„Ilościowa charakterystyka elektrokinetyczna monowarstw białek

„Ilościowa charakterystyka elektrokinetyczna monowarstw białek
globularnych
oraz ich oddziaływań z ligandami jonowymi”
mgr Marta Kujda
promotor: Prof. dr hab. inż. Zbigniew Adamczyk
Streszczenie pracy doktorskiej
Adsorpcja białek jest zjawiskiem powszechnym i niezbędnym do prawidłowego
funkcjonowania zarówno komórek jak i tkanek. Stanowi ważny etap wielu procesów
biologicznych, między innymi w sygnalizacji transbłonowej oraz w procesie krzepnięcia
krwi. Proces ten znalazł też szereg zastosowań, min. jest podstawą prawidłowego
działania biosensorów, testów diagnostycznych, implantów, biomateriałów, czy
bioreaktorów.
Proces adsorpcji białek jest przedstawiany w literaturze jako zjawisko
skomplikowane i wieloetapowe. Związane jest to głównie z brakiem dogłębnej wiedzy
fizykochemicznej na temat tego zjawiska. Wciąż brakuje precyzyjnych informacji o
mechanizmach i oddziaływaniach fizycznych odgrywających główną rolę w procesach
adsorpcji. W literaturze można znaleźć niewiele informacji na temat orientacji,
konformacji oraz właściwościach wiążących zaadsorbowanych białek. Brakuje również
ilościowego opisu teoretycznego zarówno procesu adsorpcji białek na powierzchni
nośników stałych jak i modeli opisujących wiązanie niskocząsteczkowych ligandów do
otrzymanych monowarstw białkowych. Przyczyną tych niedostatków jest głównie brak
precyzyjnych technik pomiarowych w warunkach in situ, systematycznych badań
kinetyki adsorpcji i desorpcji białek z powierzchni oraz brak indywidualnego podejścia
do procesu adsorpcji, uwzględniającego własności użytych białek, takich jak ich rozmiar,
kształt, rozkład ładunku, czy punkt izoelektryczny.
Mając na uwadze powyższe informacje i braki literaturowe, zostały wyznaczone
następujące cele niniejszej pracy:
- ilościowa charakterystyka fizykochemiczna białek globularnych, ze szczególnym
uwzględnieniem zmodyfikowanych oraz nowych syntetycznych form albuminy ludzkiej,
za pomocą wydajnych technik elektrokinetycznych,
- rozwinięcie unikatowych metod elektrokinetycznych, umożliwiających ilościową
charakterystykę fizykochemiczną procesu adsorpcji oraz otrzymanych, stabilnych
monowarstw białek globularnych na powierzchniach ciało stałe / elektrolit,
- opracowanie efektywnej metody elektrokinetycznej pozwalającej na pomiary
oddziaływań monowarstw białek globularnych z niskocząsteczkowymi ligandami
jonowymi.
W ramach prac doświadczalnych dokonano syntezy nowej formy dimeru
albuminy ludzkiej (dHSA). Po raz pierwszy wyznaczono właściwości fizykochemiczne
tego białka takie jak: średnica hydrodynamiczna, potencjał zeta, punkt izoelektryczny
oraz liczba ładunków nieskompensowanych. Podobne badania przeprowadzono również
dla wybranych form albumin ze szczególnym uwzględnieniem jej postaci glikowanej.
Opisano w sposób ilościowy adsorpcję białek na powierzchniach mikrosfer
polistyrenowych oraz na powierzchni miki, ze szczególnym uwzględnieniem kinetyki
tego procesu. Uwagę skupiono głównie na wyznaczeniu wartości pokryć maksymalnych,
oraz ocenie stabilności otrzymanych monowarstw w różnych warunkach pH i siły
jonowej. Do interpretacji wyników doświadczalnych zastosowano dwa modele
teoretyczne: Gouya - Chapmana oraz model elektrokinetyczny 3D.
Istotnym
zagadnieniem
pracy
było
także
rozwinięcie
technik
elektrokinetycznych, ze szczególnym uwzględnieniem pomiarów potencjału przepływu,
jako nowych metod pomiarowych do badań odziaływań w układzie białko – ligand
w warunkach in situ. Opracowana metodyka pomiarowa została efektywnie
wykorzystana do charakterystyki wiązania niskocząsteczkowych ligandów jonowych do
monowarstw białek zaadsorbowanych na powierzchni miki i mikrosfer polistyrenowych.
Wykazano, że połączenie metod elektrokinetycznych z mikroskopią AFM
pozwala efektywnie wyznaczyć podstawowe właściwości fizykochemiczne białek
rekombinowanych (stopień agregacji, rozmiar, kształt, punkt izoelektryczny, liczbę
ładunków nieskompensowanych) przy minimalnym ich zużyciu.
Obszerne wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy doktorskiej umożliwiły
sformułowanie wniosków o istotnym znaczeniu. Wykazano, że oddziaływania
elektrostatyczne odgrywają dominującą rolę w procesie adsorpcji białka. Stosując czułe
techniki elektrokinetyczne pokazano, że prawidłowo przeprowadzona kinetyka adsorpcji
i desorpcji białek pozwala na wyznaczenie pokrycia maksymalnego oraz stabilności
otrzymanych monowarstw. Po raz pierwszy wyznaczono też równowagowe stałe
adsorpcji oraz maksymalne pokrycia ligandów niskocząsteczkowych na monowarstwach
białek.