutego 2013 r.
Artykuł zaakceptowano 2 kwietnia 2013 r.
Słowa kluczowe: produkcja białek rekombinowanych, system ekspresyjny, drożdże metylotroficzne, Pichia pastoris
Wykaz skrótów: AOX — oksydaza alkoholowa; DAS — syntaza dihydroksyacetonu; GAP
— dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego; FLD1 — dehydrogenaza formaldehydu
zależna od glutationu; PEX8 — białko macierzy peroksysomalnej; PHO1 — kwaśna fosfataza; SUC2 — inwertaza; PHA-E — fitohemaglutynina
trudności w pozyskiwaniu
białek zawierających
mostki dwusiarczkowe
brak modyfikacji potranslacyjnych,
w tym glikozylacji
białka wytwarzane w nieaktywnej
formie w postaci ciał inkluzyjnych
możliwe zanieczyszczenia
endotoksynami
białka glikozylowane w inny
sposób niż w komórkach ssaczych
możliwość odkładania się białka
rekombinowanego w formie
nieaktywnych agregatów
stosunkowo wysoki koszt
możliwe zanieczyszczenia
wirusowym i onkogennym DNA
wysoki koszt
długotrwały proces produkcji
niska wydajność
315
Wyjątkowość drożdży jako systemu ekspresyjnego
polega na tym, że łączą one zalety systemów prokariotycznych (niskie koszty, prostota, duża wydajność) i
eukariotycznych (przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych, prawidłowe zwijanie białek) [4]. Największą
popularnością cieszą się obecnie dwa gatunki drożdży:
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) oraz Pichia pastoris
(P. pastoris) [3,5].
DROŻDŻE METYLOTROFICZNE
W drożdżach metylotroficznych funkcjonuje specyficzny szlak metabolizmu metanolu, pozwalający im wykorzystywać ten związek jako źródło węgla. W pierwszym
etapie przemian metabolicznych metanolu związek ten
jest utleniany w obecności O2 do formaldehydu z wydzieleniem nadtlenku wodoru przez oksydazę alkoholową
(AOX). Powstający w tej reakcji H2O2 jest następnie usuwany przez katalazę. Formaldehyd może ulec utlenieniu
(szlak dysymilacji metanolu) lub kondensacji z ksylulozo-5-fosforanem (szlak asymilacji) w reakcji katalizowanej
przez syntazę dihydroksyacetonu (DAS). AOX, katalaza
oraz DAS zlokalizowane są w peroksysomach, gdzie zachodzi pierwszy etap metabolizmu metanolu. W drugim
etapie produkty reakcji kondensacji katalizowanej przez
DAS: dihydroksyaceton oraz aldehyd 3-fosfoglicerynowy
ulegają dalszym przemianom, które zachodzą w cytoplazmie [4].
P. pastoris posiada dwie endogenne kopie genu AOX:
AOX1 oraz AOX2. AOX1 odpowiada za powstawanie około
90% oksydazy alkoholowej w komórce P. pastoris, natomiast
AOX2 posiada słabszy promotor i odpowiada za powstawanie jedynie 10% enzymu. Ekspresja obu genów ulega indukcji w obecności metanolu [7].
Wszystkie zidentyfikowane do tej pory szczepy drożdży
metylotroficznych należą do czterech rodzajów: Hansenula,
Pichia, Candida oraz Torulopsis [6].
Ze względu na metabolizm metanolu można wyróżnić
trzy fenotypy P. pastoris:
Mut+ (ang. methanol utilization plus) — drożdże o tym
fenotypie posiadają w pełni funkcjonalne obie kopie genu
AOX i dzięki temu rosną na metanolu w takim samym tempie jak typ dziki P. pastoris. Najczęściej stosowanym szczepem o takim fenotypie jest GS115 [6,8].
Muts (ang. slow methanol utilization) — szczepy o takim fenotypie posiadają niefunkcjonalny gen AOX1. Z
tego powodu metabolizm metanolu opiera się jedynie na
AOX2, której gen posiada słabszy promotor i zapewnia
niższy poziom ekspresji. Dlatego też komórki P. pastoris
o fenotypie Muts rosną na metanolu wolniej niż drożdże
o fenotypie Mut+. Często konieczne jest wręcz zastosowanie dodatkowych źródeł węgla, takich jak sorbitol, mannitol, trehaloza lub alanina — warunkiem jest jednak aby
żadne z dodatkowych źródeł węgla nie powodowało represji promotora AOX. Przykładem szczepu P. pastoris o
fenotypie Muts jest KM71 [6,9].
316
Mut- (ang. methanol utilization minus) — fenotyp ten charakteryzuje się brakiem funkcjonalnych kopii obu genów
AOX i związaną z tym niemożnością wzrostu na metanolu.
Przykładowym szczepem P. pastoris o fenotypie Mut- jest
MC100-3 [6,10].
P. pastoris, jako przedstawiciela drożdży metylotroficznych, charakteryzuje wiele zalet zapewniających przewagę
nad S. cerevisiae, gdy w grę wchodzi wybór systemu ekspresyjnego do produkcji białek rekombinowanych. Wybierając P. pastoris przede wszystkim omija się problem
hiperglikozylacji białka rekombinowanego, który pojawia
się w tym gatunku zdecydowanie rzadziej w porównaniu
z S. cerevisiae. Istnieją jednak pewne wyjątki, np. nadprodukowana w P. pastoris endoglukanaza II z Trichoderma reesei, czy HIV gp 120, które ulegają hiperglikozylacji [11,12].
Glikoproteiny syntetyzowane w tym systemie posiadają
mannozowy łańcuch oligosacharydu złożony z maksymalnie 20 jednostek, podczas gdy w przypadku S. cerevisiae
długość łańcucha cukrowego wynosi aż 50–150 jednostek
mannozowych. Ponadto, P. pastoris nie posiada enzymu
α-1,3-mannozylotransferazy, który u S. cerevisiae przyłącza na końcu oligosacharydu mannozę za pośrednictwem
wiązania α-1,3-glikozydowego, co jest niepożądane w przypadku białek terapeutycznych, gdyż wywołuje intensywną
odpowiedź immunologiczną u pacjentów, którym podaje
się taką glikoproteinę. P. pastoris zapewnia również dużo
większą niż S. cerevisiae wydajność produkcji białka rekombinowanego, jak też umożliwia jego sekrecję do medium hodowlanego. Zdolność P. pastoris do wzrostu na pożywkach
zawierających wysokie, zabójcze dla większości innych mikroorganizmów, stężenia metanolu zapobiega zakażeniu
hodowli [1]. W przeciwieństwie do S. cerevisiae, P. pastoris
preferuje procesy tlenowe niż fermentacyjne, dzięki czemu
w hodowli nie powstają duże ilości etanolu i kwasu octowego, które ze względu na toksyczny wpływ na komórki
powodowałyby zahamowanie wzrostu hodowli [13].
PRODUKCJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH
W P. PASTORIS
Działania prowadzące do uzyskania białek rekombinowanych w P. pastoris, podobnie jak i w innych systemach
ekspresyjnych, możemy podzielić na kilka podstawowych
etapów. Pierwszym krokiem jest wklonowanie transgenu
do wektora ekspresyjnego. Następnie przeprowadzamy
transformację komórek gospodarza oraz selekcję transformantów, do których udało się wprowadzić wektor ekspresyjny. Transformowane komórki hoduje się w określonych
warunkach, po czym izoluje się z nich i oczyszcza białko
rekombinowane [14].
P. pastoris transformuje się stosując fuzję sferoplastów,
elektroporację bądź koprecypitację z chlorkiem litu,
chlorkiem wapnia lub glikolem polietylenowym [15]. W
przeciwieństwie do S. cerevisiae, które można transformować za pomocą wektorów integracyjnych i episomalnych,
do transformacji P. pastoris stosuje się prawie wyłącznie
wektory integracyjne. Wynika to z faktu, że w komórkach P. pastoris nie udało się zidentyfikować naturalnie
występujących plazmidów episomalnych, takich jak 2μ w
www.postepybiochemii.pl
S. cerevisiae [16]. Ponadto, wszystkie stosowane wektory
ekspresyjne zaliczają się do wektorów wahadłowych —
mogą namnażać się nie tylko w komórkach P. pastoris, ale
również w E. coli [17]. Typowe elementy wchodzące w
skład takiego wektora to: promotor, polilinker umożliwiający wklonowanie transgenu, sygnał terminacji transkrypcji, bakteryjne miejsce inicjacji replikacji, markery
selekcyjne dla P. pastoris i E. coli oraz opcjonalnie sygnał
sekrecyjny [15,18].
P. pastoris jest zdolna do wzrostu w szerokim zakresie
pH (3,0–7,0), jednak hodowle zwykle prowadzi się w pH o
wartości 5,0–6,0 [22]. Przy zbyt niskim pH medium hodowlanego P. pastoris musi zużywać więcej energii na utrzymanie stałego fizjologicznego poziomu pH wewnątrz komórki.
Prowadzi to do spowolnienia wzrostu hodowli oraz spadku
wydajności sekrecji w wyniku wzmocnienia bariery stanowionej przez ścianę komórkową [20].
Genetycznie stabilne transformanty P. pastoris uzyskuje
się w wyniku integracji kasety ekspresyjnej do chromosomu w specyficznym locus [19]. Może do niej dojść w wyniku
rekombinacji homologicznej poprzez wstawienie lub zastąpienie genu. W tym drugim przypadku często doprowadza
się do zastąpienia genu AOX1 transgenem wykorzystując w
tym celu plazmidy zawierające promotor AOX1 oraz fragment sekwencji 3’-końcowej genu AOX1, uzyskane w ten
sposób transformanty charakteryzują się fenotypem MutS.
Transformanty powstałe w wyniku zastąpienia genu są
zwykle bardziej stabilne genetycznie, ale również jednokopijne [10]. Liczba kopii wprowadzonego genu wpływa na
wydajność produkcji rekombinowanego białka, zwykle im
większa ilość kopii tym więcej białka powstaje [6]. Ze względu na brak stabilnych wektorów episomalnych dla P. pastoris rzadko przeprowadza się transformację tych drożdży za
ich pomocą. Plazmidy episomalne replikują niezależnie od
chromosomu i mogą zostać utracone przez komórki w wyniku kolejnych podziałów. Z tego powodu transformanty
niosące plazmidy episomalne muszą być poddawane stałej selekcji, co umożliwia wyeliminowanie komórek, które
utraciły transgen razem z wektorem, a zachowanie jedynie
transformowanej populacji. Ponadto plazmidy episomalne
występują zwykle w niewielkiej ilości kopii, a jak już wcześniej wspomniano, niewielka ilość wprowadzonych kopii
transgenu może prowadzić do niskiej wydajności produkcji
białka [10,15].
Istotną zaletą P. pastoris jako systemu ekspresyjnego jest
łatwość modyfikacji skali hodowli. Chociaż P. pastoris jest
w stanie w sposób wydajny wytwarzać białka w hodowli
stacjonarnej, w przypadku hodowli w fermentorze uzyskuje się zwykle dużo lepsze rezultaty. Wynika to przede
wszystkim z tego, że fermentor umożliwia bardzo dokładną
kontrolę pH pożywki, natlenienia oraz tempa dostarczania
substratu, dzięki czemu P. pastoris może rosnąć do bardzo
dużych gęstości. System ten jest więc idealny do produkcji
białek na skalę przemysłową [17].
Optymalne warunki hodowli P. pastoris w dużym stopniu zależą od wybranego szczepu oraz od właściwości wytwarzanego białka. Różnego rodzaju stres środowiskowy
lub metaboliczny może wpływać na produkcję białek rekombinowanych [20,21]. Czynniki środowiskowe takie jak
temperatura, niskie pH, wysoka osmotyczność oraz stres
oksydacyjny mogą powodować spadek wydajności wytwarzania białka rekombinowanego poprzez negatywny
wpływ na proces zwijania się białek oraz ich sekrecję [20].
Optymalna temperatura dla hodowli P. pastoris w celu
produkcji białka rekombinowanego wynosi 30°C. Przy
temperaturze powyżej 32°C obserwuje się zahamowanie
produkcji białka oraz gwałtowny spadek tempa wzrostu
hodowli [22]. Natomiast obniżenie temperatury hodowli do
20–25°C wpływa korzystnie na proces zwijania się białka
i poprawia wydajność jego produkcji [20]. W wielu przypadkach niższa temperatura hodowli prowadzi również do
zmniejszenia stresu oksydacyjnego wywołanego wzrostem
w obecności wysokich stężeń metanolu. Stres oksydacyjny
można również redukować poprzez stosowanie antyoksydantów, np. kwasu askorbinowego lub równoległą ekspresję enzymów antyoksydacyjnych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa [23,24].
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
PROMOTORY
Wysoki poziom ekspresji obcego genu powoduje duże
obciążenie metaboliczne komórek. Zdarza się również, że
nagromadzenie produkowanego białka może wywierać
toksyczny wpływ na komórki gospodarza. Z tych powodów zwykle stosuje się promotory indukowane, dzięki którym możemy rozpocząć syntezę białka rekombinowanego
dopiero wówczas, gdy hodowla osiągnie odpowiednią gęstość i w ten sposób zwiększyć wydajność produkcji [14].
Przykładem promotora indukowanego metanolem jest promotor genu AOX1 z P. pastoris. Oksydaza alkoholowa utlenia metanol do formaldehydu wykorzystując do tego tlen
cząsteczkowy. Enzym ten wykazuje jednak niskie powinowactwo względem tlenu. Komórki P. pastoris kompensują to
wytwarzaniem bardzo dużych ilości AOX1 (do 30% całkowitego białka komórki) w wyniku indukcji metanolem [25].
Ze względu na dużą siłę oraz ścisłą regulację promotora
AOX1 jest on bardzo często wykorzystywany do produkcji
białek rekombinowanych w P. pastoris [6].
Glukoza, etanol oraz glicerol są silnymi represorami promotora AOX1 [4]. W pierwszym etapie hodowli P. pastoris
stosuje się pożywki, które jako źródło węgla zawierają jeden z represorów promotora AOX1: glukozę lub glicerol.
Umożliwia to nagromadzenie biomasy przed rozpoczęciem
indukcji komórek do produkcji białka rekombinowanego.
Częściej stosuje się glicerol, ponieważ w przeciwieństwie
do glukozy nie jest on substratem do procesów fermentacyjnych. Aby doprowadzić do indukcji promotora AOX1
konieczne jest zastąpienie pierwotnego źródła węgla metanolem. Zmiana pożywki na zawierającą metanol jako jedyne źródło węgla powoduje ponad 1000-krotną indukcję
promotora AOX1 [13]. W przypadku białek wewnątrzkomórkowych ich najwyższy poziom obserwuje się w ciągu
24 godzin od indukcji metanolem, natomiast w przypadku
białek ulegających sekrecji, w ciągu 24–100 godzin od indukcji [17].
Do produkcji białek z zastosowaniem promotora AOX1
można wykorzystywać szczepy P. pastoris o wszystkich
317
trzech typach metabolizmu metanolu. Często jednak korzystniejsze okazuje się wybranie szczepu Mut- lub MutS, co
zapewnia mniejsze zużycie metanolu. W tych przypadkach
w czasie indukcji stosuje się pożywki zawierające dodatkowe źródło węgla nie będące represorem promotora AOX1:
sorbitol, mannitol, trehalozę lub alaninę [19,26].
Z wykorzystaniem promotora AOX1 wiąże się kilka
istotnych problemów wynikających z konieczności stosowania dużych ilości metanolu. Zbyt wysokie stężenie metanolu może toksycznie wpływać na komórki P. pastoris, dlatego też konieczne jest stałe monitorowanie jego poziomu w
hodowli. Innym problemem utrudniającym wykorzystanie
tego promotora do produkcji białek rekombinowanych na
skalę przemysłową jest to, że metanol jest substancją łatwopalną i przechowywanie jego dużych ilości prowadzi do
zagrożenia pożarowego. Ponadto, wymagane jest wykorzystanie dwóch różnych źródeł węgla, których wymiana musi
nastąpić w ściśle określonym momencie, a w przypadku
hodowli na skalę laboratoryjną, bez wykorzystania fermentora, bardzo trudne jest dokładne kontrolowanie warunków
indukcji [6,17].
Ze względu na wyżej wymienione trudności związane
ze stosowaniem promotora AOX1 poszukiwano alternatywnych promotorów, które umożliwiłyby równie wydajną produkcję białek rekombinowanych w P. pastoris.
Wykorzystanie promotora genu dehydrogenazy aldehydu
3-fosfoglicerynowego (GAP) z P. pastoris zapewnia wysoki
konstytutywny poziom ekspresji transgenu. W niektórych
przypadkach, np. dla β-laktamazy, promotor GAP umożliwia uzyskanie większej ilości białka rekombinowanego niż
promotor AOX1. Ponieważ promotor GAP jest promotorem
konstytutywnym, nie nadaje się do produkcji białek wywierających toksyczny wpływ na komórkę [27].
Promotor genu dehydrogenazy formaldehydu zależnej
od glutationu (FLD1) z P. pastoris zapewnia podobny poziom ekspresji, co promotor AOX1. Indukcję promotora
FLD1 można przeprowadzać na dwa sposoby: metanolem
lub metyloaminą [28,29].
Bardzo wysoki poziom ekspresji zapewniany przez promotory AOX1, FLD1 i GAP może wywierać toksyczny efekt
na komórki P. pastoris, a także powodować nadmierne obciążenie metaboliczne komórki, przez co duże ilości białka
rekombinowanego nie posiadają odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych i są nieprawidłowo sfałdowane [14]. Z
tego powodu konieczne było znalezienie promotorów powodujących niższy poziom ekspresji.
Promotor genu białka macierzy peroksysomalnej PEX8
zapewnia konstytutywną ekspresję transgenu na bardzo niskim poziomie przy zastosowaniu glukozy jako źródła węgla oraz umiarkowaną indukcję w wyniku dodania metanolu. Z kolei promotor genu YPT1 kodującego zaangażowaną
w wydzielanie GTPazę umożliwia konstytutywną ekspresję
transgenu na niskim poziomie przy hodowli na pożywkach
zawierających jako źródło węgla glukozę, metanol lub mannitol [30].
318
Poznanie sekwencji genomowej P.pastoris umożliwiło
identyfikację wszystkich genów zaangażowanych w metabolizm metanolu oraz ich promotorów, które w przyszłości
mogą znaleźć zastosowanie przy produkcji białek rekombinowanych [31].
MARKERY SELEKCYJNE
Geny markerowe można podzielić na dwie grupy: markery auksotroficzne oraz nadające oporność na antybiotyk
[32]. Większość szczepów ekspresyjnych P. pastoris jest defektywna w zakresie jednego lub kilku genów odpowiedzialnych za biosyntezę określonych związków. Szczepy
te nie są w stanie rosnąć na pożywkach bez suplementacji danym związkiem, chyba że zostaną transformowane
wektorem niosącym funkcjonalny gen szlaku biosyntezy.
Do najpowszechniej stosowanych genów markerowych
z tej grupy należą geny szlaków syntezy aminokwasów i
nukleotydów: HIS4, ARG4, ADE1 oraz URA3 [13,16]. Kilka
lat temu udało się skonstruować auksotroficzne szczepy P.
pastoris, umożliwiające selekcję transformantów na podstawie obecności genów ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2,
HIS5 lub HIS6 [33]. Poza markerami auksotroficznymi
stosuje się również geny oporności na antybiotyki: gen Sh
ble ze Streptoalloteichus hindustanus nadający oporność na
zeocynę oraz gen oporności na G418 [34]. W celu selekcji
transformantów wielokopijnych często stosuje się kombinację dwóch genów markerowych: wstępnej selekcji dokonuje się na podstawie obecności genu HIS4, a następnie
wyodrębnia się transformaty oporne na wysokie stężenia
G418 [10].
SEKRECJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH
Dołączenie sygnału sekrecji do białka rekombinowanego
prowadzi do jego wydzielania z komórki, co w znacznym
stopniu ułatwia jego oczyszczanie. Bardzo ważną zaletą
P. pastoris jest to, że niewielka ilość jej natywnych białek
ulega sekrecji, są to głównie białka pełniące funkcje pozakomórkowe lub wchodzące w skład ściany komórkowej
[6,35]. Dzięki temu białko rekombinowane może stanowić
nawet ponad 80% całkowitego białka w medium hodowlanym [15].
Najczęściej stosowanym sygnałem sekrecyjnym jest sekwencja liderowa czynnika koniugacyjnego α-MF z S. cerevisiae [17]. Wykorzystuje się również sekwencje sygnalne
kwaśnej fosfatazy z P. pastoris (PHO1), inwertazy (SUC2), fitohemaglutyniny (PHA-E) z Phaseolus vulgaris, 128kDa białka pGKL oraz białka PIR1 z P. pastoris [15,36-38]. Możliwe
jest również zastosowanie natywnego sygnału sekrecji białka rekombinowanego, jeżeli posiada ono taką sekwencję.
Wydajność sekrecji zależy nie tylko od zastosowanego
peptydu sygnalnego, ale również od struktury produkowanego białka [13]. Białka, które naturalnie nie posiadają
sygnału sekrecyjnego lepiej jest wytwarzać wewnątrzkomórkowo, aby uniknąć nieprawidłowej glikozylacji i braku
pewnych modyfikacji potranslacyjnych [10].
www.postepybiochemii.pl
Tabela 2. Przykłady białek rekombinowanych produkowanych w P. pastoris
Białko
Botulina
Neurotoksyna tężcowa
Dysmutaza ponadtlenkowa
Lipaza B
Fitaza
Oksydaza heksozowa
Hirudyna
GFP
Apiraza
Aglutynina
α-amylaza
Erytropoetyna
Antytrombina III
Chitynaza
Cystatyna C
Kolagen typu I
Pochodzenie
Clostridium botulinum
Clostridium teteani
Saccharomyces cerevisiae
Candida antarctica
Aspergillus niger
Chondrus crispus
Hirudo medicinalis
Aqueora victoria
Solanum tuberosum
Galanthus nivalis
mysz
szczur
człowiek
człowiek
człowiek
człowiek
Piśmiennictwo
[25]
[25]
[24]
[43]
[44]
[45]
[23]
[32]
[46]
[36]
[37]
[42]
[47]
[48]
[49]
[50]
TRUDNOŚCI ZWIĄZANE Z PRODUKCJĄ BIAŁEK
REKOMBINOWANYCH W P. PASTORIS
Białka rekombinowane wydzielane z komórki mogą ulegać w medium hodowlanym degradacji proteolitycznej w
wyniku aktywności proteaz zewnątrzkomórkowych oraz
uwolnionych w wyniku lizy komórek proteaz wewnątrzkomórkowych. Proteoliza powoduje zmniejszenie wydajności
produkcji białka rekombinowanego z powodu jego degradacji. Może również prowadzić do spadku aktywności wytwarzanego białka w wyniku jego skrócenia [6].
Istnieje kilka metod zmniejszania stopnia proteolizy białka rekombinowanego. Obniżenie temperatury hodowli lub
stosowanie pożywek o pH w zakresie 3,0–6,0 powoduje
spadek aktywności enzymów proteolitycznych [17,39]. Stabilność białka rekombinowanego można również zwiększyć
dodając do pożywki suplementy bogate w aminokwasy
(np. pepton), które pełnią rolę alternatywnych substratów
dla proteaz oraz hamują ich indukcję powodowaną ograniczonym dostępem azotu [6]. W celu zmniejszenia stopnia
proteolizy produkowanego białka stosuje się także szczepy
P. pastoris pozbawione niektórych proteaz. Gen PEP4 koduje wakuolarną proteinazę A, która odpowiedzialna jest
za aktywację innych proteaz wakuolarnych, w tym karboksypeptydazy Y oraz proteinazy B (kodowanej przez gen
PRB1). Mutanty pep4 (szczep SMD1168) wykazują wyraźny spadek lub całkowity brak aktywności proteinazy A i
karboksypeptydazy Y oraz częściową redukcję aktywności
proteinazy B. Mutanty prb1 (szczep SMD1165) nie wykazują aktywności proteinazy B, natomiast mutanty pep4prb1
(szczep SMD1163) charakteryzują się wyraźnym spadkiem
lub brakiem aktywności wszystkich trzech proteaz. Szczepy te są jednak mało żywotne, rosną powoli i trudno się je
transformuje, dlatego też należy je stosować jedynie wtedy,
gdy inne sposoby ograniczenia proteolizy okażą się mało
skuteczne [7,17].
Drożdże, podobnie jak komórki ssacze, przeprowadzają dwa rodzaje glikozylacji białek: N- oraz O-glikozylację.
Może się jednak zdarzyć, że białka będą O-glikozylowane w
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
różnych miejscach, w zależności od organizmu,
w którym są produkowane. Przykładowo, ludzka midkina (czynnik wzrostu wiążący heparynę)
oraz czynnik IGF1 (insulinopodobny czynnik
wzrostu 1) nie są naturalnie glikozylowane, jednak rekombinowane białka uzyskane w P. pastoris podlegały O-glikozylacji [10].
Wysokomannozowy typ N-glikozylacji białek
charakterystyczny dla drożdży powoduje, że produkowane w nich białka rekombinowane wywołują u ludzi odpowiedź immunologiczną. Sposób
glikozylacji wpływa ponadto na okres półtrwania
białka oraz jego potencjał terapeutyczny. Z tego
powodu utrudnione jest zastosowanie białek rekombinowanych produkowanych w P. pastoris
do celów terapeutycznych. Rozwiązaniem tego
problemu jest konstruowanie szczepów P. pastoris przeprowadzających glikozylację w sposób
charakterystyczny dla komórek ssaczych [40-42].
Szczepy takie muszą zostać pozbawione niektórych enzymów, np. α-1,6-mannozylotransferazy,
wprowadza się do nich natomiast geny odpowiedzialne za
glikozylację typu ludzkiego [40]. Stosując szczep P. pastoris
o zmodyfikowanym typie glikozylacji udało się wyprodukować funkcjonalną erytropoetynę szczura. Dalsze prace
nad modyfikacją szlaków glikozylacji P. pastoris mogą w
przyszłości umożliwić wytwarzanie białek terapeutycznych w tym systemie ekspresyjnym zamiast w komórkach
ssaczych, co pozwoli zredukować koszty oraz czas trwania
produkcji, a także wyeliminować zanieczyszczenia wirusowe z preparatów [42].
PODSUMOWANIE
P. pastoris jest obecnie najczęściej używanym gatunkiem
drożdży do produkcji białek rekombinowanych [31]. Za
pomocą tego systemu otrzymuje się białka prokariotyczne, między innymi toksyny bakteryjne wykorzystywane
do wytwarzania szczepionek, a także białka eukariotyczne
[25,32]. W P. pastoris produkuje się również białka błonowe,
ponad połowa wyprodukowanych do tej pory białek błonowych pochodzenia ssaczego została wytworzona przez P.
pastoris lub S. cerevisiae [5].
W tabeli 2 przedstawiono przykłady białek uzyskiwanych w systemie ekspresyjnym P. pastoris. Pełna lista, prowadzona przez laboratorium Jamesa Cregg’a dostępna jest
na stronie internetowej http://www.kgi.edu/documents/
faculty/James_Cregg/heterologous_proteins_expressed_
in_pichia_pastoris.pdf.
PIŚMIENNICTWO
1. Demain AL, Vaishnav P (2009) Production of recombinant proteins by
microbes and higher organisms. Biotechnol Adv 27: 297-306
2. Houdebine L-M (2009) Production of pharmaceutical proteins by
transgenic animals. Comp Immun Microbiol Infect Dis 32: 107-121
3. Nuc P, Nuc K (2006) Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia
coli. Postepy Biochem 52: 448-456
4. Hartner FS, Glieder A (2006) Regulation of methanol utilization pathway genes in yeast. Microb Cell Fact 5: 39-59
319
5. Bawa Z, Bland CE, Bonander N, Bora N, Cartwright SP, Clare M, Conner MT, Darby RAJ, Dilworth MV, Holmes WJ, Jamshad M, Routledge
SJ, Gross SR, Bill RM (2011) Understanding the yeast host cell response
to recombinant membrane protein production. Biochem Soc Trans 39:
719-723
26.Inan M, Meagher MM (2001) The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92: 337-341
6. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM (2005) Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast 22: 249-270
28.Shen S, Sulter G, Jeffries TW, Cregg JM (1998) A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the
yeast Pichia pastoris. Gene 216: 93-102
7. Darby RAJ, Cartwright SP, Dilworth MV, Bill RM (2012) Which yeast
species shall I choose? Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris.
Methods Mol Biol 866: 11-23
8. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000) Recombinant protein
expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16: 23-52
9. Inan M, Meagher MM (2001) Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris. J Biosci Bioeng 92:
585-589
27.Waterham HR, Digan ME, Koutz PJ, Lair SV, Cregg JM (1997) Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
gene and regulation and use of its promoter. Gene 186: 37-44
29.Resina D, Serrano A, Valero F, Ferrer P (2004) Expression of a Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris under control of the nitrogen source-regulated formaldehyde dehydrogenase promoter. J Biotechnol 109:
103-113
30.Sears IB, O’Connor J, Rossanese OW, Glick BS (1998) A versatile set of
vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris. Yeast 14: 783-790
10.Daly R, Hearn MTW (2005) Expression of heterologous proteins in
Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and
production. J Mol Recognit 18: 119-138
31.De Schutter K, Lin Y-C, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Lehmann J, Rouzé P, Van der Peer Y, Callewaert N (2009) Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat
Biotechnol 27: 561-566
11.Samanta S, Basu A, Halder UC, Sen SK (2012) Characterization of
Trichoderma reesei endoglucanase II expressed heterologously in Pichia
pastoris for better biofinishing and biostoning. J Microbiol 50: 518-525
32.Papakonstantinou T, Harris S, Hearn MTW (2009) Expression of GFP
using Pichia pastoris vectors with zeocin or G-418 sulphate as the primary selectable marker. Yeast 26: 311-321
12.Scorer CA, Buckholz RG, Clare JJ, Romanes MA (1997) The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 136: 111-119
33.Nett JH, Hodel N, Raush S, Wildt S (2005) Cloning and disruption of
the Pichia pastoris ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2, HIS5, HIS6 genes
and their use as auxotrophic markers. Yeast 22: 295-304
13.Cereghino GPL, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM (2002) Production of
recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.
Curr Opin Biotechnol 13: 329-332
34.Agaphonov M, Romanova N, Choi E-S, Ter-Avanesyan M (2010) A
novel kanamycin/G418 resistance marker for direct selection of transformants in Escherichia coli and different yeast species. Yeast 27: 189195
14.Cereghino GPL, Cregg JM (1999) Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol
10: 422-427
15.Li P, Anumanthan A, Gao X-G, Ilangovan K, Suzara VV, Düzgüneş N,
Renugopalakrishnan V (2007) Expression of recombinant proteins in
Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142: 105-124
16.Hahn-Hägerdal B, Karhumaa K, Larsson CU, Gorwa-Grauslund M,
Görgens J, van Zyl WH (2005) Role of cultivation media in the development of yeast strains for large scale industrial use. Microb Cell Fact
4: 31-46
17.Cereghino JL, Cregg JM (2000) Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 24: 45-66
18.Cereghino GPL, Sunga AJ, Cereghino JL, Cregg JM (2001) Expression
of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Genet Eng 23: 157-169
19.Sreekrishna K, Brankamp RG, Kropp KE, Blankenship DT, Tsay J-T,
Smith PL, Wierschke JD, Subramaniam A, Birkenberger LA (1997)
Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins
in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Gene 190: 55-62
20.Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, Dragosits M, Rodríguez-Carmona E,
Baumann K, Giuliani M, Parrilli E, Branduardi P, Lang C, Porro D, Ferrer P, Tutino ML, Mattanovich D, Villaverde A (2008) Protein folding
and conformational stress in microbial cells producing recombinant
proteins: a host comparative overview. Microb Cell Fact 7: 11-28
21.Mattanovich D, Gasser B, Hohenblum H, Sauer M (2004) Stress in recombinant protein producing yeasts. J Biotechnol 113: 121-135
22.Cos O, Ramón R, Montesinos JL, Valero F (2006) Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in
the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a
review. Microb Cell Fact 5: 17-36
23.Xiao A, Zhou X, Zhou L, Zhang Y (2006) Improvement of cell viability
and hirudin production by ascorbic acid in Pichia pastoris fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 72: 837-844
24.Li J-R, Yu P (2007) Expression of Cu, Zn-superoxide dismutase gene
from Saccharomyces cerevisiae in Pichia pastoris and its resistance to oxidative stress. Appl Biochem Biotechnol 136: 127-139
25.Gurkan C, Ellar DJ (2005) Recombinant production of bacterial toxins
and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Microb Cell Fact 4: 33-40
320
35.Mattanovich D, Graf A, Stadlmann J, Dragosits M, Redl A, Maurer M,
Kleinheinz M, Sauer M, Altmann F, Gasser B (2009) Genome, secretome and glucose transport highlight unique features of the protein
production host Pichia pastoris. Microb Cell Fact 8: 29-41
36.Raemaekers RJM, de Muro L, Gatehouse JA, Fordham-Skelton AP
(1999) Functional phytohemagglutinin (PHA) and Galanthus nivalis agglutinin (GNA) expressed in Pichia pastoris Correct N-terminal
processing and secretion of heterologous proteins expressed using the
PHA-E signal peptide. Eur J Biochem 265: 394-403
37.Kato S, Ishibashi M, Daisuke T, Tokunaga H, Tokunaga M (2001) Efficient expression, purification and characterization of mouse salivary
α-amylase secreted from methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast
18: 643-655
38.Khasa YP, Conrad S, Sengul M, Plautz S, Meagher MM, Inan M (2011)
Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast 28: 213-226
39.Jahic M, Gustavsson M, Jansen A-K, Martinelle M, Enfors S-O (2003)
Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris
fed-batch processes. J Biotechnol 102: 45-53
40.Choi B-K, Bobrowicz P, Davidson RC, Hamilton SH, Kung DH, Li H,
Miele RG, Nett JH, Wildt S, Gerngross TU (2003) Use of combinatorial
genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia
pastoris. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5022-5027
41.Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B, Davidson RC, Li H, Mitchell
T, Nett JH, Rausch S, Stadheim TA, Wischnewski H, Wildt S, Gerngross TU (2003) Production of complex human glycoproteins in yeast.
Science 301: 1244-1246
42.Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S,
Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi B-K, Hopkins D, Wischnewski
H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J, Wildt S, Gerngross
TU (2006) Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins. Science 313: 1441-1443
43.Rotticci-Mulder JC, Gustavsson M, Holmquist M, Hult K, Martinelle
M (2001) Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and
lipase B fused to a cellulose-binding domain. Protein Expression Purif
21: 386-392
44.Xiong A-S, Yao Q-H, Peng R-H, Han P-L, Cheng Z-M, Li Y (2005) High
level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris. J
Appl Microbiol 98: 418-428
www.postepybiochemii.pl
45.Wolff AM, Hansen OC, Poulsen U, Madrid S, Stougaard P (2001) Optimization of the production of Chondrus crispus hexose oxidase in Pichia
pastoris. Protein Expression Purif 22: 189-199
46.Nourizad N, Ehn M, Gharizadeh B, Hober S, Nyrén P (2003) Methylotrophic yeast Pichia pastoris as a host for production of ATP-diphosphohydrolase (apyrase) from potato tubers (Solanum tuberosum). Protein Expression Purif 27: 229-237
47.Mochizuki S, Hamato N, Hirose M, Miyano K, Ohtani W, Kameyama
S, Kuwae S, Tokuyama T, Ohi H (2001) Expression and characterization of recombinant human antithrombin III in Pichia pastoris. Protein
Expression Purif 23: 55-65
48.Goodrick JC, Xu M, Finnegan R, Schilling BM, Schiavi S, Hoppe H,
Wan NC (2001) High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia
pastoris expression system. Biotechnol Bioeng 74: 492-497
49.Files D, Ogawa M, Scaman CH, Baldwin SA (2001) A Pichia pastoris fermentation process for producing high-levels of recombinant human
cystatin-C. Enzyme Microb Technol 29: 335-340
50.Nokelainen M, Tu H, Vuorela A, Notbohm H, Kivirikko KI, Myllyharju J (2001) High-level production of human type I collagen in the yeast
Pichia pastoris. Yeast 18: 797-806
Pichia pastoris as an expression system for recombinant protein production
Anna Ciarkowska*, Anna Jakubowska
Department of Biochemistry, Nicolaus Copernicus University, 1 Lwowska St., 87-100 Toruń, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: recombinant protein production, expression system, methylotrophic yeast, Pichia pastoris
Abstract
Pichia pastoris has become increasingly popular as a host for recombinant protein production in recent years. P. pastoris is more cost effective and allows achieving higher expression levels than insect and mammalian cells. It also offers some significant advantages over E. coli
expression systems, such as avoiding problems with proper protein folding. Also, P. pastoris as an eukaryotic organism can carry out posttranslational modifications of produced proteins. Additionally, P. pastoris can produce high levels of recombinant proteins in extracellular
medium which simplifies protein purification. Having many advantages over other expression systems makes P. pastoris an organism of
choice for industrial protein production.
Postępy Biochemii 59 (3) 2013
321